การวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรี

Q: ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับ การวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรี

โฟลว์ไซโตเมทรี ( FC ) เป็นเทคนิคที่ใช้ในการตรวจจับและวัดลักษณะทางกายภาพและเคมีของกลุ่มเซลล์หรืออนุภาค

Q: ประวัติศาสตร์

อุปกรณ์ตรวจวัดการไหลของเซลล์แบบใช้ อิมพีแดนซ์ เครื่อง แรก ซึ่งใช้ หลักการของ Coulter ได้รับการเปิดเผยในสิทธิบัตรของสหรัฐอเมริกาหมายเลข 2,656,508 ซึ่งออกให้แก่ Wallace H.

การวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรี
	เครื่องตรวจวัดเซลล์ไหล (Flow cytometer) พร้อมท่อฉีดตัวอย่าง
การจำแนกประเภท	ไซโตเมทรี
สารวิเคราะห์	เซลล์หรืออนุภาค
เทคนิคอื่นๆ
ที่เกี่ยวข้อง	เคาน์เตอร์คูลเตอร์

โฟลว์ไซโตเมทรี ( FC ) เป็นเทคนิคที่ใช้ในการตรวจจับและวัดลักษณะทางกายภาพและเคมีของกลุ่มเซลล์หรืออนุภาค^{[ 1 ]}^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}^{[ 4 ]}

ในกระบวนการนี้ ตัวอย่างที่มีเซลล์หรืออนุภาคจะถูกแขวนลอยอยู่ในของเหลวและฉีดเข้าไปใน เครื่องมือ ตรวจวัด การไหลของ เซลล์ ตัวอย่างจะถูกโฟกัสเพื่อให้เซลล์ไหลผ่านลำแสงเลเซอร์ทีละเซลล์ โดยแสงที่กระเจิงจะมีลักษณะเฉพาะของเซลล์และส่วนประกอบของเซลล์ เซลล์มักจะถูกติดฉลากด้วยเครื่องหมายเรืองแสงเพื่อให้แสงถูกดูดซับและปล่อยออกมาในช่วงความยาวคลื่นต่างๆ สามารถตรวจสอบเซลล์ได้หลายหมื่นเซลล์อย่างรวดเร็ว และข้อมูลที่รวบรวมได้จะถูกประมวลผลโดยคอมพิวเตอร์^{[ 5 ]}

การวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ (Flow cytometry) ถูกนำมาใช้เป็นประจำในการวิจัยพื้นฐาน การปฏิบัติทางคลินิก และการทดลองทางคลินิกการใช้งานของการวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ ได้แก่:

การนับเซลล์
การคัดแยกเซลล์
การกำหนดลักษณะและหน้าที่ของเซลล์
การตรวจจับจุลินทรีย์
การตรวจหาไบโอมาร์กเกอร์
การตรวจจับทางวิศวกรรมโปรตีน
การวินิจฉัยโรคต่างๆ เช่นมะเร็งเม็ดเลือด
การวัดขนาดจีโนม

เครื่องวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีเป็นเครื่องมือที่ให้ข้อมูลเชิงปริมาณจากตัวอย่าง เครื่องมืออื่นๆ ที่ใช้โฟลว์ไซโตเมทรี ได้แก่ เครื่องคัดแยกเซลล์ ซึ่งแยกและทำให้เซลล์ที่สนใจบริสุทธิ์โดยอาศัยคุณสมบัติทางแสงของเซลล์เหล่านั้น

ประวัติศาสตร์

อุปกรณ์ตรวจวัดการไหลของเซลล์แบบใช้อิมพีแดนซ์ เครื่อง แรก ซึ่งใช้ หลักการของ Coulterได้รับการเปิดเผยในสิทธิบัตรของสหรัฐอเมริกาหมายเลข 2,656,508 ซึ่งออกให้แก่Wallace H. Coulter ในปี 1953 Mack Fulwyler เป็นผู้ประดิษฐ์ต้นแบบของเครื่องตรวจวัดการไหลของเซลล์ในปัจจุบัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งเครื่องคัดแยกเซลล์^{[ 6 ]} Fulwyler พัฒนาสิ่งนี้ในปี 1965 ด้วยการตีพิมพ์ในวารสารScience [ ^{7 ] อุปกรณ์}ตรวจวัดการไหลของเซลล์แบบใช้ฟลูออเรสเซนซ์เครื่องแรก (ICP 11) ได้รับการพัฒนาในปี 1968 โดย Wolfgang Göhde จากมหาวิทยาลัย Münsterยื่นขอสิทธิบัตรเมื่อวันที่ 18 ธันวาคม 1968 ^{[ 8 ]}และเริ่มวางจำหน่ายเชิงพาณิชย์ครั้งแรกในปี 1968/69 โดยผู้พัฒนาและผู้ผลิตชาวเยอรมัน Partec ผ่านทาง Phywe AG ในGöttingenในขณะนั้น วิธี การดูดซับยังคงเป็นที่นิยมอย่างกว้างขวางในหมู่นักวิทยาศาสตร์คนอื่นๆ มากกว่าวิธีการฟลูออเรสเซนซ์^{[ 9 ]}หลังจากนั้นไม่นาน เครื่องมือวิเคราะห์เซลล์ด้วยการไหล (flow cytometry) ก็ได้รับการพัฒนาขึ้น รวมถึง Cytofluorograph (1971) จาก Bio/Physics Systems Inc. (ต่อมาคือ Ortho Diagnostics), PAS 8000 (1973) จาก Partec, เครื่องมือ FACS (fluorescence-activated cell sorting) เครื่องแรกจากBecton Dickinson (1974), ICP 22 (1975) จาก Partec/Phywe และ Epics จากCoulter (1977/78) เครื่องวิเคราะห์เซลล์ด้วยการไหลแบบอิมพีแดนซ์ความถี่สูงแบบไม่ใช้ฉลากเครื่องแรกที่ใช้ "lab-on-chip" ไมโครฟลูอิดิกที่จดสิทธิบัตรแล้ว Ampha Z30 ได้รับการแนะนำโดย Amphasys (2012)

ชื่อของเทคโนโลยี

ชื่อเดิมของเทคโนโลยีโฟลว์ไซโตเมทรีแบบใช้ฟลูออเรสเซนซ์คือ "พัลส์ไซโตโฟโตเมทรี" ( ภาษาเยอรมัน : Impulszytophotometrie ) โดยอิงจากคำขอสิทธิบัตรฉบับแรกเกี่ยวกับโฟลว์ไซโตเมทรีแบบใช้ฟลูออเรสเซนซ์ ในการประชุม American Engineering Foundation ครั้งที่ 5 ว่าด้วยเซลล์วิทยาอัตโนมัติที่เพนซาโคลา (ฟลอริดา) ในปี 1976 – แปดปีหลังจากการเปิดตัวโฟลว์ไซโตเมทรีแบบใช้ฟลูออเรสเซนซ์เครื่องแรก (1968) – ได้มีการตกลงกันว่าจะใช้ชื่อ "โฟลว์ไซโตเมทรี" ทั่วไป ซึ่งเป็นคำที่ได้รับความนิยมอย่างรวดเร็ว^{[ 10 ]}

เครื่องตรวจวัดเซลล์ไหล

แผนภาพแสดงขั้นตอนการทำงานของเครื่องตรวจวัดเซลล์ด้วยการไหล ตั้งแต่การโฟกัสปลอกหุ้มจนถึงการเก็บข้อมูล

เครื่องตรวจวัดเซลล์ไหลสมัยใหม่สามารถวิเคราะห์อนุภาคได้หลายพันอนุภาคต่อวินาทีใน "เวลาจริง" และหากตั้งค่าเป็นเครื่องคัดแยกเซลล์ ก็สามารถแยกและแยกอนุภาคที่มีคุณสมบัติทางแสงที่กำหนดไว้ได้ในอัตราที่ใกล้เคียงกัน เครื่องตรวจวัดเซลล์ไหลมีความคล้ายคลึงกับกล้องจุลทรรศน์ยกเว้นว่าแทนที่จะสร้างภาพของเซลล์ การตรวจวัดเซลล์ไหลจะให้การวัดปริมาณพารามิเตอร์ทางแสงที่กำหนดไว้โดยอัตโนมัติในอัตราความเร็วสูงในแต่ละเซลล์ เพื่อวิเคราะห์เนื้อเยื่อ แข็ง จะต้องเตรียมสารแขวนลอยของเซลล์เดี่ยวก่อน^{[ 11 ]}

เครื่องตรวจวัดเซลล์ด้วยการไหล (Flow cytometer) ประกอบด้วยส่วนประกอบหลัก 5 ส่วน ได้แก่ เซลล์ไหล (Flow cell), ระบบวัด, ตัวตรวจจับ, ระบบขยายสัญญาณ และคอมพิวเตอร์สำหรับวิเคราะห์สัญญาณ เซลล์ไหลมีกระแสของเหลว (sheath fluid) ซึ่งทำหน้าที่ลำเลียงและจัดเรียงเซลล์ให้ไหลผ่านลำแสงทีละเซลล์เพื่อตรวจวัด ระบบวัดโดยทั่วไปใช้การวัดค่าความต้านทาน (หรือค่าการนำไฟฟ้า) และระบบแสง เช่น หลอดไฟ ( ปรอท , ซีนอน ); เลเซอร์กำลังสูงระบายความร้อนด้วยน้ำ ( อาร์กอน , คริปตอน , เลเซอร์ย้อมสี); เลเซอร์กำลังต่ำระบายความร้อนด้วยอากาศ (อาร์กอน (488 นาโนเมตร), ฮีเลียม-นีออนสีแดง (633 นาโนเมตร), ฮีเลียม-นีออนสีเขียว, ฮีเลียมแคดเมียม (UV)); เลเซอร์ไดโอด (สีน้ำเงิน, สีเขียว, สีแดง, สีม่วง) ซึ่งให้สัญญาณแสง ระบบตรวจจับและแปลงสัญญาณอนาล็อกเป็นดิจิทัล (ADC) จะแปลงค่าการวัดแบบอนาล็อกของแสงที่กระเจิงไปข้างหน้า (FSC) และแสงที่กระเจิงไปด้านข้าง (SSC) รวมถึงสัญญาณเรืองแสงเฉพาะของสีย้อม ให้เป็นสัญญาณดิจิทัลที่คอมพิวเตอร์สามารถประมวลผลได้ ระบบขยายสัญญาณสามารถเป็นแบบเชิงเส้นหรือแบบลอการิทึมก็ได้

กระบวนการเก็บรวบรวมข้อมูลจากตัวอย่างโดยใช้เครื่องตรวจวัดเซลล์ไหล (flow cytometer) เรียกว่า "การเก็บข้อมูล" (acquisition) การเก็บข้อมูลนี้ดำเนินการโดยคอมพิวเตอร์ที่เชื่อมต่อกับเครื่องตรวจวัดเซลล์ไหล และซอฟต์แวร์ที่จัดการอินเทอร์เฟซดิจิทัลกับเครื่องตรวจวัด ซอฟต์แวร์นี้สามารถปรับพารามิเตอร์ (เช่น แรงดันไฟฟ้า การชดเชย) สำหรับตัวอย่างที่กำลังทดสอบ และยังช่วยแสดงข้อมูลตัวอย่างเบื้องต้นในขณะที่เก็บข้อมูลตัวอย่างเพื่อให้แน่ใจว่าได้ตั้งค่าพารามิเตอร์อย่างถูกต้อง เครื่องตรวจวัดเซลล์ไหลรุ่นแรกๆ โดยทั่วไปเป็นอุปกรณ์ทดลอง แต่ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีทำให้สามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้อย่างแพร่หลายในหลากหลายด้านทั้งทางคลินิกและการวิจัย ด้วยเหตุนี้ ตลาดสำหรับเครื่องมือ ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ รวมถึงสารเคมีที่ใช้ในการเก็บข้อมูล เช่นแอนติบอดี ที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง จึงเกิดขึ้น อย่างมาก

เครื่องมือที่ทันสมัยมักจะมีเลเซอร์และตัวตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์หลายตัว สถิติปัจจุบันสำหรับเครื่องมือเชิงพาณิชย์คือเลเซอร์สิบตัว^{[ 12 ]}และตัวตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์ 30 ตัว^{[ 13 ]}การเพิ่มจำนวนเลเซอร์และตัวตรวจจับทำให้สามารถติดฉลากแอนติบอดีได้หลายตัว และสามารถระบุประชากรเป้าหมายได้อย่างแม่นยำยิ่งขึ้นโดยใช้ เครื่องหมาย ฟีโนไทป์เครื่องมือบางชนิดยังสามารถถ่ายภาพดิจิทัลของเซลล์แต่ละเซลล์ ทำให้สามารถวิเคราะห์ตำแหน่งของสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ภายในหรือบนพื้นผิวของเซลล์ได้

ฮาร์ดแวร์

ระบบของเหลวในเครื่องตรวจวัดเซลล์ไหล

เซลล์ต้องผ่านศูนย์กลางของลำแสงเลเซอร์ที่โฟกัสอย่างสม่ำเสมอเพื่อวัดคุณสมบัติทางแสงของเซลล์ได้อย่างแม่นยำในเครื่องวัดการไหลของเซลล์^{[ 14 ]}^{[ 15 ]}^{[ 16 ]}วัตถุประสงค์ของระบบของเหลวคือการเคลื่อนย้ายเซลล์ทีละเซลล์ผ่านลำแสงเลเซอร์และทั่วทั้งเครื่องมือ ระบบของเหลวในเครื่องวัดการไหลของเซลล์ที่มีความสามารถในการคัดแยกเซลล์ยังใช้กระแสเพื่อนำเซลล์ที่คัดแยกแล้วไปยังหลอดหรือหลุมเก็บ^{[ 14 ]}

การโฟกัสแบบไฮโดรไดนามิก

เพื่อการวางตำแหน่งเซลล์อย่างแม่นยำในเจ็ทของเหลว การโฟกัสแบบไฮโดรไดนามิกถูกใช้ในไซโตมิเตอร์ส่วนใหญ่^{[ 14 ]}^{[ 15 ]}เซลล์ที่แขวนลอยจะเข้าสู่เครื่องมือโดยมีของเหลวหุ้มอยู่ด้านนอก แกนตัวอย่างจะถูกรักษาไว้ตรงกลางของของเหลวหุ้ม อัตราการป้อนตัวอย่างหรือความเร็วที่เซลล์ไหลผ่านไปยังการตรวจสอบด้วยเลเซอร์สามารถควบคุมได้โดยความดันของของเหลวหุ้มบนแกนตัวอย่าง ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม กระแสของเหลวตรงกลางและของเหลวหุ้มจะไม่ผสมกัน

การโฟกัสไฮโดรไดนามิกโดยใช้คลื่นเสียงช่วย

เทคโนโลยีการโฟกัสด้วยคลื่นเสียงถูกนำมาใช้ในเครื่องวัดการไหลของเซลล์บางชนิดเพื่อรองรับการโฟกัสด้วยไฮโดรไดนามิก^{[ 14 ]}^{[ 16 ]}คลื่นเสียง (>2 MHz) จะโฟกัสตัวอย่างล่วงหน้าก่อนที่จะนำเข้าสู่ของเหลวหุ้ม ตัวอย่างที่โฟกัสล่วงหน้าแล้วจะถูกฉีดเข้าไปในแกนไฮโดรไดนามิกและไหลผ่านเครื่องมือ ซึ่งอาจช่วยเพิ่มความแม่นยำของข้อมูลภายใต้อัตราการป้อนตัวอย่างที่สูง

ทัศนศาสตร์และอิเล็กทรอนิกส์

ตัวกรองแสง

แสงที่ปล่อยออกมาจากฟลูออโรฟอร์มีช่วงความยาวคลื่นหลายช่วง ดังนั้นการรวมฟลูออโรฟอร์หลายตัวอาจทำให้เกิดการทับซ้อนกัน เพื่อเพิ่มความจำเพาะ จึงใช้ตัวกรองแสงและกระจกไดโครอิก เพื่อกรองและส่งแสงไปยังตัวตรวจจับ เช่น หลอดโฟโตมัลติพลายเออร์ (PMT) หรือโฟโตไดโอดแบบอะวาแลนซ์ (APD) ^{[ 14 ]}ตัวกรองแสงได้รับการออกแบบให้เป็นตัวกรองแบบผ่านย่านความถี่ (BP) แบบผ่านยาว (LP) หรือแบบผ่านสั้น (SP) เครื่องตรวจวัดการไหลของเซลล์ส่วนใหญ่ใช้กระจกไดโครอิกและตัวกรองแบบผ่านย่านความถี่เพื่อเลือกย่านความถี่เฉพาะของสเปกตรัมแสง

ปริซึม, ตะแกรง และการตรวจวัดการไหลของสเปกตรัม

ไซโตเมทรีแบบสเปกตรัมโฟลว์ใช้ปริซึมหรือตะแกรงเลี้ยวเบนเพื่อกระจายแสงที่ปล่อยออกมาจากตัวบ่งชี้ไปทั่วอาร์เรย์ตัวตรวจจับ^{[ 14 ]}^{[ 17 ]}ซึ่งทำให้สามารถวัดสเปกตรัมทั้งหมดจากแต่ละอนุภาคได้ สเปกตรัมที่วัดได้จากเซลล์เดี่ยวจะถูกแยกออกโดยใช้สเปกตรัมอ้างอิงของสีย้อมที่ใช้ทั้งหมดและสเปกตรัมออโตฟลูออเรสเซนซ์ ซึ่งอาจช่วยให้สามารถออกแบบแผงได้กว้างขึ้นและนำตัวบ่งชี้ทางชีวภาพใหม่ๆ มาใช้

การตรวจวัดการไหลของเซลล์ด้วยภาพ

การถ่ายภาพไซโตเมทรีแบบไหล (IFC) สามารถจับภาพเซลล์แบบหลายช่องสัญญาณได้^{[ 14 ]}^{[ 18 ]}ตัวตรวจจับที่ใช้ในแพลตฟอร์มการถ่ายภาพสามารถติดตั้งอุปกรณ์ประจุไฟฟ้าแบบคู่ (CCD) หรือเซมิคอนดักเตอร์โลหะออกไซด์เสริม (CMOS) เพื่อจับภาพเซลล์แต่ละเซลล์

การวิเคราะห์ข้อมูล

ค่าตอบแทน

ฟลูออโรโครมแต่ละชนิดมีสเปกตรัมการเรืองแสงที่กว้าง เมื่อใช้ฟลูออโรโครมมากกว่าหนึ่งชนิด อาจเกิดการทับซ้อนกันระหว่างฟลูออโรโครมได้ สถานการณ์นี้เรียกว่าการทับซ้อนของสเปกตรัม และต้องได้รับการแก้ไข ตัวอย่างเช่น สเปกตรัมการปล่อยแสงของ FITC และ PE เป็นสเปกตรัมที่แสงที่ปล่อยออกมาจากฟลูออเรสซีนทับซ้อนกับความยาวคลื่นเดียวกันเมื่อผ่านตัวกรองที่ใช้สำหรับ PE การทับซ้อนของสเปกตรัมนี้ได้รับการแก้ไขโดยการลบส่วนหนึ่งของสัญญาณ FITC ออกจากสัญญาณ PE หรือในทางกลับกัน กระบวนการนี้เรียกว่าการชดเชยสี ซึ่งคำนวณฟลูออโรโครมเป็นเปอร์เซ็นต์เพื่อวัดตัวเอง^{[ 19 ]}

การชดเชยเป็นกระบวนการทางคณิตศาสตร์ที่ใช้ในการแก้ไขการทับซ้อนของสเปกตรัมของข้อมูลไซโตเมตริกแบบไหลหลายพารามิเตอร์ เนื่องจากฟลูออโรโครมอาจมีสเปกตรัมที่หลากหลาย จึงอาจทับซ้อนกัน ทำให้เกิดความสับสนที่ไม่พึงประสงค์ระหว่างการวิเคราะห์ข้อมูล การทับซ้อนนี้เรียกว่าการรั่วไหลและวัดปริมาณด้วยสัมประสิทธิ์การรั่วไหล ซึ่งมักเกิดจากตัวตรวจจับสำหรับฟลูออโรโครมหนึ่งวัดค่าสูงสุดของความยาวคลื่นจากฟลูออโรโครมอื่น พีชคณิตเชิงเส้นมักใช้ในการแก้ไขนี้^{[ 19 ]}

โดยทั่วไปแล้ว เมื่อแสดงกราฟของพารามิเตอร์หนึ่งตัวหรือมากกว่านั้น ก็เพื่อแสดงให้เห็นว่าพารามิเตอร์อื่นๆ ไม่ได้มีส่วนทำให้เกิดการกระจายตัวที่แสดงอยู่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้พารามิเตอร์ที่มีค่ามากกว่าสองเท่า ปัญหานี้จะรุนแรงมากขึ้น ปัจจุบันยังไม่มีเครื่องมือใดที่สามารถแสดงพารามิเตอร์หลายมิติได้อย่างมีประสิทธิภาพ การชดเชยมีความสำคัญมากในการแยกแยะความแตกต่างระหว่างเซลล์ต่างๆ

เกตติ้ง

ข้อมูลที่สร้างขึ้นโดยโฟลว์ไซโตมิเตอร์สามารถพล็อตในมิติ เดียว เพื่อสร้างฮิสโตแกรมหรือในพล็อตจุดสองมิติ หรือแม้แต่ในสามมิติ บริเวณบนพล็อตเหล่านี้สามารถแยกตามลำดับโดยอาศัยความเข้ม ของฟลูออเรสเซน ซ์ โดยการสร้างชุดของการสกัดย่อยที่เรียกว่า "เกต" มี โปรโตคอล การกำหนดเกตเฉพาะ สำหรับการวินิจฉัยและวัตถุประสงค์ทางคลินิก โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่เกี่ยวข้องกับโลหิตวิทยาเซลล์เดี่ยวแต่ละเซลล์มักจะถูกแยกออกจากเซลล์คู่หรือกลุ่มเซลล์ที่ใหญ่กว่าโดย "เวลาบิน" (เรียกอีกอย่างว่า "ความกว้างของพัลส์") ผ่านลำแสงเลเซอร์ที่โฟกัสอย่างแคบ^{[ 20 ]}

โดยทั่วไปแล้ว กราฟจะถูกสร้างขึ้นบนมาตราส่วนลอการิทึม เนื่องจากสเปกตรัมการปล่อยแสงของสีย้อมเรืองแสงต่าง ๆ ซ้อนทับกัน^{[ 21 ]}^{[ 22 ]}สัญญาณที่ตัวตรวจจับจึงต้องได้รับการชดเชยทางอิเล็กทรอนิกส์และทางคอมพิวเตอร์ ข้อมูลที่สะสมโดยใช้เครื่องตรวจวัดการไหลของเซลล์สามารถวิเคราะห์ได้โดยใช้ซอฟต์แวร์ เมื่อรวบรวมข้อมูลแล้ว ไม่จำเป็นต้องเชื่อมต่อกับเครื่องตรวจวัดการไหลของเซลล์ และการวิเคราะห์มักจะดำเนินการบนคอมพิวเตอร์แยกต่างหากซึ่งจำเป็นอย่างยิ่งในศูนย์บริการหลักที่มีความต้องการใช้งานเครื่องเหล่านี้สูง

การวิเคราะห์เชิงคำนวณ

ความก้าวหน้าล่าสุดในการระบุประชากรโดยอัตโนมัติโดยใช้วิธีการคำนวณได้นำเสนอทางเลือกอื่นแทนกลยุทธ์การคัดกรองแบบดั้งเดิม ระบบการระบุอัตโนมัติอาจช่วยในการค้นหาประชากรที่หายากและซ่อนเร้นได้ วิธีการอัตโนมัติที่เป็นตัวแทน ได้แก่ FLOCK ^{[ 23 ]}ใน Immunology Database and Analysis Portal (ImmPort), ^{[ 24 ]} SamSPECTRAL ^{[ 25 ]}และ flowClust ^{[ 26 ]}^{[ 27 ]}^{[ 28 ]}ในBioconductorและ FLAME ^{[ 29 ]}ในGenePattern T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (tSNE) เป็นอัลกอริทึมที่ออกแบบมาเพื่อลดมิติเพื่อให้สามารถแสดงภาพข้อมูลหลายมิติที่ซับซ้อนใน "แผนที่" สองมิติได้^{[ 30 ]}ความพยายามร่วมกันส่งผลให้เกิดโครงการเปิดที่เรียกว่า FlowCAP (Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods, ^{[ 31 ]} ) เพื่อจัดหาวิธีที่เป็นกลางในการเปรียบเทียบและประเมินวิธีการจัดกลุ่มข้อมูลโฟลว์ไซโตเมตรี และยังเพื่อสร้างแนวทางเกี่ยวกับการใช้งานและการประยุกต์ใช้ที่เหมาะสมของวิธีการเหล่านี้ด้วย

การควบคุม FMO

ตัวควบคุมฟลูออเรสเซนซ์ลบหนึ่ง (FMO) มีความสำคัญต่อการตีความข้อมูลเมื่อสร้างแผงหลายสี ซึ่งเซลล์จะถูกย้อมด้วยฟลูออโรโครมหลายชนิดพร้อมกัน ตัวควบคุม FMO ให้การวัดการรั่วไหลของฟลูออเรสเซนซ์ในช่องสัญญาณที่กำหนดและช่วยในการชดเชย ในการสร้างตัวควบคุม FMO ตัวอย่างจะถูกย้อมด้วยฟลูออโรโครมทั้งหมด ยกเว้นตัวที่กำลังทดสอบ กล่าวคือ หากคุณใช้ฟลูออโรโครม 4 ชนิด ตัวควบคุม FMO ของคุณต้องมีเพียง 3 ชนิดเท่านั้น (ตัวอย่าง: ฟลูออโรโครม – A, B, C, D; FMO – ABC_, AB_D, A_CD, _BCD)

การคัดแยกเซลล์ด้วยเครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ (Flow cytometry)

การคัดแยกเซลล์เป็นวิธีการทำให้ประชากรเซลล์บริสุทธิ์โดยอาศัยการมีอยู่หรือไม่มีอยู่ของลักษณะทางกายภาพที่เฉพาะเจาะจง^{[ 14 ]}^{[ 16 ]}^{[ 32 ]}ในเครื่องวัดการไหลของเซลล์ที่มีความสามารถในการคัดแยก เครื่องมือจะตรวจจับเซลล์โดยใช้พารามิเตอร์ต่างๆ รวมถึงขนาดเซลล์ รูปร่าง และการแสดงออกของโปรตีน จากนั้นใช้เทคโนโลยีหยดเพื่อคัดแยกเซลล์และกู้คืนกลุ่มย่อยเพื่อใช้หลังการทดลอง^{[ 14 ]}^{[ 16 ]}

เครื่องคัดแยกต้นแบบเครื่องแรกถูกสร้างขึ้นที่ห้องปฏิบัติการแห่งชาติลอสอะลามอส (LANL) ในปี 1965 โดยนักฟิสิกส์ Mack J. Fulwyler โดยการนำเซ็นเซอร์ปริมาตร Coulter มาประกอบเข้ากับเครื่องพิมพ์อิงค์เจ็ทที่เพิ่งคิดค้นขึ้นใหม่^{[ 33 ]}เครื่องคัดแยกเซลล์ที่มีชีวิตหรือเครื่องคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นด้วยฟลูออเรสเซนซ์ (FACS) ^{[ a ]} ถูกสร้างขึ้นโดยLen Herzenbergซึ่งต่อมาได้รับรางวัลเกียวโตในปี 2006 จากผลงานสำคัญของเขา^{[ 35 ]}

เครื่องคัดแยกเซลล์ด้วยโฟลว์ไซโตเมทรีมีระบบการเก็บรวบรวมที่แตกต่างจากเครื่องวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรี กระบวนการเก็บรวบรวมเริ่มต้นเมื่อฉีดตัวอย่างเข้าไปในกระแสของของเหลวหุ้มที่ไหลผ่านเซลล์ไหลและเลเซอร์ตัดผ่าน^{[ 36 ]} จากนั้นกระแสจะพาเซลล์ผ่านหัวฉีดที่สั่นซึ่งสร้างหยดน้ำ โดยส่วนใหญ่มีเซลล์เพียงเซลล์เดียวหรือไม่มีเซลล์เลย วงแหวนประจุไฟฟ้าจะถูกวางไว้ตรงจุดที่กระแสแตกออกเป็นหยดน้ำ และประจุจะถูกใส่ลงบนวงแหวนทันทีก่อนที่จะวัดความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ ประจุตรงข้ามจะถูกดักจับบนหยดน้ำเมื่อมันแตกออกจากกระแส และหยดน้ำจึงมีประจุ หยดน้ำที่มีประจุจะตกลงมาผ่าน ระบบ เบี่ยงเบนไฟฟ้าสถิตที่เบี่ยงเบนหยดน้ำไปยังภาชนะตามประจุของมัน ในบางระบบ ประจุจะถูกนำไปใช้กับกระแสโดยตรง และหยดน้ำที่แตกออกจะยังคงมีประจุที่มีเครื่องหมายเดียวกันกับกระแส จากนั้นกระแสจะกลับสู่สภาวะเป็นกลางหลังจากที่หยดน้ำแตกออก หลังจากเก็บรวบรวมแล้ว เซลล์เหล่านี้สามารถนำไปเพาะเลี้ยง จัดการ และศึกษาเพิ่มเติมได้

ป้ายกำกับ

โฟลว์ไซโตเมทรีใช้คุณสมบัติของแสงที่กระเจิงจากเซลล์หรืออนุภาคเพื่อการระบุหรือการวัดเชิงปริมาณของคุณสมบัติทางกายภาพ สามารถใช้ฉลาก สีย้อม และสารย้อมสีสำหรับการวิเคราะห์หลายพารามิเตอร์ (ทำความเข้าใจคุณสมบัติเพิ่มเติมเกี่ยวกับเซลล์) อิมมูโนฟีโนไทป์คือการวิเคราะห์ประชากรเซลล์ที่หลากหลายโดยใช้แอนติบอดี ที่มีฉลาก ^{[ 37 ]}และรีเอเจนต์ที่มีฟลูออโรฟอร์อื่นๆ เช่น สีย้อมและสารย้อมสี

ฉลากเรืองแสง

ฟลูออโรฟอร์หลากหลายชนิดสามารถใช้เป็นฉลากในโฟลว์ไซโตเมทรีได้^{[ 21 ]}ฟลูออโรฟอร์ หรือเรียกง่ายๆ ว่า "ฟลูออร์" มักจะติดอยู่กับแอนติบอดีที่จดจำคุณลักษณะเป้าหมายบนหรือในเซลล์ นอกจากนี้ยังอาจติดอยู่กับเอนทิตีทางเคมีที่มีความสัมพันธ์กับเยื่อหุ้มเซลล์หรือโครงสร้างเซลล์อื่นๆ ฟลูออโรฟอร์แต่ละชนิดมี คลื่นความยาว การกระตุ้นและการปล่อยแสง สูงสุดที่เป็นลักษณะเฉพาะ และสเปกตรัมการปล่อยแสงมักจะทับซ้อนกัน ดังนั้น การรวมกันของฉลากที่สามารถใช้ได้จึงขึ้นอยู่กับความยาวคลื่นของหลอดไฟหรือเลเซอร์ที่ใช้ในการกระตุ้นฟลูออโรโครมและตัวตรวจจับที่มีอยู่^[³⁸^]โฟลว์ไซโตเมทรีใช้การเรืองแสงเป็นเครื่องมือเชิงปริมาณ ความไวสูงสุดของโฟลว์ไซโตเมทรีนั้นไม่มีใครเทียบได้กับแพลตฟอร์มการตรวจจับการเรืองแสงอื่นๆ เช่นกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล โดยทั่วไปความไวต่อการเรืองแสงสัมบูรณ์จะต่ำกว่าในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเนื่องจากสัญญาณที่อยู่นอกโฟกัสจะถูกปฏิเสธโดยระบบออปติคอลคอนโฟคอล และเนื่องจากภาพถูกสร้างขึ้นตามลำดับจากการวัดแต่ละครั้งในแต่ละตำแหน่งทั่วเซลล์ ทำให้มีเวลาในการเก็บรวบรวมสัญญาณน้อยลง^[³⁹^]

จุดควอนตัม

บางครั้งมีการใช้ ควอนตัมดอทแทนสารเรืองแสงแบบดั้งเดิม เนื่องจากมีช่วงการปล่อยแสงที่แคบกว่า

การติดฉลากไอโซโทป

การวิเคราะห์มวลสารไซโตเมทรีเอาชนะข้อจำกัดของการติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์โดยใช้ ไอโซโทป แลนทานัมที่ติดอยู่กับแอนติบอดี วิธีนี้ในทางทฤษฎีแล้วอาจอนุญาตให้ใช้ฉลากที่แยกแยะได้ 40 ถึง 60 ชนิด และได้มีการสาธิตให้เห็นแล้วสำหรับฉลาก 30 ชนิด^{[ 40 ]}การวิเคราะห์มวลสารไซโตเมทรีนั้นแตกต่างจากการวิเคราะห์ไซโตเมทรีแบบไหลอย่างสิ้นเชิง กล่าวคือ เซลล์จะถูกนำเข้าสู่พลาสมาแตกตัวเป็นไอออน และไอโซโทปที่เกี่ยวข้องจะถูกวัดปริมาณผ่านสเปกโทรเมตรีมวลแบบไทม์ออฟไฟลต์ แม้ว่าวิธีนี้จะอนุญาตให้ใช้ฉลากจำนวนมากได้ แต่ปัจจุบันมีกำลังการผลิตต่ำกว่าการวิเคราะห์ไซโตเมทรีแบบไหล นอกจากนี้ยังทำลายเซลล์ที่วิเคราะห์ ทำให้ไม่สามารถกู้คืนได้โดยการคัดแยก^{[ 40 ]}

อาร์เรย์ลูกปัดไซโตเมตริก

นอกเหนือจากความสามารถในการติดฉลากและระบุเซลล์แต่ละเซลล์ผ่านแอนติบอดีเรืองแสงแล้ว ยังสามารถวัดผลิตภัณฑ์ของเซลล์ เช่น ไซโตไคน์ โปรตีน และปัจจัยอื่นๆ ได้อีกด้วย เช่นเดียวกับวิธี การตรวจวิเคราะห์แบบ ELISA sandwich assay วิธีการตรวจวิเคราะห์แบบ cytometric bead array ( CBA ) ใช้ลูกปัดหลายกลุ่มซึ่งโดยทั่วไปจะแตกต่างกันตามขนาดและระดับความเข้มของแสงเรืองแสง เพื่อแยกแยะสารวิเคราะห์หลายชนิดในการทดสอบครั้งเดียว ปริมาณของสารวิเคราะห์ที่ถูกจับจะถูกตรวจจับผ่านแอนติบอดีที่ติดไบโอตินซึ่งต่อต้านอีพิโทปทุติยภูมิของโปรตีน ตามด้วยการบำบัดด้วย streptavidin-R-phycoerythrin ความเข้มของแสงเรืองแสงของ R-phycoerythrin บนลูกปัดจะถูกวัดปริมาณบนเครื่อง flow cytometer ที่ติดตั้งแหล่ง กำเนิดแสงกระตุ้น 488 nm ความเข้มข้นของโปรตีนที่สนใจในตัวอย่างสามารถหาได้โดยการเปรียบเทียบสัญญาณเรืองแสงกับสัญญาณของเส้นโค้งมาตรฐานที่สร้างขึ้นจากการเจือจางแบบอนุกรมของความเข้มข้นที่ทราบของสารวิเคราะห์ โดยทั่วไปเรียกอีกอย่างว่า cytokine bead array (CBA)

การตรวจวัดการไหลของอิมพีแดนซ์

ระบบวิเคราะห์เซลล์เดี่ยวแบบ อิงอิมพีแดนซ์มักเรียกกันว่าเครื่องนับคูลเตอร์ (Coulter counter ) ซึ่งเป็นวิธีการที่ได้รับการยอมรับอย่างดีในการนับและวัดขนาดเซลล์และอนุภาคแทบทุกชนิด เทคโนโลยีแบบไม่ใช้ฉลากนี้ได้รับการพัฒนาขึ้นเมื่อเร็ว ๆ นี้ด้วยวิธีการแบบ " lab-on-a-chip " และโดยการใช้ กระแสสลับ ความถี่สูง (AC) ในช่วงความถี่วิทยุ (ตั้งแต่ 100 kHz ถึง 30 MHz) แทนที่จะใช้กระแสตรงคงที่ (DC) หรือสนามกระแสสลับความถี่ต่ำ^{[ 41 ]}^{[ 42 ]}เทคโนโลยีที่ได้รับการจดสิทธิบัตรนี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์เซลล์ได้อย่างแม่นยำสูงและให้ข้อมูลเพิ่มเติม เช่นความจุของ เยื่อหุ้มเซลล์ และความมีชีวิตขนาดที่ค่อนข้างเล็กและความทนทานทำให้สามารถใช้งานภาคสนามโดยใช้พลังงานจากแบตเตอรี่ได้

พารามิเตอร์ที่วัดได้

ปัจจัยที่วัดได้ในการวิเคราะห์เซลล์และการวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีนั้นครอบคลุมคุณลักษณะและตัวบ่งชี้ที่หลากหลาย ซึ่งให้ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญเกี่ยวกับชีววิทยาและหน้าที่ของเซลล์ เทคนิคฟลูออโรไซโตเมตรีสามารถวัดปริมาณและประเมินปัจจัยเหล่านี้ได้ ทำให้นักวิจัยสามารถตรวจสอบและวิเคราะห์แง่มุมต่างๆ ของเซลล์ได้ ต่อไปนี้คือพารามิเตอร์ที่วัดได้ที่สำคัญบางส่วนที่มักได้รับการตรวจสอบ:

อะพอพโทซิส: สามารถวัดปริมาณอะพอพโทซิสได้โดยใช้เครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ (flow cytometry) โดยการวัดการทำลายดีเอ็นเอ ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรีย การเปลี่ยนแปลงการซึมผ่าน และกิจกรรมของเอนไซม์แคสเปส การวัดเหล่านี้เผยให้เห็นรายละเอียดที่สำคัญเกี่ยวกับการตายของเซลล์ที่วางแผนไว้
การยึดเกาะของเซลล์: สามารถใช้ฟลอว์ไซโตเมทรีในการตรวจสอบการยึดเกาะของเซลล์ เช่น การยึดเกาะระหว่างเซลล์ก่อโรคกับเซลล์เจ้าบ้าน นักวิจัยสามารถวัดปริมาณและวิเคราะห์เหตุการณ์การยึดเกาะของเซลล์ได้โดยใช้เครื่องหมายเฉพาะหรือแท็กเรืองแสง
รงควัตถุในเซลล์: คลอโรฟิลล์และไฟโคเอริทรินเป็นรงควัตถุที่พบในเซลล์บางชนิด การมีอยู่และปริมาณของรงควัตถุเหล่านี้สามารถวัดได้ด้วยเครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ (flow cytometry) ซึ่งให้ข้อมูลเกี่ยวกับกระบวนการเผาผลาญและสภาวะทางสรีรวิทยาของเซลล์
แอนติเจนบนพื้นผิวเซลล์: การวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ไซโตเมทรี (Flow cytometry) มักใช้ในการระบุและวัดปริมาณแอนติเจนบนพื้นผิวเซลล์ หรือที่รู้จักกันในชื่อเครื่องหมายคลัสเตอร์ของการจำแนกความแตกต่าง (Cluster of Differentiation: CD) นักวิจัยสามารถจำแนกประชากรเซลล์ตามการแสดงออกของแอนติเจนบนพื้นผิวโดยการติดฉลากเซลล์ด้วยแอนติบอดีจำเพาะ

ความมีชีวิตของเซลล์: การวิเคราะห์ด้วยโฟลว์ไซโตเมทรีสามารถใช้เป็นการทดสอบความมีชีวิต ของเซลล์ ได้โดยใช้สีย้อมเรืองแสงหรือเครื่องหมายที่แยกแยะระหว่างเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายแล้ว พารามิเตอร์นี้มีความสำคัญในการกำหนดสุขภาพของเซลล์และการตอบสนองต่อการทดลองหรือการรักษา ความมีชีวิตของเซลล์ในการวิเคราะห์ด้วยโฟลว์ไซโตเมทรีควรอยู่ที่ประมาณ 95% แต่ไม่น้อยกว่า 90% ^{[ 43 ]}
เซลล์มะเร็งที่หมุนเวียนในกระแสเลือด: การวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีมีความสำคัญอย่างยิ่งในการแยกและทำให้บริสุทธิ์เซลล์มะเร็งที่หมุนเวียนในกระแสเลือด (CTCs) จากตัวอย่างเลือด สามารถตรวจพบและตรวจสอบ CTCs ได้โดยการกำหนดเป้าหมายไปที่เครื่องหมายหรือลักษณะเฉพาะบางอย่าง ซึ่งช่วยในการวินิจฉัยโรคมะเร็ง การพยากรณ์โรค และการติดตามการรักษา
การระบุลักษณะการดื้อยาหลายชนิด (MDR): การวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ไซโตเมทรี (Flow cytometry) สามารถใช้ในการระบุลักษณะการดื้อยาหลายชนิด (MDR) ในเซลล์มะเร็งได้ โดยการประเมินการไหลออกของสีย้อมเรืองแสงหรือเครื่องหมายเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับกลไกการดื้อยา ความรู้ดังกล่าวช่วยในการทำความเข้าใจและต่อสู้กับการดื้อยาในการรักษามะเร็ง
การวิเคราะห์และคัดแยกโครโมโซม: การวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีสามารถช่วยในการวิเคราะห์และคัดแยกโครโมโซม ทำให้สามารถสร้างคลังข้อมูลและระบุโครโมโซมเฉพาะหรือความผิดปกติของโครโมโซมได้
การเปลี่ยนแปลงจำนวนสำเนา DNA: สามารถวัดการเปลี่ยนแปลงจำนวนสำเนา DNA ได้โดยใช้เทคนิคโฟลว์ไซโตเมทรี เช่น เทคโนโลยี Flow-FISH หรือ BACs-on-Beads เทคโนโลยีเหล่านี้ช่วยให้เข้าใจการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมที่เชื่อมโยงกับโรคต่างๆ เช่น มะเร็งได้ดียิ่งขึ้น
การแสดงออกและการดัดแปลงโปรตีน: การใช้แอนติบอดีหรือโพรบที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง ทำให้สามารถประเมินระดับการแสดงออกของโปรตีนและการเปลี่ยนแปลงต่างๆ เช่น การฟอสโฟรีเลชัน โดยใช้ฟลอว์ไซโตเมทรี พารามิเตอร์นี้ช่วยให้เข้าใจการทำงานของโปรตีนและเครือข่ายการส่งสัญญาณได้ดียิ่งขึ้น
ความลื่นไหลของเยื่อหุ้มเซลล์: การวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ไซโตเมทรีสามารถตรวจวัดความลื่นไหลของเยื่อหุ้มเซลล์ได้โดยใช้สารเรืองแสงที่ไวต่อลักษณะเฉพาะของเยื่อหุ้มเซลล์ พารามิเตอร์นี้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับพลวัตและหน้าที่ของเยื่อหุ้มเซลล์
ปริมาณ DNA และ RNA ทั้งหมด: การวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีสามารถวัดปริมาณ DNA และ RNA ทั้งหมดในเซลล์ได้ ข้อมูลนี้มีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์ การตรวจสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ และการกำหนดการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีน
การตรวจสอบพารามิเตอร์ภายในเซลล์: ปัจจัยภายในเซลล์สามารถวัดได้ด้วยเครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ (flow cytometry) ซึ่งรวมถึงค่า pH ระดับแคลเซียมและแมกนีเซียมไอออนภายในเซลล์ ศักย์ไฟฟ้าของเยื่อหุ้มเซลล์ ระดับกลูตาไธโอน และการเกิดออกซิเดชันอย่างรวดเร็ว ข้อมูลเหล่านี้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับกระบวนการเผาผลาญ การส่งสัญญาณ และความเครียดจากออกซิเดชันของ เซลล์
การกระเจิงของแสง: การวัดการกระเจิงไปข้างหน้า (FSC) และการกระเจิงไปด้านข้าง (SSC) ถูกนำมาใช้ในฟลอว์ไซโตเมทรีเพื่อประเมินปริมาตรของเซลล์และความซับซ้อนทางสัณฐานวิทยาตามลำดับ ตัวชี้วัดเหล่านี้อธิบายถึงขนาด ความละเอียด และรูปร่างของเซลล์
ผลิตภัณฑ์ดัดแปลงพันธุกรรม: การวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีมีประโยชน์ในการประเมินผลิตภัณฑ์ดัดแปลงพันธุกรรมในสิ่งมีชีวิต โดยเฉพาะอย่างยิ่งโปรตีนเรืองแสง เช่น โปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) หรือรูปแบบที่คล้ายคลึงกัน ซึ่งช่วยให้นักวิทยาศาสตร์สามารถตรวจสอบการแสดงออกของยีน ตำแหน่งของโปรตีน และพลวัตของเซลล์ได้
การผสมผสานที่หลากหลาย: โฟลว์ไซโตเมทรีช่วยให้คุณสามารถรวมข้อมูลที่วัดได้หลายอย่าง เช่น DNA/แอนติเจนบนพื้นผิว เพื่อให้ได้ความเข้าใจที่ครอบคลุมเกี่ยวกับคุณสมบัติและฟังก์ชันทางชีวภาพ^{[ 44 ]}

แอปพลิเคชัน

เทคโนโลยีนี้มีการประยุกต์ใช้ในหลายสาขา รวมถึงชีววิทยาระดับโมเลกุลพยาธิวิทยาภูมิคุ้มกันวิทยาไวรัสวิทยา[ ^{45 ] ชีววิทยา}พืชและชีววิทยาทางทะเล^{[ 46 ]}มีการประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางในทางการแพทย์โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการปลูกถ่ายอวัยวะ โลหิตวิทยา ภูมิคุ้มกันวิทยาเนื้องอก และเคมีบำบัด การวินิจฉัยก่อนคลอด พันธุศาสตร์ และการคัดแยกอสุจิเพื่อการเลือกเพศ ล่วงหน้า โฟลว์ไซโตเมทรีถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจจับความผิดปกติของเซลล์อสุจิที่เกี่ยวข้องกับการแตกตัวของ DNA ^{[ 47 ]}ในการทดสอบ ความสามารถในการสืบพันธุ์ ของเพศชาย^{[ 48 ]}นอกจากนี้ยังใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยเพื่อตรวจจับความเสียหายของ DNA [ ⁴⁹^]^[⁵⁰^]การแตกตัวของแคสเปส และอะพอพโทซิส [ ⁵¹^]^โฟ^ลว์ไซโตเมทรีแบบโฟโตอะคูสติกถูกนำมาใช้ในการศึกษาแบคทีเรียที่ดื้อยาหลายชนิด (ส่วนใหญ่คือ MRSA) เพื่อตรวจจับ แยกแยะ และหาปริมาณแบคทีเรียในเลือดที่ทำเครื่องหมายด้วยแบคทีริโอเฟจที่ย้อมสี^[⁵²^]ในด้านประสาทวิทยาศาสตร์ยังสามารถวิเคราะห์การแสดงออกร่วมกันของแอนติเจนบนพื้นผิวเซลล์และภายในเซลล์ได้อีกด้วย^[⁵³^]ในด้านจุลชีววิทยา สามารถใช้เพื่อคัดกรองและจัดเรียงไลบรารีของตัวกลายพันธุ์ทรานสโพซอนที่สร้างขึ้นด้วยทรานสโพซอนที่เข้ารหัส GFP (TnMHA) ^[⁵⁴^]หรือเพื่อประเมินความมีชีวิต^[⁵⁵^]ในด้านวิศวกรรมโปรตีน มีการใช้โฟลว์ไซโตเมทรีร่วมกับการแสดงผลยีสต์และการแสดงผลแบคทีเรียเพื่อระบุตัวแปรโปรตีนที่แสดงบนพื้นผิวเซลล์ที่มีคุณสมบัติที่ต้องการ ข้อดีหลักของโฟลว์ไซโตเมทรีเหนือกว่าฮิสโตโลยีและ IHC คือความเป็นไปได้ในการวัดปริมาณแอนติเจนได้อย่างแม่นยำ และความเป็นไปได้ในการย้อมเซลล์แต่ละเซลล์ด้วยแอนติบอดี-ฟลูออโรฟอร์หลายตัว ในห้องปฏิบัติการปัจจุบันสามารถจับแอนติบอดีได้ประมาณ 10 ตัวต่อเซลล์ ซึ่งน้อยกว่าแมสไซโตมิเตอร์ที่สามารถวัดได้ถึง 40 ตัวในปัจจุบัน แต่มีราคาสูงกว่าและช้ากว่า

การวิจัยทางน้ำ

ในระบบน้ำ การวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ (flow cytometry) ใช้สำหรับการวิเคราะห์เซลล์ที่มีการเรืองแสงเองหรือเซลล์ที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสงที่เติมเข้าไป งานวิจัยนี้เริ่มต้นในปี 1981 เมื่อClarice Yentschใช้เครื่องฟลูออเรสเซนซ์เพื่อวัดการเรืองแสงในไดโนแฟลเจลเลตที่ก่อให้เกิดปรากฏการณ์น้ำแดง^{[ 56 ]}ในปีต่อมา นักวิจัยได้ตีพิมพ์ผลการวัดด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ของสาหร่ายหลายชนิด ซึ่งสามารถแยกแยะได้จากลักษณะการเรืองแสง^{[ 57 ]}ในปี 1983 นักวิจัยทางทะเลได้ประกอบเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ของตนเอง^{[ 58 ]}หรือใช้เครื่องฟลูออเรสเซนซ์ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์กับตัวอย่างน้ำทะเลที่เก็บรวบรวมจากนอกชายฝั่งเบอร์มูดา เพื่อแสดงให้เห็นว่าเซลล์ไฟโตแพลงก์ตอนสามารถแยกแยะได้จากวัสดุที่ไม่มีชีวิต และไซยาโนแบคทีเรียสามารถคัดแยกได้จากชุมชนผสม และนำไปเพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการได้^{[ 59 ]}การตรวจวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรียังช่วยให้นักวิจัยทางทะเลสามารถแยกแยะระหว่างProchlorococcus ที่ เรืองแสงจางๆ กับจุลินทรีย์เฮเทอโรโทรฟิก ซึ่งเป็นการแยกแยะที่ทำได้ยากด้วยการประเมินโดยใช้กล้องจุลทรรศน์^{[ 60 ]}ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีในปัจจุบันทำให้นักวิทยาศาสตร์ทางน้ำสามารถใช้เครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีได้อย่างต่อเนื่องระหว่างการสำรวจวิจัย^{[ 61 ]}และเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีถูกใช้เพื่อสร้างภาพของเซลล์ไฟโตแพลงก์ตอนแต่ละเซลล์^{[ 62 ]}^{[ 63 ]}นักวิทยาศาสตร์ทางทะเลใช้ความสามารถในการคัดแยกของเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีเพื่อทำการวัดกิจกรรมและความหลากหลายของเซลล์อย่างละเอียด^{[ 64 ]}^{[ 65 ]}เพื่อทำการวิจัยเกี่ยวกับความสัมพันธ์แบบพึ่งพาอาศัยกันระหว่างจุลินทรีย์ที่อาศัยอยู่ใกล้กัน^{[ 66 ]}และเพื่อวัดอัตราทางชีวธรณีเคมีของกระบวนการต่างๆ ในมหาสมุทร^{[ 67 ]}

การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์

การเพิ่มจำนวนเซลล์เป็นหน้าที่หลักในระบบภูมิคุ้มกัน บ่อยครั้งที่จำเป็นต้องวิเคราะห์ลักษณะการเพิ่มจำนวนของเซลล์เพื่อสรุปผลบางอย่าง การทดสอบอย่างหนึ่งที่ใช้ในการตรวจสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์คือสีย้อมติดตามคาร์บอกซีฟลูออเรสซีนไดอะซิเตตซัคซินิมิดิลเอสเทอร์ (CFSE) ซึ่งช่วยในการติดตามเซลล์ที่เพิ่มจำนวน การทดสอบนี้ให้ข้อมูลทั้งเชิงปริมาณและเชิงคุณภาพในระหว่างการทดลองแบบอนุกรมเวลา^{[ 68 ]}สีย้อมนี้จะจับกับโมเลกุลที่มีอายุยืนยาวภายในเซลล์ด้วยพันธะโควาเลนต์ เมื่อเซลล์แบ่งตัว โมเลกุลก็จะแบ่งตัวด้วย และเซลล์ลูกจะมีสีย้อมน้อยกว่าเซลล์แม่ครึ่งหนึ่ง การลดลงของความเข้มนี้สามารถมองเห็นได้ด้วยโฟลว์ไซโตเมทรี^{[ 69 ]}ในวรรณกรรม เทคนิคโฟลว์ไซโตเมทรีและ CFSE ที่ทรงพลังนี้ได้ถูกนำมาใช้เพื่อค้นหาประสิทธิภาพของเซลล์ T ในการฆ่าเซลล์เป้าหมายในมะเร็ง เช่น มะเร็งเม็ดเลือดขาว เพื่อให้เห็นภาพการตายของเซลล์เป้าหมาย ทั้งแบบรวดเร็วและแบบช้า นักวิทยาศาสตร์ได้ใช้การติดฉลาก CFSE ร่วมกับการย้อมสีแอนติบอดีของเซลล์บางชนิดและไมโครบีดที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง ซึ่งยังให้ข้อมูลเกี่ยวกับการแพร่กระจายของเซลล์เป้าหมายเมื่อได้รับการรักษาด้วยไซโตไคน์บางชนิด^{[ 70 ]}

การวัดขนาดจีโนม

การวิเคราะห์ ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีถูกนำมาใช้ในการวัดขนาดจีโนมหรือที่แม่นยำกว่านั้นคือ ปริมาณดีเอ็นเอในเซลล์หรือนิวเคลียสแม้ว่าการวิเคราะห์จีโนมด้วยการจัดลำดับจีโนม จะมีความแม่นยำกว่า แต่ก็มักทำได้ยากเนื่องจากมี ไมโครโครโมโซมหรือลำดับซ้ำจำนวนมากซึ่งอาจพลาดไปในการจัดลำดับ (หรือถูกกรองออกในขั้นตอนการวิเคราะห์เมื่อไม่สามารถกำหนดให้กับโครโมโซมได้) อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรีก็ไม่ได้สมบูรณ์แบบเช่นกัน ขนาดจีโนมที่ได้อาจแตกต่างกันไปตามสีย้อมที่ใช้ การวิเคราะห์จีโนมของปลาพบว่าขนาดจีโนมแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญเมื่อใช้โพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) และDAPI ตามลำดับ ตัวอย่างเช่น จีโนมของ ปลาไหลญี่ปุ่น (Anguilla japonica)พบว่ามีดีเอ็นเอ 1.09 พิโคกรัมเมื่อใช้ PI เทียบกับ 1.25 พิโคกรัมเมื่อใช้ DAPI ในทำนองเดียวกัน พบว่าจีโนมของMyxocyprinus asiaticusมี DNA 2.75 pg (PI) เทียบกับ 3.08 pg (DAPI) ซึ่งความแตกต่างอยู่ที่ประมาณ 12–14% ^{[ 71 ]}

ดูเพิ่มเติม

ทิชชูไซโตเมทรี (Tissue Cytometry ) เป็นเทคนิคที่นำแนวคิดของโฟลว์ไซโตเมทรีมาใช้กับชิ้นเนื้อในตำแหน่งเดิมและช่วยในการหาปริมาณของตัวบ่งชี้โดยรักษาบริบทเชิงพื้นที่ไว้
การทดสอบความสัมพันธ์ของแอนเน็กซิน A5ซึ่งเป็นการทดสอบเซลล์ที่กำลังเข้าสู่กระบวนการอะพอพโทซิส มักใช้การวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรี
การวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์
เคาน์เตอร์คูลเตอร์
ไซโตเมทรี
ไดอิเล็กโทรโฟเรซิส
ยูโรโฟลว์
มาตรฐานโฟลว์ไซโตเมทรี
ไซโตเมทรีมวล
ไมโครฟลูออริเมตรี
การทดสอบความมีชีวิต

หมายเหตุ

↑คำย่อ FACS เป็นเครื่องหมายการค้าและเป็นกรรมสิทธิ์ของ BD Biosciences-Immunocytometry Systems ซึ่งเป็นแผนกหนึ่งของ Becton-Dickinson ซึ่งได้รับอนุญาตให้ใช้สิทธิบัตรของ Stanford^{[ 32 ]}^{[ 34 ]}

อ่านเพิ่มเติม

Carey JL, McCoy Jr JP, Keren DF (2007). การตรวจวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ในการวินิจฉัยทางคลินิก ( ฉบับที่ 4). ชิคาโก, อิลลินอยส์: สำนักพิมพ์ American Society for Clinical Pathology (ASCP). ISBN 978-0-89189-548-0.
Darzynkiewicz Z, Roederer M, Tanke HJ, บรรณาธิการ (2004). วิธีการทางชีววิทยาของเซลล์, ไซโตเมตรีเล่มที่ 75 ( ฉบับที่ 4). Elsevier / Academic Press. ISBN 0-12-480283-4.
Darzynkiewicz Z, Robinson JP, Roederer M (2009). วิธีการตรวจวัดเซลล์ที่สำคัญ ( ฉบับพิมพ์ครั้งที่ 1). อัมสเตอร์ดัม: Elsevier/Academic Press. ISBN 978-0-12-375045-7.
Darzynkiewicz Z และ คณะ (บรรณาธิการ) (2011). ความก้าวหน้าล่าสุดในด้านไซโตเมตรี ตอนที่ Aวิธีการทางชีววิทยาของเซลล์ เล่มที่ 102 สำนักพิมพ์ Elsevier/Academic Press ISBN 978-0-12-374912-3.
Darzynkiewicz Z และ คณะ (บรรณาธิการ) (2011). ความก้าวหน้าล่าสุดในด้านไซโตเมตรี ตอนที่ Bวิธีการทางชีววิทยาของเซลล์ เล่มที่ 103 สำนักพิมพ์ Elsevier/Academic Press ISBN 978-0-12-385493-3.
Lloyd D (1993). การวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ในจุลชีววิทยา . ลอนดอน: Springer-Verlag. ISBN 978-3-540-19796-6.
Ormerod MG (1999). Flow cytometry ( ฉบับที่ 2). อ็อกซ์ฟอร์ด สหราชอาณาจักร: Bios Scientific Publishers. ISBN 978-1-85996-107-0.
Ormerod MG, บรรณาธิการ (2000). Flow cytometry: a practical approach ( ฉบับที่ 3). อ็อกซ์ฟอร์ด [อังกฤษ]: สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยอ็อกซ์ฟอร์ด. ISBN 978-0-19-963824-6.
ออร์เมร็อด เอ็มจี (2008) Flow cytometry: การแนะนำเบื้องต้น เรดฮิลล์ : เอ็มจี ออร์เมรอดไอเอสบีเอ็น 978-0-9559812-0-3เก็บถาวรจากต้นฉบับเมื่อ 27 พฤษภาคม 2554 เรียกดูเมื่อ19 พฤษภาคม 2554
Robinson JP และ คณะ (1993). คู่มือวิธีการตรวจวัดเซลล์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์ . นิวยอร์ก: Wiley-Liss. ISBN 978-0-471-59634-9.
Shapiro HM (2003). การวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์แบบปฏิบัติ ( ฉบับที่ 4). นิวยอร์ก: Wiley-Liss. ISBN 978-0-471-41125-3.
Sklar LA (2005). การวิเคราะห์เซลล์ด้วยเครื่องฟลูออเรสเซนซ์สำหรับเทคโนโลยีชีวภาพ . นิวยอร์ก: สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ด. ISBN 978-0-19-515234-0.

ลิงก์ภายนอก

แหล่งข้อมูลห้องสมุดเกี่ยวกับ โฟลว์ไซโตเมทรี

แหล่งข้อมูลในห้องสมุดของคุณ
แหล่งข้อมูลในห้องสมุดอื่นๆ

สื่อที่เกี่ยวข้องกับFlow cytometry ใน Wikimedia Commons
Flow+cytometry ที่ US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)

[35] คำย่อ FACS เป็นเครื่องหมายการค้าและเป็นกรรมสิทธิ์ของ BD Biosciences-Immunocytometry Systems ซึ่งเป็นแผนกหนึ่งของ Becton-Dickinson ซึ่งได้รับอนุญาตให้ใช้สิทธิบัตรของ Stanford^{[ 32 ]}^{[ 34 ]}

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

7 ] อุปกรณ์

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 20 ]

[ 21 ]

[ 22 ]

[ 23 ]

[ 24 ]

[ 25 ]

[ 26 ]

[ 27 ]

[ 28 ]

[ 29 ]

[ 30 ]

[ 31 ]

[ 33 ]

[ a ]

[ 35 ]

[ 36 ]

[ 37 ]

[

[

[ 40 ]

[ 41 ]

[ 42 ]

[ 43 ]

[ 44 ]

45 ] ชีววิทยา

[ 46 ]

[ 47 ]

[ 48 ]

49

[

]

[

[

[

[

[ 56 ]

[ 57 ]

[ 58 ]

[ 59 ]

[ 60 ]

[ 61 ]

[ 62 ]

[ 63 ]

[ 64 ]

[ 65 ]

[ 66 ]

[ 67 ]

[ 68 ]

[ 69 ]

[ 70 ]

[ 71 ]

[ 34 ]