เมตาบาร์โค้ดดิ้งคือการสร้างบาร์โค้ดให้กับดีเอ็นเอ / อาร์เอ็นเอ (หรืออีดีเอ็นเอ / อีอาร์เอ็นเอ ) ในลักษณะที่ช่วยให้สามารถระบุกลุ่มสิ่งมีชีวิตหลายกลุ่ม พร้อมกันได้ ในตัวอย่างเดียวกัน ความแตกต่างหลักระหว่างบาร์โค้ดดิ้งและเมตาบาร์โค้ดดิ้งคือ เมตาบาร์โค้ดดิ้งไม่ได้มุ่งเน้นไปที่สิ่งมีชีวิตชนิดใดชนิดหนึ่งโดยเฉพาะ แต่มีเป้าหมายเพื่อกำหนดองค์ประกอบของชนิดพันธุ์ภายในตัวอย่าง

บาร์โค้ดประกอบด้วย บริเวณ ยีน แปรผันสั้นๆ (ตัวอย่างเช่น ดูเครื่องหมาย/บาร์โค้ดต่างๆ ) ซึ่งมีประโยชน์สำหรับการกำหนดอนุกรมวิธาน โดยมีบริเวณยีนที่อนุรักษ์ไว้สูงขนาบข้าง ซึ่งสามารถใช้ในการออกแบบไพรเมอร์ ได้ ^{[ 1 ]}แนวคิดเรื่องบาร์โค้ดทั่วไปนี้มีต้นกำเนิดในปี 2003 จากนักวิจัยที่มหาวิทยาลัยกเวลฟ์^{[ 2 ]}

กระบวนการเมตาบาร์โค้ดดิ้ง เช่นเดียวกับบาร์โค้ดดิ้งทั่วไป ดำเนินไปตามลำดับขั้นตอน ได้แก่การสกัด DNA การเพิ่มปริมาณด้วย PCRการจัดลำดับและการวิเคราะห์ข้อมูลยีนที่ใช้จะแตกต่างกันไป ขึ้นอยู่กับว่าเป้าหมายคือการทำบาร์โค้ดดิ้งเฉพาะสายพันธุ์เดียว หรือเมตาบาร์โค้ดดิ้งหลายสายพันธุ์ ในกรณีหลัง จะใช้ยีนที่ครอบคลุมมากกว่า เมตาบาร์โค้ดดิ้งไม่ได้ใช้ DNA/RNA จากสายพันธุ์เดียวเป็นจุดเริ่มต้น แต่ใช้ DNA/RNA จากสิ่งมีชีวิตหลายชนิดที่ได้จากตัวอย่างสิ่งแวดล้อมหรือตัวอย่างรวมเดียวกัน

ดีเอ็นเอสิ่งแวดล้อมหรือ eDNA หมายถึงสารพันธุกรรมที่มีอยู่ในตัวอย่างสิ่งแวดล้อม เช่น ตะกอน น้ำ และอากาศ ซึ่งรวมถึงเซลล์ทั้งหมดดีเอ็นเอภายนอกเซลล์และอาจรวมถึงสิ่งมีชีวิตทั้งหมดด้วย^{[ 3 ] [ 4 ]}สามารถเก็บ eDNA จากตัวอย่างสิ่งแวดล้อมและเก็บรักษาสกัดขยายจัดลำดับและจำแนกประเภทตามลำดับได้^{[ 5 ]}จากข้อมูลนี้ สามารถตรวจจับและจำแนกชนิดของสิ่งมีชีวิตได้ eDNA อาจมาจากผิวหนัง เมือก น้ำลาย อสุจิ สารคัดหลั่ง ไข่ อุจจาระ ปัสสาวะ เลือด ราก ใบ ผลไม้ ละอองเกสร และซากเน่าเปื่อยของสิ่งมีชีวิตขนาดใหญ่ ในขณะที่จุลินทรีย์อาจได้รับมาทั้งตัว^{[ 6 ] [ 7 ] [ 4 ]}การผลิต eDNA ขึ้นอยู่กับชีวมวลอายุ และกิจกรรมการกินอาหารของสิ่งมีชีวิต รวมถึงสรีรวิทยา ประวัติชีวิต และการใช้พื้นที่^{[ 4 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]}

ภายในปี 2019 วิธีการวิจัย eDNA ได้ขยายขอบเขตออกไปเพื่อให้สามารถประเมินชุมชนทั้งหมดจากตัวอย่างเดียวได้ กระบวนการนี้เกี่ยวข้องกับเมตาบาร์โค้ดดิ้ง ซึ่งสามารถกำหนดได้อย่างแม่นยำว่าเป็นการใช้ไพรเมอร์ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ทั่วไปหรือสากล กับตัวอย่าง DNA ผสมจากแหล่งกำเนิดใดๆ ตามด้วยการจัดลำดับรุ่นต่อไปที่มีความเร็วสูง (NGS) เพื่อกำหนดองค์ประกอบของสปีชีส์ในตัวอย่าง วิธีนี้เป็นที่นิยมในจุลชีววิทยามานานหลายปีแล้ว แต่ ณ ปี 2020 เพิ่งจะเริ่มนำมาใช้ในการประเมินสิ่งมีชีวิตขนาด ใหญ่ ^{[ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]}การประยุกต์ใช้เมตาบาร์โค้ดดิ้ง eDNA ในระบบนิเวศโดยรวมมีศักยภาพไม่เพียงแต่จะอธิบายชุมชนและความหลากหลายทางชีวภาพเท่านั้น แต่ยังสามารถตรวจจับปฏิสัมพันธ์และนิเวศวิทยาเชิงหน้าที่ในระดับพื้นที่ขนาดใหญ่ได้ แม้ว่าอาจมีข้อจำกัดจากการอ่านค่าผิดพลาดเนื่องจากการปนเปื้อนหรือข้อผิดพลาดอื่นๆ^{[ 7 ] [ 14 ] [ 12 ] [ 9 ]}โดยรวมแล้ว eDNA metabarcoding ช่วยเพิ่มความเร็ว ความแม่นยำ และการระบุตัวตนได้ดีกว่า barcoding แบบดั้งเดิม และลดต้นทุน แต่จำเป็นต้องมีการกำหนดมาตรฐานและรวมเข้าด้วยกัน โดยบูรณาการอนุกรมวิธานและวิธีการทางโมเลกุลสำหรับการศึกษาเชิงนิเวศวิทยาอย่างเต็มรูปแบบ^{[ 11 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 9 ] [ 10 ]}

eDNA metabarcoding มีการประยุกต์ใช้ในการตรวจสอบความหลากหลายทางชีวภาพในทุกแหล่งที่อยู่อาศัยและกลุ่มอนุกรมวิธาน การสร้างระบบนิเวศโบราณขึ้นใหม่ ปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชและแมลงผสมเกสร การวิเคราะห์อาหาร การตรวจจับชนิดพันธุ์รุกราน การตอบสนองต่อมลพิษ และการตรวจสอบคุณภาพอากาศ eDNA metabarcoding เป็นวิธีการเฉพาะที่ยังอยู่ระหว่างการพัฒนาและน่าจะยังคงมีการเปลี่ยนแปลงต่อไปอีกระยะหนึ่งเนื่องจากเทคโนโลยีมีความก้าวหน้าและขั้นตอนต่างๆ ได้รับการกำหนดมาตรฐาน อย่างไรก็ตาม เมื่อ metabarcoding ได้รับการปรับปรุงให้เหมาะสมและมีการใช้งานอย่างแพร่หลายมากขึ้น ก็มีแนวโน้มที่จะกลายเป็นเครื่องมือสำคัญสำหรับการตรวจสอบทางนิเวศวิทยาและการศึกษาการอนุรักษ์ระดับโลก^{[ 10 ]}

นับตั้งแต่เริ่มมีการใช้การจัดลำดับจีโนมความเร็วสูง ( HTS ) ^{[ 19 ]}การใช้เมตาบาร์โค้ดดิ้งเป็นเครื่องมือตรวจจับความหลากหลายทางชีวภาพได้รับความสนใจอย่างมาก^{[ 12 ] [ 20 ]}อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีความชัดเจนเกี่ยวกับวัสดุต้นทางที่ใช้ในการวิเคราะห์เมตาบาร์โค้ดดิ้ง (เช่น ดีเอ็นเอสิ่งแวดล้อมเทียบกับดีเอ็นเอชุมชน ) หากไม่มีความชัดเจนระหว่างวัสดุต้นทางทั้งสองนี้ ความแตกต่างในการสุ่มตัวอย่าง รวมถึงความแตกต่างในขั้นตอนการทดลองในห้องปฏิบัติการ อาจส่งผลกระทบต่อกระบวนการทางชีวสารสนเทศที่ใช้ในการประมวลผลข้อมูลในภายหลัง และทำให้การตีความรูปแบบความหลากหลายทางชีวภาพเชิงพื้นที่และเวลาซับซ้อนขึ้น ในที่นี้ เราพยายามที่จะแยกแยะความแตกต่างระหว่างวัสดุต้นทางที่ใช้กันอย่างแพร่หลายและผลกระทบต่อการวิเคราะห์และการตีความในขั้นตอนต่อไปสำหรับเมตาบาร์โค้ดดิ้งดีเอ็นเอสิ่งแวดล้อมของสัตว์และพืช เมื่อเทียบกับเมตาบาร์โค้ดดิ้งดีเอ็นเอชุมชน^{[ 13 ]}

ในการทำเมตาบาร์โค้ดดีเอ็นเอของชุมชนของสัตว์และพืช กลุ่มเป้าหมายมักจะถูกเก็บรวบรวมในปริมาณมาก (เช่น ดิน กับดักแมลงหรือตาข่าย) และแต่ละตัวอย่างจะถูกแยกออกจากเศษตัวอย่างอื่นๆ และรวมเข้าด้วยกันก่อนที่จะทำการสกัดดีเอ็นเอในปริมาณมาก^{[ 12 ]}ในทางตรงกันข้าม ดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตขนาดใหญ่จะถูกแยกโดยตรงจากวัสดุสิ่งแวดล้อม (เช่น ดินหรือน้ำ) โดยไม่ต้องแยกสิ่งมีชีวิตหรือวัสดุพืชแต่ละชนิดออกจากตัวอย่างก่อน และถือว่าสิ่งมีชีวิตทั้งหมดไม่ได้อยู่ในตัวอย่างนั้น แน่นอนว่าตัวอย่างดีเอ็นเอของชุมชนอาจมีดีเอ็นเอจากส่วนต่างๆ ของเนื้อเยื่อ เซลล์ และออร์แกเนลล์ของสิ่งมีชีวิตอื่นๆ (เช่น เนื้อหาในลำไส้ ดีเอ็นเอภายในเซลล์หรือภายนอกเซลล์ของผิวหนัง) ในทำนองเดียวกัน ตัวอย่างดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตขนาดใหญ่อาจจับสิ่งมีชีวิตขนาดเล็กที่ไม่ใช่เป้าหมายโดยไม่ได้ตั้งใจ (เช่น โปรติสต์ แบคทีเรีย) ดังนั้น ความแตกต่างจึงอาจลดลงอย่างน้อยบางส่วนในทางปฏิบัติ^{[ 13 ]}

ความแตกต่างที่สำคัญอีกประการหนึ่งระหว่าง DNA ของชุมชนและ eDNA ของสิ่งมีชีวิตขนาดใหญ่คือ ลำดับที่สร้างจาก metabarcoding ของ DNA ชุมชนสามารถตรวจสอบทางอนุกรมวิธานได้เมื่อตัวอย่างไม่ถูกทำลายในกระบวนการสกัด ในกรณีนี้ ลำดับสามารถสร้างขึ้นจากตัวอย่างอ้างอิงโดยใช้การจัดลำดับแบบ Sanger เนื่องจากตัวอย่างสำหรับ metabarcoding ของ eDNA ขาดสิ่งมีชีวิตทั้งหมด จึงไม่สามารถทำการเปรียบเทียบในสถานที่ได้ ดังนั้น ความสัมพันธ์ทางอนุกรมวิธานจึงสามารถสร้างขึ้นได้โดยการเปรียบเทียบลำดับที่ได้รับโดยตรง (หรือผ่านหน่วยอนุกรมวิธานปฏิบัติการ (MOTU) ที่สร้างขึ้นทางชีวสารสนเทศ) กับลำดับที่มีคำอธิบายประกอบทางอนุกรมวิธาน เช่น ฐานข้อมูลนิวคลีโอไทด์ GenBank ของ NCBI ^{[ 21 ] BOLD [ 22 ] หรือกับฐาน}ข้อมูลอ้างอิง^{ที่สร้าง}ขึ้นเองจาก DNA ที่จัดลำดับแบบ Sanger ^{[ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]} ( หน่วยอนุกรมวิธานปฏิบัติการ ระดับโมเลกุล (MOTU) คือกลุ่มที่ระบุโดยใช้อัลกอริทึมคลัสเตอร์และความคล้ายคลึงของลำดับเปอร์เซ็นต์ที่กำหนดไว้ล่วงหน้า เช่น 97%)) ^{[ 26 ] [ 13 ]}จากนั้น เพื่อยืนยันรายการอนุกรมวิธานที่ได้มาอย่างน้อยบางส่วน จะมีการเปรียบเทียบกับวิธีการสำรวจทางกายภาพ เสียง หรือภาพแบบดั้งเดิมที่ดำเนินการในเวลาเดียวกัน หรือเปรียบเทียบกับบันทึกทางประวัติศาสตร์จากการสำรวจสำหรับสถานที่นั้น ๆ (ดูตารางที่ 1) ^{[ 13 ]}

ความแตกต่างของวัสดุต้นทางระหว่าง DNA ของชุมชนและ eDNA จึงส่งผลกระทบที่แตกต่างกันต่อการตีความขนาดของการอนุมานสำหรับเวลาและพื้นที่เกี่ยวกับความหลากหลายทางชีวภาพที่ตรวจพบ จาก DNA ของชุมชน เป็นที่ชัดเจนว่าพบแต่ละชนิดในเวลาและสถานที่นั้น แต่สำหรับ eDNA สิ่งมีชีวิตที่สร้าง DNA อาจอยู่เหนือตำแหน่งที่เก็บตัวอย่าง^{[ 27 ]}หรือ DNA อาจถูกขนส่งมาในอุจจาระของสัตว์นักล่าที่มีการเคลื่อนที่มากกว่า (เช่น นกที่ทิ้ง eDNA ของปลา^{[ 28 ])}หรือเคยมีอยู่ก่อนหน้านี้ แต่ไม่ได้ใช้งานในชุมชนอีกต่อไป และการตรวจพบมาจาก DNA ที่ถูกปล่อยออกมาหลายปีหรือหลายทศวรรษก่อน^{[ 29 ]}อย่างหลังหมายความว่าขนาดของการอนุมานทั้งในพื้นที่และเวลาจะต้องได้รับการพิจารณาอย่างรอบคอบเมื่ออนุมานการมีอยู่ของชนิดในชุมชนโดยอาศัย eDNA ^{[ 13 ]}

การทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอและเมตาบาร์โค้ดมีทั้งหมดหกขั้นตอนหรือหกระยะ การทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอของสัตว์ (โดยเฉพาะค้างคาว ) ถูกนำมาใช้เป็นตัวอย่างในแผนภาพด้านขวาและในการอธิบายด้านล่างนี้

ขั้นแรก จะเลือกบริเวณบาร์โค้ดดีเอ็นเอที่เหมาะสมเพื่อตอบคำถามวิจัยเฉพาะบางข้อ บริเวณบาร์โค้ดดีเอ็นเอที่ใช้กันทั่วไปสำหรับสัตว์คือส่วนของยีนไมโท คอนเดรีย ไซโตโครมออกซิเดส I (CO1) ที่มี ความยาว ประมาณ 600 คู่เบส^{[ 2 ]}ตำแหน่งนี้ให้ความแปรผันของลำดับระหว่างสายพันธุ์สูง แต่มีความแปรผันภายในสายพันธุ์ค่อนข้างน้อย^{[ 31 ]}บริเวณบาร์โค้ดอื่นๆ ที่ใช้กันทั่วไปสำหรับการระบุสายพันธุ์ของสัตว์ ได้แก่ บริเวณ ดีเอ็นเอไรโบโซม (rDNA) เช่น16S , 18Sและ12Sและบริเวณไมโทคอนเดรีย เช่นไซโตโครม B [ ^{32 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] เครื่องหมาย}เหล่านี้มีข้อดีและข้อเสีย และใช้เพื่อวัตถุประสงค์ที่แตกต่างกัน^{[ 36 ] [ 37 ]}บริเวณบาร์โค้ดที่ยาวกว่า (อย่างน้อย 600 คู่เบส) มักจำเป็นสำหรับการจำแนกสายพันธุ์ที่แม่นยำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างญาติใกล้ชิด การระบุผู้ผลิตซากสิ่งมีชีวิต เช่น อุจจาระ ขน และน้ำลาย สามารถใช้เป็นตัวชี้วัดเพื่อตรวจสอบการมีอยู่/ไม่มีอยู่ของสายพันธุ์ในระบบนิเวศได้ โดยปกติแล้ว DNA ในซากเหล่านี้มีคุณภาพและปริมาณต่ำ ดังนั้นจึงใช้บาร์โค้ดที่สั้นกว่าประมาณ 100 คู่เบสในกรณีเหล่านี้ ในทำนองเดียวกัน ซาก DNA ในมูลสัตว์มักจะเสื่อมสภาพเช่นกัน ดังนั้นจึงจำเป็นต้องใช้บาร์โค้ดที่สั้นกว่าเพื่อระบุเหยื่อที่ถูกกิน^{[ 30 ]}

ประการที่สอง จำเป็นต้องสร้างฐานข้อมูลอ้างอิงของบาร์โค้ด DNA ทั้งหมดที่อาจพบได้ในการศึกษา โดยในอุดมคติแล้ว บาร์โค้ดเหล่านี้ควรสร้างขึ้นจากตัวอย่างที่เก็บรักษาไว้ในสถานที่ที่ประชาชนสามารถเข้าถึงได้ เช่น พิพิธภัณฑ์ประวัติศาสตร์ธรรมชาติหรือสถาบันวิจัยอื่น ๆ^{[ 30 ]}ปัจจุบันมีการดำเนินการสร้างฐานข้อมูลอ้างอิงดังกล่าวทั่วโลก องค์กรพันธมิตรร่วมมือกันในโครงการระหว่างประเทศ เช่นโครงการบาร์โค้ดแห่งชีวิตระหว่างประเทศ (iBOL) และกลุ่มความร่วมมือเพื่อบาร์โค้ดแห่งชีวิต (CBOL) โดยมีเป้าหมายเพื่อสร้างฐานข้อมูลอ้างอิงบาร์โค้ด DNA ซึ่งจะเป็นพื้นฐานสำหรับการระบุ ชีวนิเวศของโลกโดยใช้ DNA คลังบาร์โค้ดที่เป็นที่รู้จักกันดี ได้แก่NCBI GenBankและระบบข้อมูลบาร์โค้ดแห่งชีวิต (BOLD) ^{[ 30 ]}

ประการที่สาม เซลล์ที่มี DNA ที่สนใจจะต้องถูกเปิดออกเพื่อเปิดเผย DNA ขั้นตอนนี้การสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ ของ DNA ควรดำเนินการจากสารตั้งต้นที่กำลังตรวจสอบ มีขั้นตอนหลายอย่างที่ใช้ได้สำหรับเรื่องนี้^{[ 38 ]}ต้องเลือกเทคนิคเฉพาะเพื่อแยก DNA จากสารตั้งต้นที่มี DNA ที่เสื่อมสภาพบางส่วน เช่น ตัวอย่างฟอสซิล และตัวอย่างที่มีสารยับยั้ง เช่น เลือด อุจจาระ และดิน การสกัดที่คาดว่าจะได้ผลผลิตหรือคุณภาพของ DNA ต่ำ ควรดำเนินการในสถาน ที่ผลิต DNA โบราณพร้อมกับโปรโตคอลที่กำหนดไว้เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนกับ DNA สมัยใหม่^{[ 39 ] [ 40 ]}การทดลองควรทำซ้ำสองครั้งเสมอ ^{[ 41 ]}และรวมถึงตัวควบคุมเชิงบวกด้วย^{[ 30 ]}

ประการที่สี่แอมพลิคอนจะต้องถูกสร้างขึ้นจาก DNA ที่สกัดออกมา ไม่ว่าจะจากตัวอย่างเดียวหรือจากส่วนผสมที่ซับซ้อนโดยใช้ไพรเมอร์ตามบาร์โค้ด DNA ที่เลือกภายใต้ขั้นตอนที่ 1 เพื่อติดตามแหล่งที่มา จำเป็นต้องเพิ่ม นิวคลีโอไทด์ ที่มีฉลาก (รหัสโมเลกุลหรือฉลาก MID) ในกรณีของเมตาบาร์โค้ดดิ้ง ฉลากเหล่านี้จำเป็นในภายหลังในการวิเคราะห์เพื่อติดตามการอ่านจากชุดข้อมูลจำนวนมากกลับไปยังแหล่งที่มา^{[ 30 ]}

ประการที่ห้า ควรเลือกเทคนิคที่เหมาะสมสำหรับการจัดลำดับดีเอ็นเอวิธีการยุติสายโซ่แบบคลาสสิก ของแซงเกอร์ อาศัยการรวมตัวของสารยับยั้งการยืดสายโซ่ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรสในระหว่างการจำลองดีเอ็นเอเบสทั้งสี่นี้จะถูกแยกตามขนาดโดยใช้อิเล็กโทรโฟเรซิสและระบุในภายหลังโดยการตรวจจับด้วยเลเซอร์ วิธีการของแซงเกอร์มีข้อจำกัดและสามารถสร้างการอ่านได้ครั้งละหนึ่งรายการเท่านั้น ดังนั้นจึงเหมาะสำหรับการสร้างบาร์โค้ดดีเอ็นเอจากสารตั้งต้นที่มีเพียงชนิดเดียว^{[ 30 ]}เทคโนโลยีที่เกิดขึ้นใหม่ เช่นการจัดลำดับนาโนพอเรส่งผลให้ต้นทุนการจัดลำดับดีเอ็นเอลดลงจากประมาณ 30,000 ดอลลาร์สหรัฐต่อเมกะไบต์ในปี 2545 เหลือประมาณ 0.60 ดอลลาร์สหรัฐในปี 2559 ^{[ 43 ] [ 44 ]} เทคโนโลยี การจัดลำดับรุ่นใหม่(NGS) สามารถจัดการกับการอ่านหลายพันถึงหลายล้านรายการพร้อมกันได้ ดังนั้นจึงเหมาะสำหรับการระบุจำนวนมากของส่วนผสมของสายพันธุ์ต่างๆ ที่มีอยู่ในสารตั้งต้น ซึ่งสรุปได้ว่าเป็นเมตาบาร์โค้ดดิ้ง^{[ 30 ]}

สุดท้ายนี้จำเป็นต้องดำเนินการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศ เพื่อ จับคู่บาร์โค้ด DNAที่ได้รับกับหมายเลขดัชนีบาร์โค้ด (BIN) ในไลบรารีอ้างอิง^{[ 45 ]}แต่ละ BIN หรือคลัสเตอร์ BIN สามารถระบุได้ถึงระดับสปีชีส์เมื่อแสดงความสอดคล้องสูง (>97%) กับบาร์โค้ด DNA ที่เชื่อมโยงกับสปีชีส์ที่มีอยู่ในไลบรารีอ้างอิง หรือเมื่อการระบุทางอนุกรมวิธานถึงระดับสปีชีส์ยังขาดอยู่ จะใช้หน่วยอนุกรมวิธานปฏิบัติการ (OTU) ซึ่งหมายถึงกลุ่มของสปีชีส์ (เช่น สกุล วงศ์ หรือลำดับชั้นทางอนุกรมวิธาน ที่สูงกว่า ) ^{[ 30 ]} (ดูการจัดกลุ่ม (เมตาจีโนมิกส์) ) ผลลัพธ์ของไปป์ไลน์ชีวสารสนเทศจะต้องถูกตัดแต่ง เช่น โดยการกรองซิงเกิลตันที่ไม่น่าเชื่อถือ สำเนาที่ซ้ำซ้อน ข้อมูลการอ่านคุณภาพต่ำ และ/หรือข้อมูลการอ่านแบบไคเมอริกโดยทั่วไปจะทำได้โดยการค้นหา BLAST แบบอนุกรม ร่วมกับการกรองอัตโนมัติและสคริปต์การตัดแต่ง^{[ 46 ]}จำเป็นต้องมีเกณฑ์มาตรฐานเพื่อแยกแยะระหว่างสายพันธุ์ต่างๆ หรือการระบุที่ถูกต้องและไม่ถูกต้อง^{[ 30 ]}

แม้ว่าวิธีการนี้จะมีประสิทธิภาพอย่างเห็นได้ชัด แต่การทำเมตาบาร์โค้ดดิ้ง eDNA ก็ได้รับผลกระทบจากความท้าทายด้านความแม่นยำและความถูกต้องที่กระจายอยู่ทั่วเวิร์กโฟลว์ในภาคสนาม ในห้องปฏิบัติการ และที่แป้นพิมพ์^{[ 47 ]}ดังที่แสดงไว้ในแผนภาพทางด้านขวา หลังจากการออกแบบการศึกษาเบื้องต้น (สมมติฐาน/คำถาม กลุ่มอนุกรมวิธานเป้าหมาย ฯลฯ) เวิร์กโฟลว์ eDNA ในปัจจุบันประกอบด้วยสามส่วน ได้แก่ ภาคสนาม ห้องปฏิบัติการ และชีวสารสนเทศ^{[ 13 ]}ส่วนภาคสนามประกอบด้วยการเก็บตัวอย่าง (เช่น น้ำ ตะกอน อากาศ) ที่ได้รับการเก็บรักษาหรือแช่แข็งก่อนการสกัด DNA ส่วนประกอบในห้องปฏิบัติการมีขั้นตอนพื้นฐานสี่ขั้นตอน: (i) การทำให้ DNA เข้มข้น (หากไม่ได้ดำเนินการในภาคสนาม) และทำให้บริสุทธิ์ (ii) การใช้ PCRเพื่อขยายยีนหรือบริเวณเป้าหมาย (iii) การรวมลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ซ้ำกันที่เรียกว่า "ดัชนี" (เรียกอีกอย่างว่า "บาร์โค้ด") โดยใช้ PCR หรือเชื่อมต่อ (ผูก) เข้ากับผลิตภัณฑ์ PCR ที่แตกต่างกัน ทำให้เกิด "ไลบรารี" ซึ่งสามารถรวมตัวอย่างหลายตัวอย่างเข้าด้วยกันได้ และ (iv) จากนั้นไลบรารีที่รวมกันจะถูกจัดลำดับบนเครื่องที่มีประสิทธิภาพสูงขั้นตอนสุดท้ายหลังจากการประมวลผลตัวอย่างในห้องปฏิบัติการคือการประมวลผลไฟล์เอาต์พุตจากเครื่องจัดลำดับโดยใช้ไปป์ไลน์ชีวสารสนเทศที่แข็งแกร่ง^{[ 13 ]}

วิธีการนี้กำหนดให้ต้องจัดเก็บดีเอ็นเอที่เก็บรวบรวมได้แต่ละตัวอย่างไว้พร้อมกับ "ตัวอย่างต้นแบบ" ที่เกี่ยวข้อง (หนึ่งตัวอย่างสำหรับแต่ละกลุ่มอนุกรมวิธาน) นอกเหนือจากข้อมูลการเก็บรวบรวมตามปกติ ตัวอย่างต้นแบบเหล่านี้จะถูกเก็บไว้ในสถาบันเฉพาะ (พิพิธภัณฑ์ ห้องปฏิบัติการโมเลกุล มหาวิทยาลัย สวนสัตว์ สวนพฤกษศาสตร์ หอพรรณไม้ ฯลฯ) สถาบันละหนึ่งแห่งสำหรับแต่ละประเทศ และในบางกรณี สถาบันเดียวกันอาจได้รับมอบหมายให้เก็บตัวอย่างต้นแบบของมากกว่าหนึ่งประเทศ ในกรณีที่บางประเทศไม่มีเทคโนโลยีหรือทรัพยากรทางการเงินเพียงพอที่จะทำเช่นนั้นได้

ด้วยวิธีนี้ การสร้างตัวอย่างต้นแบบของรหัสพันธุกรรมจึงเป็นวิธีการที่คล้ายคลึงกับวิธีการที่ใช้ในอนุกรมวิธานแบบดั้งเดิม

ในขั้นตอนแรก จะมีการกำหนดบริเวณของ DNA ที่จะใช้สร้างบาร์โค้ด โดยจะต้องสั้นและมีเปอร์เซ็นต์ลำดับที่ไม่ซ้ำกันสูง สำหรับสัตว์ สาหร่าย และเชื้อรา ส่วนหนึ่งของยีนไมโทคอนเดรียที่เข้ารหัสซับยูนิต 1 ของเอนไซม์ไซโตโครมออกซิเดส CO1 ให้เปอร์เซ็นต์สูง (95%) ซึ่งเป็นบริเวณที่มีเบสคู่ประมาณ 648 คู่^{[ 52 ]}

ในกรณีของพืช การใช้ CO1 ไม่ได้ผล เนื่องจากพืชมีความแปรปรวนในระดับต่ำในบริเวณนั้น นอกจากนี้ยังมีปัญหาที่เกิดจากผลกระทบของโพลีพลอยดีการถ่ายทอดยีนและการผสมข้ามสายพันธุ์บ่อยครั้ง ดังนั้น จีโนม คลอโรพลาสต์ จึง ดูเหมาะสมกว่า^{[ 53 ] [ 54 ]}

เครือข่ายการผสมเกสรแบบสองส่วน^{[ 55 ]}

↑ เมตาบาร์โค้ดดิ้ง                                ↑ การสำรวจการเยี่ยมชม (a,b) กลุ่มพืช-แมลงผสมเกสร (c,d) ชนิดพืช-แมลงผสมเกสร(e,f) ชนิดแมลงผสมเกสร-พืชแต่ละชนิด( Empis leptempis pandellei )

---

Apis: ผึ้ง Apis mellifera ; Bomb.: ผึ้ง Bombus sp.; W.bee: ผึ้งป่า; O.Hym.: แมลงในอันดับHymenoptera อื่นๆ ; O.Dipt.: แมลงในอันดับ Diptera อื่นๆ ; Emp.: แมลงในวงศ์ Empididae ; Syrph.: แมลง ในวงศ์ Syrphidae ; Col.: แมลงในอันดับColeoptera ; Lep.: แมลงในวงศ์ Lepidoptera ; Musc.: แมลงในวงศ์ Muscidaeความหนาของเส้นแสดงถึงสัดส่วนของปฏิสัมพันธ์

แผนภาพทางด้านขวาแสดงการเปรียบเทียบเครือข่ายการผสมเกสรโดยใช้เมตาบาร์โค้ดดีเอ็นเอกับเครือข่ายแบบดั้งเดิมที่อิงจากการสังเกตโดยตรงของการที่แมลงมาเยี่ยมชมพืช การตรวจจับปฏิสัมพันธ์ที่ซ่อนอยู่เพิ่มเติมจำนวนมากทำให้ข้อมูลเมตาบาร์โค้ดเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติของเครือข่ายการผสมเกสรอย่างมากเมื่อเทียบกับการสำรวจการเยี่ยมชม ข้อมูลโมเลกุลแสดงให้เห็นว่าแมลงผสมเกสรมีความหลากหลายมากกว่าที่คาดไว้จากการสำรวจการเยี่ยมชม อย่างไรก็ตาม สายพันธุ์แมลงผสมเกสรประกอบด้วยบุคคลที่มีความเชี่ยวชาญค่อนข้างสูงและก่อตัวเป็นกลุ่มการทำงานที่มีความเชี่ยวชาญสูงตาม^{รูปร่าง}ของดอกไม้ [ ^{55 ]}

ผลจากการเปลี่ยนแปลงระดับโลกที่กำลังดำเนินอยู่พบว่าจำนวนแมลงผสมเกสรและพืชที่อาศัยสัตว์ผสมเกสรทั่วโลกลดลง อย่างมากและพร้อมกัน ^{[ 56 ]}การทำความเข้าใจการตอบสนองของเครือข่ายการผสมเกสรต่อการลดลงเหล่านี้เป็นสิ่งจำเป็นเร่งด่วนในการวินิจฉัยความเสี่ยงที่ระบบนิเวศอาจเผชิญ ตลอดจนการออกแบบและประเมินประสิทธิภาพของการดำเนินการอนุรักษ์^{[ 57 ]}การศึกษาในช่วงแรกเกี่ยวกับการผสมเกสรโดยสัตว์นั้นเกี่ยวข้องกับระบบที่เรียบง่าย เช่น ปฏิสัมพันธ์แบบคู่เฉพาะ หรือเกี่ยวข้องกับกลุ่มย่อยเล็กๆ ของชุมชนพืชและสัตว์ อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของการรบกวนเกิดขึ้นผ่านเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ที่ซับซ้อนมาก ^{[ 58 ]}และในปัจจุบัน ระบบที่ซับซ้อนเหล่านี้เป็นจุดสนใจหลักของการวิจัย การประเมินเครือข่ายที่แท้จริง (ที่กำหนดโดยกระบวนการทางนิเวศวิทยา) จากการสำรวจภาคสนามที่อยู่ภายใต้ผลกระทบของการสุ่มตัวอย่างยังคงเป็นความท้าทาย^{[ 59 ] [ 55 ]}

งานวิจัยล่าสุดได้รับประโยชน์อย่างชัดเจนจากแนวคิดเครือข่ายและเครื่องมือในการศึกษาแบบแผนปฏิสัมพันธ์ในกลุ่มสปีชีส์ขนาดใหญ่^{[ 60 ]}งานวิจัยเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเครือข่ายพืช-แมลงผสมเกสรมีโครงสร้างสูง แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากการเชื่อมโยงแบบสุ่ม^{[ 61 ]}โดยทั่วไป เครือข่ายจะมี (1) การเชื่อมต่อต่ำ (สัดส่วนที่เกิดขึ้นจริงของลิงก์ที่เป็นไปได้ทั้งหมดในชุมชน) ซึ่งบ่งชี้ถึงระดับการสรุปทั่วไปที่ต่ำ (2) การซ้อนชั้นสูง (สิ่งมีชีวิตที่เชี่ยวชาญเฉพาะด้านมีแนวโน้มที่จะมีปฏิสัมพันธ์กับกลุ่มย่อยของสปีชีส์ที่สิ่งมีชีวิตทั่วไปมีปฏิสัมพันธ์ด้วย) สปีชีส์ที่เชี่ยวชาญเฉพาะด้านจะมีปฏิสัมพันธ์เฉพาะกับกลุ่มย่อยที่เหมาะสมของสปีชีส์เหล่านั้นที่มีปฏิสัมพันธ์กับสปีชีส์ทั่วไป^{[ 62 ]} (3) การกระจายสะสมของการเชื่อมต่อ (จำนวนลิงก์ต่อสปีชีส์, s) ที่เป็นไปตามฟังก์ชันกำลังหรือกฎกำลังแบบตัดทอน ^{[ 63 ]} ซึ่ง มีลักษณะเฉพาะคือมีสิ่งมีชีวิตทั่วไปมากเพียงไม่กี่ตัวที่มีลิงก์มากกว่าที่คาดไว้โดยบังเอิญและมีสิ่งมีชีวิตที่เชี่ยวชาญเฉพาะด้านจำนวนมาก (4) การจัดระเบียบแบบโมดูลาร์ โมดูลคือกลุ่มของพืชและแมลงผสมเกสรที่มีการเชื่อมต่อภายในโมดูลในระดับสูง และมีการเชื่อมต่อกับสายพันธุ์ของกลุ่มอื่นน้อย^{[ 64 ] [ 55 ]}

ระดับการเชื่อมต่อที่ต่ำและสัดส่วนของผู้เชี่ยวชาญในเครือข่ายการผสมเกสรที่สูงนั้นขัดแย้งกับมุมมองที่ว่าการสรุปทั่วไปมากกว่าการเชี่ยวชาญเฉพาะด้านเป็นบรรทัดฐานในเครือข่าย^{[ 65 ] [ 66 ]}อันที่จริง พืชส่วนใหญ่ได้รับการเยี่ยมชมจากแมลงผสมเกสรที่หลากหลายซึ่งใช้ทรัพยากรดอกไม้จากพืชหลากหลายชนิด^{[ 67 ] [ 68 ]}สาเหตุหลักที่ถูกยกมาเพื่ออธิบายความขัดแย้งที่เห็นได้ชัดนี้คือการสุ่มตัวอย่างปฏิสัมพันธ์ที่ไม่สมบูรณ์^{[ 69 ]}อันที่จริง คุณสมบัติของเครือข่ายส่วนใหญ่มีความไวต่อความเข้มข้นของการสุ่มตัวอย่างและขนาดของเครือข่าย สูง ^{[ 61 ]}การศึกษาเครือข่ายโดยพื้นฐานแล้วเน้นที่พืชเป็นศูนย์กลาง กล่าวคือ อิงตามการสังเกตการเยี่ยมชมดอกไม้ของแมลงผสมเกสร อย่างไรก็ตาม แนวทางที่เน้นพืชเป็นศูนย์กลางนี้มีข้อจำกัดโดยธรรมชาติซึ่งอาจขัดขวางความเข้าใจกลไกที่ก่อให้เกิดการประกอบชุมชนและรูปแบบความหลากหลายทางชีวภาพ ประการแรก การสังเกตโดยตรงของการเยี่ยมชมของแมลงผสมเกสรไปยังกลุ่มอนุกรมวิธานบางกลุ่ม เช่น กล้วยไม้ มักจะหายาก ^{[ 70 ]}และปฏิสัมพันธ์ที่หายากนั้นตรวจจับได้ยากมากในภาคสนามโดยทั่วไป^{[ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] [ 60 ]}ชุมชนของแมลงผสมเกสรและพืชมักประกอบด้วยชนิดที่อุดมสมบูรณ์เพียงไม่กี่ชนิดและชนิดที่หายากจำนวนมากซึ่งบันทึกไว้ไม่ดีในการสำรวจการเยี่ยมชม^{[ 71 ] [ 72 ]}ชนิดที่หายากเหล่านี้ปรากฏเป็นผู้เชี่ยวชาญ ในขณะที่ในความเป็นจริงแล้วพวกมันอาจเป็นผู้เชี่ยวชาญทั่วไป เนื่องจากความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างความถี่ของการปฏิสัมพันธ์ (f) และการเชื่อมต่อ (s) การปฏิสัมพันธ์ที่สุ่มตัวอย่างน้อยเกินไปอาจนำไปสู่การประเมินระดับความเชี่ยวชาญในเครือข่ายสูงเกินไป^{[ 73 ]}ประการที่สอง การวิเคราะห์เครือข่ายส่วนใหญ่ดำเนินการในระดับชนิด เครือข่ายแทบจะไม่เคยถูกขยายขนาดไปยังกลุ่มการทำงานหรือลดขนาดลงไปยังเครือข่ายตามแต่ละบุคคล^{[ 74 ]}และส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่หนึ่งหรือสองชนิดเท่านั้น พฤติกรรมของแต่ละบุคคลหรืออาณานิคมมักถูกละเลย แม้ว่าอาจส่งผลต่อโครงสร้างของเครือข่ายชนิด^{[ 74 ]}ดังนั้น ชนิดที่ถูกนับว่าเป็นผู้เชี่ยวชาญทั่วไปในเครือข่ายชนิดอาจเกี่ยวข้องกับแต่ละบุคคลหรืออาณานิคมที่มีความเชี่ยวชาญที่ซ่อนเร้นอยู่ ประการที่สาม ผู้มาเยือนดอกไม้ไม่ได้เป็นผู้ผสมเกสรที่มีประสิทธิภาพเสมอไป เนื่องจากพวกเขาอาจไม่ทิ้ง ละอองเรณู ชนิดเดียวกันและ/หรือทิ้งละอองเรณูต่างชนิดจำนวนมาก^{[ 75 ] [ 76 ]]}แนวทางที่เน้นสัตว์เป็นศูนย์กลางโดยอาศัยการตรวจสอบปริมาณละอองเรณูบนผู้มาเยือนและเกสรตัวเมียของพืชอาจมีประสิทธิภาพมากกว่าในการเปิดเผยปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชและแมลงผสมเกสร ^{[ 75 ] [ 76 ] [ 55 ]}

เมตาบาร์โค้ดดิ้งนำเสนอโอกาสใหม่ในการถอดรหัสความเชื่อมโยงทางโภชนาการระหว่างผู้ล่าและเหยื่อภายในห่วงโซ่อาหาร^{[ 78 ] [ 79 ]}เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการแบบดั้งเดิมที่ใช้เวลานาน เช่นการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์หรือ การวิเคราะห์ทางซีรั่มวิทยา การพัฒนาเมตาบาร์โค้ดดิ้งดีเอ็นเอช่วยให้สามารถระบุชนิดของเหยื่อได้โดยไม่ต้องมีความรู้ล่วงหน้าเกี่ยวกับช่วงเหยื่อของผู้ล่า^{[ 80 ]}นอกจากนี้ เมตาบาร์โค้ดดิ้งยังสามารถใช้เพื่อจำแนกลักษณะของสิ่งมีชีวิตจำนวนมากใน ปฏิกิริยา PCR เดียว และวิเคราะห์ตัวอย่างหลายร้อยตัวอย่างพร้อมกันได้^{[ 6 ]}วิธีการดังกล่าวถูกนำมาใช้มากขึ้นเรื่อยๆ เพื่อสำรวจความหลากหลายเชิงหน้าที่และโครงสร้างของห่วงโซ่อาหารในระบบนิเวศทางการเกษตร^{[ 79 ] [ 81 ] [ 82 ] [ 83 ] [ 84 ]}เช่นเดียวกับวิธีการทางโมเลกุลอื่นๆ เมตาบาร์โค้ดดิ้งให้ผลลัพธ์เชิงคุณภาพเท่านั้นเกี่ยวกับการมีอยู่/ไม่มีอยู่ของเหยื่อในตัวอย่างลำไส้หรืออุจจาระ^{[ 85 ]}อย่างไรก็ตาม ความรู้เกี่ยวกับเอกลักษณ์ของเหยื่อที่ถูกกินโดยผู้ล่าชนิดเดียวกันในสภาพแวดล้อมที่กำหนด ช่วยให้สามารถใช้ "ตัวแทนที่ใช้งานได้จริงและมีประโยชน์สำหรับข้อมูลเชิงปริมาณที่แท้จริง" ^{[ 86 ] [ 77 ]}

ในนิเวศวิทยาของห่วงโซ่อาหาร "ใครกินใคร" เป็นประเด็นพื้นฐานสำหรับการทำความเข้าใจปฏิสัมพันธ์ทางโภชนาการที่ซับซ้อนระหว่างศัตรูพืชและศัตรูตามธรรมชาติภายในระบบนิเวศที่กำหนด^{[ 36 ] [ 87 ]}การวิเคราะห์อาหารของสัตว์นักล่าจำพวกแมลงและสัตว์มีกระดูกสันหลังช่วยให้สามารถระบุสัตว์นักล่าหลักที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมศัตรูพืชจำพวกแมลงตามธรรมชาติ และให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับขอบเขตของอาหารของพวกมัน ( ผู้ล่าทั่วไปเทียบกับผู้ล่าเฉพาะทาง ) และ การ ล่าภายในกลุ่มเดียวกัน^{[ 77 ]}

แผนภาพทางด้านขวาสรุปผลการศึกษาในปี 2020 ซึ่งใช้เมตาบาร์โค้ดดิ้งเพื่อแยกแยะความหลากหลายเชิงหน้าที่และโครงสร้างของห่วงโซ่อาหารที่เกี่ยวข้องกับ แปลง ข้าวฟ่าง สอง แปลงในเซเนกัล หลังจากกำหนด OTU ที่ระบุได้เป็นสปีชีส์แล้ว พบแท็กซาเหยื่อที่เป็นสัตว์ขาปล้อง 27 ชนิดจากสัตว์ขาปล้องผู้ล่า 9 ชนิด จำนวนแท็กซาเหยื่อเฉลี่ยที่ตรวจพบต่อตัวอย่างนั้นสูงที่สุดในด้วงคาราบิดมด และแมงมุม และต่ำที่สุดในสัตว์ผู้ล่าที่เหลือ ได้แก่แมลงแอนโทโคริด แมลงเพน ทาโทมิดและแมลงหูยาว ในกลุ่มสัตว์ขาปล้องผู้ล่า พบความหลากหลายของเหยื่อที่เป็นสัตว์ขาปล้องสูงในแมงมุม ด้วงคาราบิด มด และแมลงแอนโทโคริด ในทางตรงกันข้าม ความหลากหลายของสปีชีส์เหยื่อที่ระบุในแมลงหูยาวและแมลงเพนทาโทมิดค่อนข้างต่ำLepidoptera , Hemiptera , DipteraและColeopteraเป็นแท็กซาเหยื่อแมลงที่พบได้บ่อยที่สุดจากสัตว์ขาปล้องผู้ล่า^{[ 77 ]}

การอนุรักษ์ ความหลากหลายทางชีวภาพเชิงหน้าที่และบริการระบบนิเวศ ที่เกี่ยวข้อง โดยเฉพาะอย่างยิ่งการควบคุมศัตรูพืชโดยใช้ศัตรูตามธรรมชาติของพวกมัน นำเสนอแนวทางใหม่ในการจัดการกับความท้าทายสำหรับการเพิ่มความเข้มข้นอย่างยั่งยืนของระบบการผลิตอาหาร^{[ 88 ] [ 89 ] [ 90 ]}การล่าศัตรูพืชโดยผู้ล่าทั่วไป ซึ่งรวมถึงสัตว์ขาปล้องและสัตว์มีกระดูกสันหลัง เป็นองค์ประกอบสำคัญของการควบคุมศัตรูพืชตามธรรมชาติ[ 91 ^{]คุณลักษณะที่}สำคัญอย่างยิ่งของผู้ล่าทั่วไปส่วนใหญ่คือ พวกมันสามารถเข้ามาอาศัยในพืชผลได้ตั้งแต่ต้นฤดูกาล โดยเริ่มจากการกินเหยื่ออื่นก่อน^{[ 92 ] [ 93 ]}อย่างไรก็ตาม ความหลากหลายของอาหาร "ทั่วไป" นั้นมีข้อเสียบางประการสำหรับการควบคุมศัตรูพืช เช่น การล่ากันเองภายในกลุ่ม^{[ 91 ] [ 94 ] [ 95 ]}การวินิจฉัยที่ปรับแต่งแล้วเกี่ยวกับความกว้างของอาหารในผู้ล่าทั่วไป รวมถึงการล่าเหยื่อที่ไม่ใช่ศัตรูพืช จึงจำเป็นต่อการแยกแยะสายใยอาหาร (เช่น การแข่งขันการใช้ประโยชน์และการแข่งขันที่ปรากฏ) ให้ดียิ่งขึ้น และท้ายที่สุดเพื่อระบุปัจจัยขับเคลื่อนหลักของการควบคุมศัตรูพืชตามธรรมชาติในระบบนิเวศทางการเกษตร อย่างไรก็ตาม ความสำคัญของผู้ล่าทั่วไปในสายใยอาหารนั้นโดยทั่วไปประเมินได้ยาก เนื่องจากลักษณะชั่วคราวของการปฏิสัมพันธ์ระหว่างผู้ล่าและเหยื่อแต่ละราย^{[ 94 ] [ 96 ]}หลักฐานที่สรุปได้เพียงอย่างเดียวของการล่าเหยื่อมาจากการสังเกตการบริโภคเหยื่อโดยตรง การระบุเศษเหยื่อในลำไส้ของผู้ล่า^{[ 94 ]}และการวิเคราะห์ของสำรอก^{[ 97 ]}หรืออุจจาระ^{[ 98 ] [ 77 ]}

ซิโอน่า

อาณานิคมของDidemnum vexillum

ตัวอ่อน Diaphorodoris papillata

สิ่งมีชีวิตเช่นนี้สามารถอยู่รอดได้แม้จะผ่านระบบสูบน้ำที่ไม่ผ่านการกรอง

การแพร่กระจายของสิ่งมีชีวิตต่างถิ่น (NIS) ก่อให้เกิดความเสี่ยงต่อระบบนิเวศอย่างมีนัยสำคัญและเพิ่มมากขึ้น^{[ 100 ]}ในระบบนิเวศทางทะเล NIS ที่รอดชีวิตจากการขนส่งและปรับตัวเข้ากับสถานที่ใหม่สามารถส่งผลกระทบในทางลบอย่างมากต่อความหลากหลายทางชีวภาพในท้องถิ่น รวมถึงการแทนที่สิ่งมีชีวิตพื้นเมือง และการเปลี่ยนแปลงในชุมชนชีวภาพและห่วงโซ่อาหารที่เกี่ยวข้อง^{[ 101 ] [ 102 ]}เมื่อ NIS ตั้งรกรากแล้ว การกำจัดพวกมันเป็นเรื่องยากและมีค่าใช้จ่ายสูงมาก^{[ 103 ] [ 104 ]}และการแพร่กระจายในระดับภูมิภาคอาจเกิดขึ้นได้จากการแพร่กระจายตามธรรมชาติหรือผ่านเส้นทางการขนส่งที่เกิดจากกิจกรรมของมนุษย์^{[ 104 ] [ 105 ] [ 106 ]}แม้ว่าการเกาะติดของสิ่งมีชีวิตบนตัวเรือและน้ำอับเฉาของเรือจะเป็นที่รู้จักกันดีว่าเป็นเส้นทางสำคัญที่เกิดจากกิจกรรมของมนุษย์ในการแพร่กระจายของ NIS ในระดับนานาชาติ^{[ 100 ] [ 107 ] [ 108 ] [ 109 ]}แต่ความรู้เกี่ยวกับศักยภาพของเรือที่แล่นผ่านภูมิภาคในการมีส่วนร่วมในการแพร่กระจายของศัตรูพืชทางทะเลในระดับทุติยภูมิผ่านการเคลื่อนย้ายน้ำท้องเรือยังมีน้อยมาก^{[ 99 ]}

การศึกษาล่าสุดพบว่าน้ำและเศษซากที่เกี่ยวข้องซึ่งปะปนอยู่ในพื้นที่ท้องเรือของเรือขนาดเล็ก (<20 ม.) สามารถทำหน้าที่เป็นพาหะในการแพร่กระจายของสิ่งมีชีวิตรุกรานในระดับภูมิภาคได้^{[ 110 ] [ 111 ] [ 112 ] [ 113 ] [ 114 ] [ 115 ]}น้ำท้องเรือหมายถึงน้ำใดๆ ที่กักเก็บไว้ในเรือ (นอกเหนือจากน้ำถ่วง) และไม่ได้ถูกสูบขึ้นเรือโดยเจตนา น้ำดังกล่าวสามารถสะสมอยู่บนหรือใต้ดาดฟ้าเรือ (เช่น ใต้แผ่นพื้น) ผ่านกลไกต่างๆ รวมถึงการกระทำของคลื่น การรั่วไหล ผ่านซีลท้ายใบพัด และผ่านการบรรทุกสิ่งของต่างๆ เช่น อุปกรณ์ดำน้ำ อุปกรณ์ตกปลา อุปกรณ์เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ หรืออุปกรณ์ทางวิทยาศาสตร์^{[ 116 ]}ดังนั้น น้ำท้องเรืออาจมีน้ำทะเลรวมถึงสิ่งมีชีวิตในระยะต่างๆ ของชีวิต เศษเซลล์ และสารปนเปื้อน (เช่น น้ำมัน สิ่งสกปรก ผงซักฟอก ฯลฯ) ซึ่งโดยปกติจะถูกระบายออกโดยใช้ปั๊มสูบน้ำท้องเรืออัตโนมัติหรือระบายออกเองโดยใช้วาล์วปากเป็ด น้ำท้องเรือที่สูบจากเรือขนาดเล็ก (ด้วยมือหรืออัตโนมัติ) มักจะไม่ได้รับการบำบัดก่อนปล่อยลงทะเล ซึ่งแตกต่างจากเรือขนาดใหญ่ที่ต้องแยกน้ำมันและน้ำโดยใช้ระบบกรอง การเหวี่ยงแยก หรือการดูดซับคาร์บอน^{[ 116 ] [ 117 ]}หากสปอร์สามารถอยู่รอดได้ในกระบวนการนี้ การปล่อยน้ำท้องเรืออาจส่งผลให้เกิดการแพร่กระจายของ NIS ^{[ 99 ]}

ในปี 2017 Fletcher และคณะได้ใช้การทดลองในห้องปฏิบัติการและภาคสนามร่วมกันเพื่อตรวจสอบความหลากหลาย ความอุดมสมบูรณ์ และการอยู่รอดของวัสดุชีวภาพที่อยู่ในตัวอย่างน้ำเสียจากเรือขนาดเล็กตามชายฝั่ง^{[ 115 ]}การทดลองในห้องปฏิบัติการของพวกเขาแสดงให้เห็นว่า กลุ่มหรือชิ้นส่วนของสัตว์ ทะเลจำพวกเพรียงทะเลและ ตัวอ่อน ของไบรโอซัวสามารถอยู่รอดได้แม้จะผ่านระบบสูบน้ำที่ไม่ผ่านการกรองโดยไม่ได้รับอันตรายมากนัก นอกจากนี้ พวกเขายังทำการประเมินทางสัณฐานวิทยาและโมเลกุลเป็นครั้งแรก (โดยใช้ eDNA metabarcoding) เกี่ยวกับความเสี่ยงด้านความปลอดภัยทางชีวภาพที่เกิดจากการปล่อยน้ำเสียจากเรือขนาดเล็ก 30 ลำ (เรือใบและเรือยนต์) ที่มีต้นกำเนิดและระยะเวลาการเดินเรือที่แตกต่างกัน โดยใช้ eDNA metabarcoding พวกเขาสามารถจำแนกกลุ่มสิ่งมีชีวิตได้มากกว่าวิธีการทางกล้องจุลทรรศน์แบบดั้งเดิมประมาณสามเท่า รวมถึงการตรวจพบสิ่งมีชีวิต 5 ชนิดที่ได้รับการยอมรับว่าเป็นสิ่งมีชีวิตต่างถิ่นในพื้นที่ศึกษา^{[ 99 ]}

เพื่อช่วยในการทำความเข้าใจความเสี่ยงที่เกี่ยวข้องกับพาหะนำ NIS ที่แตกต่างกัน การประเมินความหลากหลายทางชีวภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบดั้งเดิมจึงได้รับการเสริมด้วย eDNA metabarcoding มากขึ้นเรื่อยๆ^{[ 118 ] [ 119 ] [ 120 ] [ 121 ]}ซึ่งช่วยให้สามารถระบุกลุ่มอนุกรมวิธานที่หลากหลายในหลายช่วงชีวิตได้ นอกจากนี้ยังช่วยให้สามารถตรวจจับ NIS ที่อาจถูกมองข้ามไปหากใช้วิธีการแบบดั้งเดิม แม้ว่าเครื่องมือ eDNA metabarcoding จะมีศักยภาพสูงสำหรับการคัดกรองอนุกรมวิธานในวงกว้าง^{[ 122 ] [ 123 ]}แต่ความท้าทายที่สำคัญสำหรับ eDNA ในบริบทของการเฝ้าระวังสิ่งแวดล้อมของศัตรูพืชในทะเล โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อเฝ้าระวังสภาพแวดล้อมที่ปิด เช่น พื้นที่ท้องเรือหรือถังอับเฉาบางแห่ง คือการแยกแยะสิ่งมีชีวิตที่ตายแล้วและสิ่งมีชีวิตที่ยังมีชีวิตอยู่^{[ 124 ]}ดีเอ็นเอภายนอกเซลล์สามารถคงอยู่ได้ในสภาพแวดล้อมที่มืด/เย็นเป็นเวลานาน (หลายเดือนถึงหลายปี^{[ 125 ] [ 126 ])}ดังนั้นสิ่งมีชีวิตจำนวนมากที่ตรวจพบโดยใช้เมตาบาร์โค้ดดิ้ง eDNA อาจไม่สามารถมีชีวิตอยู่ได้ในสถานที่เก็บตัวอย่างเป็นเวลาหลายวันหรือหลายสัปดาห์ ในทางตรงกันข้าม กรดไรโบนิวคลีอิก (RNA) จะเสื่อมสภาพอย่างรวดเร็วหลังจากเซลล์ตาย ซึ่งน่าจะให้ภาพที่แม่นยำกว่าของชุมชนที่มีชีวิต^{[ 127 ]}การศึกษาเมตาบาร์โค้ดดิ้งล่าสุดได้สำรวจการใช้โมเลกุล eDNA และ eRNA ที่สกัดร่วมกันเพื่อตรวจสอบตัวอย่างตะกอนเบนทิกบริเวณฟาร์มปลาทะเลและแหล่งขุดเจาะน้ำมัน^{[ 128 ] [ 129 ] [ 130 ] [ 131 ] [ 132 ]}และโดยรวมแล้วพบความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งขึ้นเล็กน้อยระหว่างตัวแปรทางชีวภาพและทางกายภาพเคมีตามระดับผลกระทบเมื่อใช้ eRNA จากมุมมองด้านความปลอดภัยทางชีวภาพทางทะเล การตรวจพบ NIS ที่มีชีวิตอาจแสดงถึง... ภัยคุกคามที่ร้ายแรงและทันทีทันใดมากกว่าการตรวจจับ NIS โดยอาศัยสัญญาณ DNA เพียงอย่างเดียว ดังนั้น RNA ในสิ่งแวดล้อมจึงอาจเป็นวิธีการที่มีประโยชน์ในการระบุสิ่งมีชีวิตในตัวอย่าง^{[ 99 ]}

การสร้างคลังบาร์โค้ดทางพันธุกรรมในตอนแรกมุ่งเน้นไปที่ปลา^{[ 133 ]}และนก^{[ 134 ] [ 135 ] [ 136 ]}ตามด้วยผีเสื้อและสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังอื่นๆ^{[ 137 ]}ในกรณีของนก ตัวอย่าง DNA มักจะได้รับจากหน้าอก

นักวิจัยได้พัฒนาแคตตาล็อกเฉพาะสำหรับกลุ่มสัตว์ขนาดใหญ่ เช่น ผึ้ง นก สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม หรือปลาแล้ว การใช้งานอีกอย่างหนึ่งคือการวิเคราะห์ระบบนิเวศสัตว์ทั้งหมดของพื้นที่ทางภูมิศาสตร์ที่กำหนด เช่น โครงการ "รหัสบาร์โค้ดชีวิตขั้วโลก" ซึ่งมีเป้าหมายเพื่อรวบรวมลักษณะทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตทั้งหมดที่อาศัยอยู่ในเขตขั้วโลก ทั้งสองขั้วโลกของโลก รูปแบบที่เกี่ยวข้องนี้คือการเข้ารหัสสัตว์น้ำทั้งหมดในลุ่มน้ำ ตัวอย่างเช่น ลุ่มน้ำที่เริ่มพัฒนาในแม่น้ำเซาฟรานซิสโก ทางตะวันออกเฉียงเหนือ^ของบราซิล [ ^{138 ] [ 139 ]}

ศักยภาพของการใช้บาร์โค้ดนั้นกว้างขวางมาก เนื่องจากมีการค้นพบสายพันธุ์ที่ซ่อนเร้นจำนวนมาก (ซึ่งได้ให้ผลลัพธ์เชิงบวกมากมายแล้ว) ^{[ 140 ]}การใช้ในการระบุสายพันธุ์ในทุกช่วงชีวิต การระบุตัวตนที่ปลอดภัยในกรณีของสายพันธุ์ที่ได้รับการคุ้มครองที่ถูกลักลอบค้าขายอย่างผิดกฎหมาย เป็นต้น^{[ 141 ] [ 142 ]}

นอกจากนี้ยังใช้เป็นเครื่องมือที่ไม่รุกรานเพื่อกำหนดอาหารของสัตว์ป่า เช่น วอมแบต^{[ 143 ]}และโดยเฉพาะอย่างยิ่งสัตว์ใกล้สูญพันธุ์อย่างยิ่ง เช่นวอมแบตจมูกขนเหนือ ( Lasiorhinus krefftii ) ^{[ 144 ]}

การระบุรหัสดีเอ็นเอได้รับการเสนอให้เป็นวิธีในการจำแนกสายพันธุ์ที่เหมาะสมแม้สำหรับผู้ที่ไม่ใช่ผู้เชี่ยวชาญ^{[ 145 ]}

โดยทั่วไปข้อบกพร่องของการทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอก็ใช้ได้กับการทำเมตาบาร์โค้ดเช่นกัน ข้อเสียเปรียบที่สำคัญอย่างหนึ่งของการศึกษาเมตาบาร์โค้ดคือยังไม่มีข้อตกลงร่วมกันเกี่ยวกับการออกแบบการทดลองที่เหมาะสมที่สุดและเกณฑ์ทางชีวสารสนเทศที่จะนำมาใช้ในการทำเมตาบาร์โค้ดดีเอ็นเออีดีเอ็น^{[ 146 ]}อย่างไรก็ตาม ปัจจุบันมีความพยายามร่วมกัน เช่น เครือข่าย COST DNAqua-Netของความร่วมมือด้านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งยุโรป^[ 147 ^{] เพื่อ}ก้าวไปข้างหน้าโดยการแลกเปลี่ยนประสบการณ์และความรู้เพื่อสร้างมาตรฐานแนวปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการตรวจสอบทางชีวภาพ^{[ 148 ]}

สิ่งที่เรียกว่าบาร์โค้ดคือบริเวณของดีเอ็นเอไมโทคอนเดรียภายในยีนสำหรับไซโตโครมซีออกซิเดสฐานข้อมูลBarcode of Life Data Systems (BOLD) ประกอบด้วยลำดับบาร์โค้ดดีเอ็นเอจากสิ่งมีชีวิตมากกว่า 190,000 ชนิด^{[ 149 ] [ 150 ]}อย่างไรก็ตาม นักวิทยาศาสตร์เช่น Rob DeSalle ได้แสดงความกังวลว่าอนุกรมวิธานแบบดั้งเดิมและบาร์โค้ดดีเอ็นเอ ซึ่งพวกเขาถือว่าเป็นชื่อที่ไม่ถูกต้อง จำเป็นต้องได้รับการปรับให้เข้ากัน เนื่องจากทั้งสองวิธีกำหนดขอบเขตของสายพันธุ์แตกต่างกัน^{[ 151 ]}การถ่ายทอดยีนผ่านเอนโดซิมไบออนต์และพาหะอื่นๆ อาจทำให้บาร์โค้ดไม่มีประสิทธิภาพในการระบุสายพันธุ์ได้^{[ 152 ]}

ในจุลชีววิทยายีนสามารถเคลื่อนย้ายได้อย่างอิสระแม้กระทั่งระหว่างแบคทีเรียที่มีความสัมพันธ์ห่างไกลกัน และอาจขยายไปถึงอาณาจักรแบคทีเรียทั้งหมด โดยทั่วไปแล้ว นักจุลชีววิทยาได้สันนิษฐานว่าแบคทีเรียหรืออาร์เคีย ชนิดต่างๆ ที่มี ลำดับยีน 16S ribosomal RNAคล้ายคลึงกันมากกว่า 97% จำเป็นต้องตรวจสอบโดยการผสมแบบ DNA–DNAเพื่อตัดสินว่าพวกมันเป็นสปีชีส์เดียวกันหรือไม่^{[ 153 ]}แนวคิดนี้ถูกจำกัดให้แคบลงในปี 2549 โดยมีความคล้ายคลึงกันที่ 98.7% ^{[ 154 ]}

การผสมพันธุ์ DNA–DNAนั้นล้าสมัยแล้ว และผลลัพธ์บางครั้งนำไปสู่ข้อสรุปที่ผิดพลาดเกี่ยวกับสายพันธุ์ เช่นเดียวกับนกสกัวโพมารีนและ นกสกั วใหญ่^{[ 155 ] [ 156 ]}แนวทางสมัยใหม่เปรียบเทียบความคล้ายคลึงของลำดับโดยใช้วิธีการคำนวณ^{[ 157 ]}

• ระบบบาร์โค้ดข้อมูลชีวิต (ตัวหนา)
• กลุ่มความร่วมมือเพื่อบาร์โค้ดแห่งชีวิต (CBOL)
• ความร่วมมือฐานข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ระหว่างประเทศ (INSDC)
• เครื่องหมายโมเลกุล
• อุปสรรคทางอนุกรมวิธาน

Santoferrara, Luciana; Burki, Fabien; Filker, Sabine; Logares, Ramiro; Dunthorn, Micah; McManus, George B. (2020). "มุมมองจากสิบปีของการศึกษาโปรติสต์โดยเมตาบาร์โค้ดดิ้งแบบความเร็วสูง" วารสารจุลชีววิทยาของยูคาริโอต 67 ( 5): 612– 622. Bibcode : 2020JEJEM..67..612S . doi : 10.1111/jeu.12813 . hdl : 10261/223228 . PMID  32498124 . S2CID  219331807 .