ดีเอ็นเอ บาร์โค้ดดิ้งเป็นวิธีการระบุชนิดโดยใช้ส่วนของดีเอ็นเอ สั้นๆ จากยีนหรือกลุ่มยีนที่เฉพาะเจาะจง หลักการของดีเอ็นเอ บาร์โค้ดดิ้ง คือ เมื่อเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลอ้างอิงของส่วนของดีเอ็นเอ (เรียกอีกอย่างว่า " ลำดับ ") ลำดับแต่ละลำดับสามารถใช้ระบุสิ่งมีชีวิตเป็นชนิดได้อย่างเฉพาะเจาะจง เช่นเดียวกับเครื่องสแกนสินค้าในซูเปอร์มาร์เก็ตที่ใช้แถบสีดำที่คุ้นเคยของบาร์โค้ด UPCเพื่อระบุสินค้าในสต็อกโดยเทียบกับฐานข้อมูลอ้างอิง^{[ 1 ]}บางครั้ง "บาร์โค้ด" เหล่านี้ถูกนำมาใช้เพื่อระบุชนิด ที่ไม่รู้จัก หรือส่วนต่างๆ ของสิ่งมีชีวิต เพียงเพื่อจัดทำรายการอนุกรมวิธาน ให้ได้มาก ที่สุด หรือเพื่อเปรียบเทียบกับอนุกรมวิธานแบบดั้งเดิมเพื่อกำหนดขอบเขตของชนิด^{[ 2 ]}

มีการใช้บริเวณยีนที่แตกต่างกันเพื่อระบุกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่แตกต่างกันโดยใช้บาร์โค้ด บริเวณบาร์โค้ดที่ใช้กันทั่วไปสำหรับสัตว์และโปรติสต์ บางชนิด คือส่วนหนึ่งของ ยีน ไซโตโครมซีออกซิเดส I (COI, CO1 หรือCOX1 ) ซึ่งพบในดีเอ็นเอไมโทคอนเดรีย ยีนอื่นๆ ที่เหมาะสมสำหรับการทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอ ได้แก่ตัวเว้นวรรคที่ถอดรหัสภายใน (ITS) rRNAซึ่งมักใช้สำหรับเชื้อรา และRuBisCOที่ใช้สำหรับพืช^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]}จุลินทรีย์ถูกตรวจจับโดยใช้บริเวณยีนที่แตกต่างกันตัวอย่างเช่น ยีน16S rRNA ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายในการระบุโปรคาริโอต ในขณะที่ยีน 18S rRNAส่วนใหญ่ใช้สำหรับการตรวจจับยูคาริโอต จุลินทรีย์ บริเวณยีนเหล่านี้ถูกเลือกเนื่องจากมีความแปรผันภายในชนิด (ภายในสายพันธุ์) น้อยกว่าความแปรผันระหว่างชนิด (ระหว่างสายพันธุ์) ซึ่งเรียกว่า "ช่องว่างบาร์โค้ด" ^{[ 6 ]}

การประยุกต์ใช้ DNA barcoding บางอย่างได้แก่ การระบุใบพืชแม้ว่าจะไม่มีดอกหรือผล การระบุละอองเรณูที่เก็บได้จากตัวสัตว์ที่ช่วยผสมเกสร การระบุ ตัวอ่อน ของแมลงซึ่งอาจมีลักษณะเฉพาะน้อยกว่าตัวเต็มวัย หรือการตรวจสอบอาหารของสัตว์โดยพิจารณาจากเนื้อหาในกระเพาะ น้ำลาย หรืออุจจาระ^{[ 7 ]}เมื่อใช้ barcoding เพื่อระบุสิ่งมีชีวิตจากตัวอย่างที่มี DNA จากสิ่งมีชีวิตมากกว่าหนึ่งชนิดจะใช้ คำว่า DNA metabarcoding ^{[ 8 ] [ 9 ]}เช่นDNA metabarcoding ของชุมชนไดอะตอมในแม่น้ำและลำธาร ซึ่งใช้ในการประเมินคุณภาพน้ำ^{[ 10 ]}

เทคนิคการทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอได้รับการพัฒนามาจากงานลำดับดีเอ็นเอในยุคแรกๆ ของชุมชนจุลินทรีย์โดยใช้ยีน 5S rRNA ^{[ 11 ]}ในปี 2546 วิธีการและคำศัพท์เฉพาะของการทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอสมัยใหม่ได้รับการเสนอให้เป็นวิธีการมาตรฐานสำหรับการระบุชนิดพันธุ์ ตลอดจนการจัดสรรลำดับที่ไม่รู้จักให้กับกลุ่มอนุกรมวิธานที่สูงขึ้น เช่น อันดับและไฟลัม ในบทความโดยPaul DN Hebertและคณะจากมหาวิทยาลัย Guelphรัฐออนแทรีโอประเทศแคนาดา[ ^{12 ] Hebert}และเพื่อนร่วมงานของเขาได้แสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของยีนไซโตโครมซีออกซิเดส I (COI) ซึ่ง Folmer และคณะได้ใช้เป็นครั้งแรกในปี 2537 โดยใช้ไพรเมอร์ดีเอ็นเอที่ ตีพิมพ์ของพวกเขา เป็นเครื่องมือสำหรับการวิเคราะห์ทางวิวัฒนาการในระดับชนิดพันธุ์^{[ 12 ]}ซึ่งเป็นเครื่องมือที่เหมาะสมในการจำแนกความแตกต่างระหว่างสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังหลายเซลล์^{[ 13 ]} “บริเวณฟอลเมอร์” ของยีน COI มักใช้เพื่อจำแนกความแตกต่างระหว่างกลุ่มสิ่งมีชีวิตโดยอาศัยรูปแบบความแปรผันในระดับดีเอ็นเอ ความง่ายในการดึงลำดับ และความแปรผันที่ผสมผสานกับการอนุรักษ์ระหว่างสายพันธุ์ เป็นข้อดีบางประการของ COI เมื่อเรียกโปรไฟล์เหล่านี้ว่า “บาร์โค้ด” เฮเบิร์ตและคณะได้จินตนาการถึงการพัฒนาฐานข้อมูล COI ที่สามารถใช้เป็นพื้นฐานสำหรับ “ระบบการระบุตัวตนทางชีวภาพระดับโลก”

การทำบาร์โค้ดสามารถทำได้จากเนื้อเยื่อของตัวอย่างเป้าหมาย จากส่วนผสมของสิ่งมีชีวิตหลายชนิด (ตัวอย่างรวม) หรือจากดีเอ็นเอที่มีอยู่ในตัวอย่างสิ่งแวดล้อม (เช่น น้ำหรือดิน) วิธีการเก็บตัวอย่าง การเก็บรักษา หรือการวิเคราะห์จะแตกต่างกันไปตามประเภทของตัวอย่างเหล่านั้น

ตัวอย่างเนื้อเยื่อ

ในการสร้างบาร์โค้ดให้กับตัวอย่างเนื้อเยื่อจากตัวอย่างเป้าหมายนั้น ชิ้นส่วนเล็กๆ ของผิวหนัง เกล็ด ขา หรือหนวด ก็อาจเพียงพอแล้ว (ขึ้นอยู่กับขนาดของตัวอย่าง) เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน จำเป็นต้องฆ่าเชื้อเครื่องมือที่ใช้แล้วระหว่างตัวอย่างแต่ละชิ้น แนะนำให้เก็บตัวอย่างสองตัวอย่างจากตัวอย่างหนึ่งชิ้น ตัวอย่างหนึ่งสำหรับเก็บรักษา และอีกตัวอย่างหนึ่งสำหรับกระบวนการสร้างบาร์โค้ด การเก็บรักษาตัวอย่างมีความสำคัญอย่างยิ่งในการแก้ไขปัญหาการเสื่อมสภาพของดีเอ็นเอ

ตัวอย่างจำนวนมาก

ตัวอย่างรวม (Bulk sample) คือตัวอย่างสิ่งแวดล้อมประเภทหนึ่งที่ประกอบด้วยสิ่งมีชีวิตหลายชนิดจากกลุ่มอนุกรมวิธานที่กำลังศึกษา ความแตกต่างระหว่างตัวอย่างรวม (ในความหมายที่ใช้ในที่นี้) กับตัวอย่างสิ่งแวดล้อมอื่นๆ คือ ตัวอย่างรวมมักให้ดีเอ็นเอคุณภาพดีในปริมาณมาก ตัวอย่างของตัวอย่างรวม ได้แก่ ตัวอย่างสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังขนาดใหญ่ในน้ำที่เก็บโดยใช้แห หรือตัวอย่างแมลงที่เก็บโดยใช้กับดักมาเลส (Malaise trap) ตัวอย่างน้ำที่ผ่านการกรองหรือแยกขนาดแล้วซึ่งมีสิ่งมีชีวิตทั้งตัว เช่น ยูคาริโอตเซลล์เดียว ก็ถูกนิยามว่าเป็นตัวอย่างรวมเช่นกัน ตัวอย่างเหล่านี้สามารถเก็บได้โดยใช้เทคนิคเดียวกันกับที่ใช้ในการเก็บตัวอย่างแบบดั้งเดิมสำหรับการระบุชนิดโดยอาศัยลักษณะทางสัณฐานวิทยา

ตัวอย่าง eDNA

วิธี การ ดีเอ็นเอสิ่งแวดล้อม (eDNA) เป็นวิธีการที่ไม่รุกรานในการตรวจจับและระบุชนิดของสิ่งมีชีวิตจากเศษเซลล์หรือดีเอ็นเอภายนอกเซลล์ที่มีอยู่ในตัวอย่างสิ่งแวดล้อม (เช่น น้ำหรือดิน) โดยใช้บาร์โค้ดหรือเมตาบาร์โค้ด วิธีการนี้อาศัยข้อเท็จจริงที่ว่าสิ่งมีชีวิตทุกชนิดทิ้งดีเอ็นเอไว้ในสิ่งแวดล้อม และสามารถตรวจจับดีเอ็นเอสิ่งแวดล้อมนี้ได้แม้กระทั่งสิ่งมีชีวิตที่มีปริมาณน้อยมาก ดังนั้น สำหรับการเก็บตัวอย่างภาคสนาม ส่วนที่สำคัญที่สุดคือการใช้วัสดุและเครื่องมือที่ปราศจากดีเอ็นเอในแต่ละจุดเก็บตัวอย่างหรือตัวอย่าง เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน หากดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตเป้าหมายมีแนวโน้มที่จะมีอยู่ในปริมาณน้อย ในทางกลับกัน ตัวอย่าง eDNA จะรวมถึงดีเอ็นเอของจุลินทรีย์ที่มีชีวิตทั้งเซลล์ ซึ่งมักมีอยู่ในปริมาณมาก ดังนั้น ตัวอย่างจุลินทรีย์ที่เก็บในสภาพแวดล้อมทางธรรมชาติจึงเรียกว่าตัวอย่าง eDNA เช่นกัน แต่การปนเปื้อนเป็นปัญหาที่น้อยกว่าในบริบทนี้เนื่องจากมีสิ่งมีชีวิตเป้าหมายจำนวนมาก วิธีการ eDNA สามารถใช้ได้กับตัวอย่างหลายประเภท เช่น น้ำ ดิน อุจจาระ เนื้อหาในกระเพาะอาหาร หรือเลือด^{[ 14 ]}

การทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอจำเป็นต้องสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่าง มีวิธี การสกัดดีเอ็นเอ หลายวิธี และปัจจัยต่างๆ เช่น ต้นทุน เวลา ชนิดของตัวอย่าง และปริมาณที่ได้ จะส่งผลต่อการเลือกวิธีการที่เหมาะสมที่สุด

เมื่อ DNA จากตัวอย่างสิ่งมีชีวิตหรือ eDNA ถูกขยายโดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ปฏิกิริยาอาจได้รับผลกระทบในทางลบจากโมเลกุลยับยั้งที่มีอยู่ในตัวอย่าง^{[ 15 ]}การกำจัดสารยับยั้งเหล่านี้มีความสำคัญอย่างยิ่งเพื่อให้แน่ใจว่ามี DNA คุณภาพสูงสำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง

การขยายดีเอ็นเอที่สกัดออกมาเป็นขั้นตอนที่จำเป็นในการทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอ โดยทั่วไปแล้ว จะมีการเรียงลำดับดีเอ็นเอ เพียงส่วนเล็กๆ ของวัสดุดีเอ็นเอทั้งหมด (โดยทั่วไป 400–800 คู่เบส ) เพื่อให้ได้บาร์โค้ดดีเอ็นเอ และการขยายจึงจำกัดอยู่เฉพาะส่วนนั้นโดยใช้ไพรเมอร์คู่หนึ่ง^{[ 16 ]}การขยายวัสดุ eDNA มักจะเน้นที่ขนาดชิ้นส่วนที่เล็กกว่า (<200 คู่เบส) เนื่องจาก eDNA มีแนวโน้มที่จะแตกเป็นชิ้นเล็กๆ มากกว่าวัสดุดีเอ็นเอจากแหล่งอื่นๆ อย่างไรก็ตาม บางการศึกษาโต้แย้งว่าไม่มีความสัมพันธ์ระหว่างขนาดของแอมพลิคอนกับอัตราการตรวจจับ eDNA ^{[ 17 ] [ 18 ]}

เมื่อขยายบริเวณเครื่องหมายบาร์โค้ด DNA แล้ว ขั้นตอนต่อไปคือการจัดลำดับบริเวณเครื่องหมายโดยใช้วิธีการจัดลำดับ DNA ^{[ 19 ]}มีแพลตฟอร์มการจัดลำดับที่แตกต่างกันมากมาย และการพัฒนาทางเทคนิคกำลังดำเนินไปอย่างรวดเร็ว

เครื่องหมายที่ใช้สำหรับการระบุรหัสดีเอ็นเอเรียกว่าบาร์โค้ด เพื่อให้สามารถจำแนกสายพันธุ์โดยใช้บาร์โค้ดดีเอ็นเอได้อย่างประสบความสำเร็จ การเลือกบริเวณดีเอ็นเอที่มีข้อมูลจึงมีความสำคัญ บาร์โค้ดดีเอ็นเอที่ดีควรมีความแปรปรวนภายในสายพันธุ์ต่ำและ มี ความแปรปรวน ระหว่างสายพันธุ์สูง ^{[ 12 ]}และมีไซต์ข้างเคียงที่อนุรักษ์ไว้ สำหรับการพัฒนา ไพรเมอร์PCR สากล สำหรับ การใช้งานทาง อนุกรมวิธาน ในวงกว้าง เป้าหมายคือการออกแบบไพรเมอร์ที่จะตรวจจับและจำแนกสายพันธุ์ส่วนใหญ่หรือทั้งหมดในกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่ศึกษา (ความละเอียดทางอนุกรมวิธานสูง) ความยาวของลำดับบาร์โค้ดควรสั้นพอที่จะใช้กับแหล่งตัวอย่างการสกัดดีเอ็นเอการขยายและวิธีการจัดลำดับ ในปัจจุบัน ^{[ 20 ]}

การใช้ลำดับ ยีน เดียว สำหรับสิ่งมีชีวิตทุกกลุ่ม ตั้งแต่ไวรัสพืชไปจนถึงสัตว์จะมีประสิทธิภาพมากกว่าอย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการค้นพบยีนบริเวณดังกล่าว ดังนั้นจึงมีการใช้บาร์โค้ดที่แตกต่างกันสำหรับสิ่งมีชีวิตแต่ละกลุ่ม หรือขึ้นอยู่กับคำถามในการศึกษา

สำหรับสัตว์ บาร์โค้ดที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดคือ ตำแหน่ง ไมโทคอนเดรียลไซโตโครมซีออกซิเดส I ( COI ) ^{[ 21 ]}ยีนไมโทคอนเดรียลอื่นๆ เช่นCytb , 12Sหรือ16Sก็ถูกนำมาใช้เช่นกันยีนไมโทคอนเดรี ยล เป็นที่นิยมมากกว่ายีนนิวเคลียร์เนื่องจากไม่มีอินทรอนมีรูปแบบการถ่ายทอดแบบแฮพลอยด์และมีการรวมตัวใหม่ที่ จำกัด ^{[ 21 ] [ 22 ]}ยิ่งไปกว่านั้น แต่ละเซลล์มีไมโทคอนเดรีย จำนวนมาก (มากถึงหลายพันตัว) และแต่ละตัวมีโมเลกุล DNA วงกลมหลายโมเลกุล ดังนั้นไมโทคอนเดรียจึงสามารถเป็นแหล่ง DNA ที่อุดมสมบูรณ์ได้แม้ว่าเนื้อเยื่อตัวอย่างจะมีจำกัด

อย่างไรก็ตาม ในพืช ยีนไมโทคอนเดรียไม่เหมาะสมสำหรับการทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอ เนื่องจากมีอัตราการกลายพันธุ์ ต่ำ ^{[ 23 ]}พบยีนที่น่าจะเป็นตัวเลือกบางส่วนใน จีโน มคลอโรพลาสต์โดยยีนที่มีแนวโน้มดีที่สุดคือ ยีน maturase K ( matK ) ไม่ว่าจะ อยู่เดี่ยวๆ หรือร่วมกับยีนอื่นๆ เครื่องหมายหลายตำแหน่งเช่นตัวเว้นวรรคที่ถอดรหัสภายใน ของไรโบโซม (ITS DNA) ร่วมกับmatK , rbcL , trnHหรือยีนอื่นๆ ก็ถูกนำมาใช้ในการระบุชนิดเช่นกัน การจำแนกความแตกต่างระหว่างพืชชนิดต่างๆ ได้ดีที่สุดเมื่อใช้ตำแหน่ง "บาร์โค้ด" คลอโรพลาสต์สองตำแหน่งขึ้นไป^{[ 24 ]}

สำหรับแบคทีเรียหน่วยย่อยขนาดเล็กของยีน ribosomal RNA ( 16S ) สามารถใช้ได้กับกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่แตกต่างกัน เนื่องจากมีการอนุรักษ์ไว้อย่างสูง^{[ 25 ]}การศึกษาบางชิ้นแนะนำว่าCOI [ ^{26 ]} chaperoninชนิด II ( cpn60 ) ^{[ 27 ]}หรือหน่วยย่อย β ของRNA polymerase ( rpoB ) ^{[ 28 ]}ก็สามารถใช้เป็นบาร์โค้ด DNA ของแบคทีเรียได้เช่น ^กัน

การทำบาร์โค้ดให้กับเชื้อราเป็นเรื่องที่ท้าทายกว่า และอาจต้องใช้ไพรเมอร์มากกว่าหนึ่งชุด^{[ 29 ]}เครื่องหมายCOIทำงานได้ดีในกลุ่มเชื้อราบางกลุ่ม^{[ 30 ]}แต่ไม่ได้ทำงานได้ดีเท่ากันในกลุ่มอื่น ๆ^{[ 31 ]}ดังนั้นจึงมีการใช้เครื่องหมายเพิ่มเติม เช่นITS rDNA และหน่วยย่อยขนาดใหญ่ของ RNA ไรโบโซมนิวเคลียร์ (28S LSU rRNA) ^{[ 32 ]}

ในกลุ่มโปรติสต์มีการเสนอโค้ดบาร์โคดหลายแบบ เช่น บริเวณ D1–D2 หรือ D2–D3 ของ28S rDNA , ส่วนย่อย V4 ของ ยีน 18S rRNA , ITS rDNA และCOIนอกจากนี้ ยังสามารถใช้โค้ดบาร์โคดเฉพาะสำหรับ โปรติสต์ ที่สังเคราะห์แสงได้เช่น หน่วยย่อยขนาดใหญ่ของยีนribulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase ( rbcL ) และยีน 23S rRNA ในคลอโรพลาส ต์

ห้องสมุดอ้างอิงใช้สำหรับการระบุอนุกรมวิธาน หรือที่เรียกว่าการระบุคำอธิบายประกอบ ของลำดับที่ได้จากบาร์โค้ดหรือเมตาบาร์โค้ด ฐานข้อมูลเหล่านี้มีบาร์โค้ด DNA ที่กำหนดให้กับอนุกรมวิธานที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ ห้องสมุดอ้างอิงส่วนใหญ่ไม่ได้ครอบคลุมทุกชนิดภายในกลุ่มสิ่งมีชีวิต และมีการสร้างรายการใหม่อย่างต่อเนื่อง ในกรณีของสิ่งมีชีวิตขนาดใหญ่และจุลินทรีย์จำนวนมาก (เช่น สาหร่าย) ห้องสมุดอ้างอิงเหล่านี้ต้องการเอกสารรายละเอียด (สถานที่และวันที่เก็บตัวอย่าง ผู้ที่เก็บตัวอย่าง ภาพ ฯลฯ) และการระบุอนุกรมวิธานที่เชื่อถือได้ของตัวอย่างอ้างอิง ตลอดจนการส่งลำดับในรูปแบบเฉพาะ อย่างไรก็ตาม มาตรฐานดังกล่าวได้รับการปฏิบัติตามสำหรับเพียงจำนวนเล็กน้อยของสายพันธุ์เท่านั้น กระบวนการนี้ยังต้องการการจัดเก็บตัวอย่างอ้างอิงในคอลเลกชันของพิพิธภัณฑ์ หอพรรณไม้ และสถาบันที่ร่วมมือกันอื่นๆ ทั้งความครอบคลุมทางอนุกรมวิธานและคุณภาพของเนื้อหามีความสำคัญต่อความถูกต้องในการระบุ^{[ 33 ]}ในโลกของจุลินทรีย์ ไม่มีข้อมูล DNA สำหรับชื่อสายพันธุ์ส่วนใหญ่ และลำดับ DNA จำนวนมากไม่สามารถกำหนดให้กับชื่อทวินามของลินเนียสได้^{[ 34 ]}มีฐานข้อมูลอ้างอิงหลายแห่งขึ้นอยู่กับกลุ่มสิ่งมีชีวิตและเครื่องหมายทางพันธุกรรมที่ใช้ มีฐานข้อมูลขนาดเล็กในระดับประเทศ (เช่น FinBOL) และกลุ่มความร่วมมือขนาดใหญ่ เช่น โครงการบาร์โค้ดแห่งชีวิตระหว่างประเทศ (iBOL) ^{[ 35 ]}

ระบบข้อมูลบาร์โค้ดของสิ่งมีชีวิต (BOLD) ^{[ 36 ]}ซึ่งเปิดตัวในปี 2550 เป็นหนึ่งในฐานข้อมูลที่ใหญ่ที่สุด โดยมี BIN (Barcode Index Number) ประมาณ 780,000 รายการในปี 2565 เป็นแหล่งเก็บข้อมูลที่เข้าถึงได้ฟรีสำหรับบันทึกตัวอย่างและลำดับสำหรับการศึกษาบาร์โค้ด และยังเป็นเวิร์กเบนช์ที่ช่วยในการจัดการ การประกันคุณภาพ และการวิเคราะห์ข้อมูลบาร์โค้ด ฐานข้อมูลส่วนใหญ่ประกอบด้วยบันทึก BIN สำหรับสัตว์โดยอิงจากเครื่องหมายทางพันธุกรรม COI สำหรับการระบุพืช BOLD ยอมรับลำดับจาก matKและrbcL

ฐานข้อมูล UNITE ^{[ 37 ]}เปิดตัวในปี 2546 และเป็นฐานข้อมูลอ้างอิงสำหรับการระบุชนิดของเชื้อรา (และตั้งแต่ปี 2561 เป็นต้นมารวมถึงยูคาริโอตทั้งหมด) ในระดับโมเลกุลโดยใช้บริเวณเครื่องหมายทางพันธุกรรมของตัวเว้นวรรคที่ถอดรหัสภายในของไรโบโซมในนิวเคลียส (ITS) ฐานข้อมูลนี้ใช้แนวคิดสมมติฐานของสายพันธุ์เป็นพื้นฐาน โดยคุณเลือกเปอร์เซ็นต์ที่คุณต้องการทำงาน และลำดับจะถูกจัดเรียงตามการเปรียบเทียบกับลำดับที่ได้จากตัวอย่างอ้างอิงที่ระบุโดยผู้เชี่ยวชาญ

Diat.barcode เป็นฐานข้อมูลสำหรับไดอะตอม^{[ 38 ]}เผยแพร่ครั้งแรกภายใต้ชื่อ R-syst::diatom ^{[ 39 ]}ในปี 2016 โดยเริ่มต้นจากข้อมูลจากสองแหล่ง ได้แก่ คอลเลกชันวัฒนธรรม Thonon (TCC) ในสถานีอุทกชีววิทยาของสถาบันวิจัยการเกษตรแห่งชาติฝรั่งเศส (INRA) และจากฐานข้อมูลนิวคลีโอไทด์ของ NCBI ( ศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ ) Diat.barcode ให้ข้อมูลสำหรับเครื่องหมายทางพันธุกรรมสองตัว ได้แก่ rbcL (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, คลอโรพลาสต์) และ 18S (18S ribosomal RNA, นิวเคลียร์) ฐานข้อมูลนี้ยังรวมถึงข้อมูลลักษณะเพิ่มเติมของสายพันธุ์ เช่น ลักษณะทางสัณฐานวิทยา (ปริมาตรชีวภาพ ขนาด ฯลฯ) รูปแบบชีวิต (การเคลื่อนที่ ประเภทของโคโลนี ฯลฯ) หรือคุณลักษณะทางนิเวศวิทยา (ความไวต่อมลพิษ ฯลฯ)

เพื่อให้ได้ข้อมูลที่มีโครงสร้างดี สะอาด และตีความได้ ข้อมูลลำดับดีเอ็นเอแบบดิบต้องได้รับการประมวลผลโดยใช้การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศ ไฟล์ FASTQที่มีข้อมูลลำดับดีเอ็นเอประกอบด้วยข้อมูลสองประเภท ได้แก่ ลำดับที่ตรวจพบในตัวอย่าง ( ไฟล์ FASTA ) และไฟล์คุณภาพที่มีคะแนนคุณภาพ ( คะแนน PHRED ) ที่เกี่ยวข้องกับนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวของลำดับดีเอ็นเอแต่ละลำดับ คะแนน PHRED บ่งชี้ถึงความน่าจะเป็นที่นิวคลีโอไทด์ที่เกี่ยวข้องได้รับการให้คะแนนอย่างถูกต้อง

โดยทั่วไป ค่า PHRED จะลดลงเมื่อเข้าใกล้ส่วนท้ายของลำดับดีเอ็นเอ ดังนั้น กระบวนการทางชีวสารสนเทศบางอย่างจึงตัดส่วนท้ายของลำดับที่ค่าเกณฑ์ที่กำหนดไว้

เทคโนโลยีการจัดลำดับดีเอ็นเอบางชนิด เช่น MiSeq ใช้การจัดลำดับแบบคู่ปลาย (paired-end sequencing) ซึ่งทำการจัดลำดับจากทั้งสองทิศทาง ทำให้ได้คุณภาพที่ดีกว่า จากนั้นจึงนำลำดับที่ซ้อนทับกันมาจัดเรียงเป็นคอนติ๊ก (contigs) และรวมเข้าด้วยกัน โดยปกติแล้ว จะมีการรวมตัวอย่างหลายตัวอย่างในการวิเคราะห์ครั้งเดียว และแต่ละตัวอย่างจะถูกระบุด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอสั้นๆ ที่เรียกว่าแท็ก ในขั้นตอนการแยกตัวอย่าง (demultiplexing) ลำดับจะถูกจัดเรียงโดยใช้แท็กเหล่านี้เพื่อประกอบตัวอย่างที่แยกจากกันอีกครั้ง ก่อนการวิเคราะห์เพิ่มเติม แท็กและอะแดปเตอร์อื่นๆ จะถูกลบออกจากชิ้นส่วนดีเอ็นเอของลำดับบาร์โค้ด ในระหว่างการตัดแต่ง (trimming) ลำดับที่มีคุณภาพต่ำ (คะแนน PHRED ต่ำ) หรือลำดับที่สั้นหรือยาวกว่าบาร์โค้ดดีเอ็นเอเป้าหมายมาก จะถูกลบออก ขั้นตอนการกำจัดข้อมูลซ้ำ (dereplication) ต่อไปคือกระบวนการที่ลำดับที่ผ่านการกรองคุณภาพทั้งหมดจะถูกรวมเข้าเป็นชุดของข้อมูลอ่านที่ไม่ซ้ำกัน (หน่วยลำดับแต่ละหน่วย ISU) พร้อมข้อมูลความอุดมสมบูรณ์ในตัวอย่าง หลังจากนั้น จะตรวจจับและลบไคเมรา (chimeras) (เช่น ลำดับผสมที่เกิดจากชิ้นส่วนที่มีต้นกำเนิดต่างกัน) ออก สุดท้าย ลำดับจะถูกจัดกลุ่มเป็น OTU (หน่วยอนุกรมวิธานปฏิบัติการ) โดยใช้กลยุทธ์การจัดกลุ่มหลายวิธี ซอฟต์แวร์ชีวสารสนเทศที่ใช้บ่อยที่สุด ได้แก่ Mothur ^{[ 40 ]} Uparse ^{[ 41 ]} Qiime ^{[ 42 ]} Galaxy ^{[ 43 ]} Obitools ^{[ 44 ]} JAMP ^{[ 45 ]} Barque ^{[ 46 ]}และ DADA2 ^{[ 47 ]}

การเปรียบเทียบความอุดมสมบูรณ์ของลำดับการอ่านระหว่างตัวอย่างต่างๆ ยังคงเป็นเรื่องท้าทาย เนื่องจากทั้งจำนวนลำดับการอ่านทั้งหมดในตัวอย่างและปริมาณลำดับการอ่านสัมพัทธ์สำหรับสายพันธุ์หนึ่งๆ อาจแตกต่างกันไปตามตัวอย่าง วิธีการ หรือตัวแปรอื่นๆ ในการเปรียบเทียบ อาจใช้วิธีลดจำนวนลำดับการอ่านของแต่ละตัวอย่างให้เหลือจำนวนลำดับการอ่านขั้นต่ำของตัวอย่างที่จะนำมาเปรียบเทียบ ซึ่งเป็นกระบวนการที่เรียกว่า rarefaction อีกวิธีหนึ่งคือการใช้ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของลำดับการอ่าน^{[ 48 ]}

การกำหนดอนุกรมวิธานของ OTU ให้กับสปีชีส์ทำได้โดยการจับคู่ลำดับกับไลบรารีอ้างอิง โดยทั่วไปจะใช้ เครื่องมือค้นหาการจัดเรียงตำแหน่งพื้นฐาน (BLAST)เพื่อระบุบริเวณที่มีความคล้ายคลึงกันระหว่างลำดับโดยการเปรียบเทียบลำดับที่อ่านจากตัวอย่างกับลำดับในฐานข้อมูลอ้างอิง^{[ 49 ]}

หากฐานข้อมูลค้นหาพบข้อมูลที่ตรงกับลำดับดีเอ็นเอที่ต้องการอย่างแม่นยำ ก็สามารถระบุชนิดได้ในระดับสายพันธุ์ นอกจากนี้ ข้อมูลที่มีความคล้ายคลึงกันสูงก็อาจถือว่าเป็นชนิดเดียวกันได้ ขึ้นอยู่กับหลักเกณฑ์ของแต่ละกลุ่มอนุกรมวิธาน

หากไม่มีการจับคู่ที่คล้ายคลึงกันเพียงพอ การระบุในระดับอนุกรมวิธานที่สูงขึ้น เช่น วงศ์หรือชั้น อาจเป็นไปได้โดยพิจารณาการจับคู่ที่ส่งคืนเป็น "จุดยึด" ทางอนุกรมวิธาน ลำดับอาจถูกกำหนดให้กับหน่วยอนุกรมวิธานปฏิบัติการ (OTU) เฉพาะ ซึ่งหากรวมกับวิธีการทางอนุกรมวิธานอื่นๆ สามารถใช้เพื่ออธิบายอนุกรมวิธานใหม่และกลายเป็นรายการใหม่ในฐานข้อมูล การสร้างแผนภูมิวิวัฒนาการของลำดับตัวอย่างและลำดับที่ตรงกันมักจะช่วยให้เข้าใจบริบทของการจับคู่ได้ดีขึ้น^{[ 50 ]}

ในกลุ่มสิ่งมีชีวิตบางกลุ่ม เช่น แบคทีเรีย การจัดจำแนกทางอนุกรมวิธานถึงระดับสปีชีส์มักเป็นไปไม่ได้ เนื่องจากมีสปีชีส์ที่ยังไม่ได้รับการอธิบายและสปีชีส์ที่ไม่รู้จักอยู่เป็นจำนวนมาก ดูเพิ่มเติมที่ กลุ่มอนุกรมวิธานที่ไม่ชัดเจน (dark taxa )

BLAST เป็นวิธีการค้นหาลำดับที่คล้ายคลึงกันแบบง่ายๆ วิธีนี้ช้า มีอัตราการเกิดผลบวกเท็จสูง และผลลัพธ์ที่ดีที่สุดอาจไม่ใช่เพื่อนบ้านทางวิวัฒนาการเสมอไป วิธีการที่ได้รับการปรับปรุง ได้แก่ ตัวจำแนกแบบ Naive BayesและRandom Forestที่ฝึกฝนบนฐานข้อมูลของยีนเครื่องหมาย ตัวจำแนกที่ฝึกฝนไว้ล่วงหน้ามีให้ใช้งานสำหรับบาร์โค้ดหลายประเภท เช่น16S ของโปรคาริโอต CO1 ของอาร์โทรพอดและ LSU ของเชื้อรา^{[ 51 ]}

การประยุกต์ใช้บาร์โค้ดดีเอ็นเอ ได้แก่ การระบุชนิดพันธุ์ ใหม่ การประเมินความปลอดภัยของอาหาร การระบุและการประเมินชนิดพันธุ์ที่ซ่อนเร้น การตรวจจับชนิดพันธุ์ต่างถิ่น การระบุชนิดพันธุ์ที่ใกล้สูญพันธุ์และถูกคุกคาม^{[ 52 ]}การเชื่อมโยงระยะไข่และตัวอ่อนกับชนิดพันธุ์ที่โตเต็มวัย การรักษาไว้ซึ่งสิทธิในทรัพย์สินทางปัญญาสำหรับทรัพยากรชีวภาพ การวางแผนการจัดการระดับโลกสำหรับกลยุทธ์การอนุรักษ์ การอธิบายช่องว่างทางการกิน^{[ 53 ]}และนิติวิทยาศาสตร์^{[ 54 ]}เครื่องหมายบาร์โค้ดดีเอ็นเอสามารถนำไปใช้เพื่อตอบคำถามพื้นฐานในด้านอนุกรมวิธานนิเวศวิทยาชีววิทยาวิวัฒนาการและการอนุรักษ์รวมถึงการประกอบชุมชน เครือ ข่าย ปฏิสัมพันธ์ของชนิดพันธุ์การค้นพบทางอนุกรมวิธาน และการประเมินพื้นที่สำคัญสำหรับ การ ปกป้อง สิ่งแวดล้อม

ลำดับดีเอ็นเอสั้นเฉพาะหรือเครื่องหมายจากบริเวณมาตรฐานของจีโนมสามารถให้บาร์โค้ดดีเอ็นเอสำหรับการระบุชนิดได้^{[ 55 ]}วิธีการทางโมเลกุลมีประโยชน์อย่างยิ่งเมื่อวิธีการแบบดั้งเดิมไม่สามารถนำมาใช้ได้ บาร์โค้ดดีเอ็นเอมีประโยชน์อย่างมากในการระบุตัวอ่อนซึ่งโดยทั่วไปมีลักษณะเฉพาะในการวินิจฉัยน้อย และในการเชื่อมโยงระยะชีวิตที่แตกต่างกัน (เช่น ตัวอ่อนและตัวเต็มวัย) ในสัตว์หลายชนิด^{[ 56 ]}การระบุชนิดที่อยู่ในภาคผนวกของอนุสัญญาว่าด้วยการค้าสัตว์ป่าและพืชที่ใกล้สูญพันธุ์ระหว่างประเทศ ( CITES ) โดยใช้เทคนิคบาร์โค้ดถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบการค้าที่ผิดกฎหมาย^{[ 57 ]}

สามารถตรวจจับสิ่งมีชีวิตต่างถิ่น ได้โดยใช้บาร์โค้ด ^{[ 58 ] [ 59 ]}บาร์โค้ดเหมาะสำหรับการตรวจจับสิ่งมีชีวิต เช่น การควบคุมชายแดน ซึ่งการระบุลักษณะทางสัณฐานวิทยาอย่างรวดเร็วและแม่นยำมักเป็นไปไม่ได้เนื่องจากความคล้ายคลึงกันระหว่างสิ่งมีชีวิตต่างชนิด ขาดลักษณะเฉพาะในการวินิจฉัยที่เพียงพอ^{[ 58 ]}และ/หรือขาดความเชี่ยวชาญด้านอนุกรมวิธาน บาร์โค้ดและเมตาบาร์โค้ดสามารถใช้เพื่อคัดกรองระบบนิเวศสำหรับสิ่งมีชีวิตรุกราน และเพื่อแยกแยะระหว่างสิ่งมีชีวิตรุกรานกับสิ่งมีชีวิตพื้นเมืองที่มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาคล้ายคลึงกัน^{[ 60 ]}ประสิทธิภาพสูงของการระบุดีเอ็นเอแสดงให้เห็นเมื่อเทียบกับการตรวจสอบการรุกรานทางชีวภาพแบบดั้งเดิม^{[ 61 ]}

การระบุรหัสดีเอ็นเอช่วยให้สามารถระบุและจำแนกชนิดพันธุ์ที่ซ่อนเร้นได้ [ ^{62 ] อย่างไรก็ตาม}ผลลัพธ์ของการวิเคราะห์การระบุรหัสดีเอ็นเอขึ้นอยู่กับการเลือกวิธีการวิเคราะห์ ดังนั้นกระบวนการกำหนดขอบเขตของชนิดพันธุ์ที่ซ่อนเร้นโดยใช้รหัสดีเอ็นเอจึงอาจมีความเป็นอัตวิสัยได้เช่นเดียวกับอนุกรมวิธาน รูปแบบอื่นๆ Hebert et al. (2004) สรุปว่าผีเสื้อAstraptes fulgeratorในภาคตะวันตกเฉียงเหนือของคอสตาริกาประกอบด้วย 10 ชนิดพันธุ์ที่แตกต่างกัน^{[ 63 ]}อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์เหล่านี้ถูกท้าทายในภายหลังโดย Brower (2006) ซึ่งชี้ให้เห็นข้อบกพร่องร้ายแรงหลายประการในการวิเคราะห์ และสรุปว่าข้อมูลดั้งเดิมสามารถสนับสนุนความเป็นไปได้ของอนุกรมวิธาน ที่ซ่อนเร้นได้ไม่เกินสามถึงเจ็ดกลุ่ม แทนที่จะเป็นสิบชนิดพันธุ์ที่ซ่อนเร้น^{[ 64 ]} Smith et al. (2007) ใช้บาร์โค้ดดีเอ็นเอ ไซโตโครม ซีออกซิเดส I สำหรับการระบุชนิดของแมลงวันปรสิตBelvosia 20 ชนิด ( Diptera : Tachinidae ) ที่เลี้ยงจากหนอนผีเสื้อ ( Lepidoptera ) ในพื้นที่อนุรักษ์กัวนาคาสเต (ACG) ทางตะวันตกเฉียงเหนือของคอสตาริกา ผู้เขียนเหล่านี้ค้นพบว่าการใช้บาร์โค้ดช่วยเพิ่มจำนวนชนิดเป็น 32 ชนิด โดยเผยให้เห็นว่าปรสิต ทั้งสาม ชนิดที่เคยถูกพิจารณาว่าเป็นปรสิตทั่วไปนั้น แท้จริงแล้วเป็นกลุ่มของชนิดที่จำเพาะต่อโฮสต์สูง^{[ 65 ]}สำหรับหนอนปล้อง 15 ชนิด ในพื้นทะเล ลึกของ แอนตาร์กติกา ที่ศึกษาผ่านบาร์โค้ดดีเอ็นเอ พบความหลากหลายที่ซ่อนเร้นใน 50% ของกรณี นอกจากนี้ยังตรวจพบหนอนปล้องที่ถูกมองข้ามไปก่อนหน้านี้ 10 ชนิด ซึ่งเพิ่ม ความหลากหลายของชนิดทั้งหมดในตัวอย่างขึ้น 233% ^{[ 66 ]}ในทำนองเดียวกัน การศึกษาการระบุรหัสดีเอ็นเอของสัตว์เลื้อยคลานในโซโคตรานได้เปิดเผยความแตกต่างภายในชนิดที่สูงเกินคาดในหลายกลุ่มอนุกรมวิธาน และประมาณการว่าความหลากหลายของชนิดอาจถูกประเมินต่ำกว่าความเป็นจริง 13.8–54.4% ^{[ 67 ]}

การทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอและเมตาบาร์โค้ดมีประโยชน์ในการศึกษาวิเคราะห์อาหาร^{[ 68 ]}และโดยทั่วไปจะใช้ในกรณีที่ไม่สามารถระบุตัวอย่างเหยื่อได้จากลักษณะทางสัณฐานวิทยา^{[ 69 ] [ 70 ]}มีวิธีการสุ่มตัวอย่างที่หลากหลายในการวิเคราะห์อาหาร: การทำเมตาบาร์โค้ดดีเอ็นเอสามารถทำได้กับเนื้อหาในกระเพาะอาหาร^{[ 71 ]}อุจจาระ^{[ 70 ] [ 72 ]}น้ำลาย^{[ 73 ]}หรือการวิเคราะห์ทั้งตัว^{[ 52 ] [ 74 ]}ในตัวอย่างอุจจาระหรือเนื้อหาในกระเพาะอาหารที่ย่อยแล้วอย่างมาก มักจะไม่สามารถแยกแยะเนื้อเยื่อจากสายพันธุ์เดียวได้ ดังนั้นจึงสามารถใช้เมตาบาร์โค้ดแทนได้^{[ 70 ] [ 75 ]}อุจจาระหรือน้ำลายเป็นวิธีการเก็บตัวอย่างที่ไม่รุกราน ในขณะที่การวิเคราะห์ทั้งตัวมักหมายความว่าต้องฆ่าสัตว์ตัวนั้นก่อน สำหรับสิ่งมีชีวิตขนาดเล็ก การจัดลำดับเนื้อหาในกระเพาะอาหารมักจะทำโดยการจัดลำดับสัตว์ทั้งตัว

การระบุรหัสดีเอ็นเอถือเป็นเครื่องมือสำคัญในการประเมินคุณภาพของผลิตภัณฑ์อาหาร จุดประสงค์คือเพื่อรับประกันการตรวจสอบย้อนกลับของอาหาร ลดการลักลอบขโมยอาหาร และประเมินคุณค่าของการผลิตอาหารเกษตรในท้องถิ่นและทั่วไป อีกจุดประสงค์หนึ่งคือการปกป้องสุขภาพของประชาชน ตัวอย่างเช่น เมตาบาร์โค้ดดิ้งเปิดโอกาสให้ระบุ ปลา เกรปเปอร์ที่ก่อให้เกิด พิษปลา ซิกัวเทราจากเศษอาหาร^{[ 76 ]}หรือแยกเห็ดพิษออกจากเห็ดที่กินได้ (อ้างอิง)

การระบุชนิดพันธุ์ด้วยดีเอ็นเอ (DNA barcoding) สามารถนำมาใช้ประเมินการมีอยู่ของชนิดพันธุ์ที่ใกล้สูญพันธุ์เพื่อการอนุรักษ์ (อ้างอิง) หรือการมีอยู่ของชนิดพันธุ์ที่เป็นตัวบ่งชี้ที่สะท้อนถึงสภาวะทางนิเวศวิทยาเฉพาะ (อ้างอิง) ตัวอย่างเช่น สารอาหารส่วนเกินหรือระดับออกซิเจนต่ำ

การระบุชนิดด้วยดีเอ็นเอ (DNA barcoding) มักใช้สำหรับการระบุสายพันธุ์ใน คดี ทางนิติวิทยาศาสตร์ตัวอย่างสัตว์หรือพืชที่ไม่ทราบชนิดในที่เกิดเหตุสามารถค้นพบ รวบรวม และระบุได้ โดยหวังว่าจะเชื่อมโยงกับผู้ต้องสงสัยและนำไปสู่การตัดสินลงโทษ^{[ 77 ]}การล่าสัตว์การฆ่าสัตว์ใกล้สูญพันธุ์ และการทารุณกรรมสัตว์ เป็นตัวอย่างของอาชญากรรมที่ใช้การระบุชนิดด้วยดีเอ็นเอ เนื่องจากมักพบดีเอ็นเอของสัตว์^{[ 54 ] [ 78 ]}ในทางกลับกัน ดีเอ็นเอของพืชมักใช้เป็นหลักฐานติดตามเพื่อเชื่อมโยงผู้ต้องสงสัยกับที่เกิดเหตุ^{[ 79 ]}

วิธีการประเมินทางชีวภาพแบบดั้งเดิมเป็นที่ยอมรับในระดับสากลและใช้ในการติดตามทางชีวภาพได้ดี เช่น การประเมินทางชีวภาพทางน้ำภายใต้ข้อกำหนดของสหภาพยุโรปWFDและMSFDอย่างไรก็ตาม การระบุรหัสดีเอ็นเอสามารถปรับปรุงวิธีการแบบดั้งเดิมได้ด้วยเหตุผลดังต่อไปนี้ (i) การระบุรหัสดีเอ็นเอสามารถเพิ่มความละเอียดทางอนุกรมวิธานและทำให้การระบุอนุกรมวิธานที่ยากต่อการระบุหรือขาดผู้เชี่ยวชาญมีความสอดคล้องกัน (ii) สามารถเชื่อมโยงปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมกับอนุกรมวิธานเฉพาะได้อย่างแม่นยำ/เที่ยงตรงมากขึ้น (iii) สามารถเพิ่มความสามารถในการเปรียบเทียบระหว่างภูมิภาค (iv) อนุญาตให้รวมระยะชีวิตช่วงต้นและตัวอย่างที่แตกหัก (v) อนุญาตให้กำหนดขอบเขตของชนิดพันธุ์ที่ซ่อนเร้น /หายาก (vi) อนุญาตให้พัฒนาตัวชี้วัดใหม่ เช่น ชนิดพันธุ์ที่หายาก/ซ่อนเร้นซึ่งอาจมีความไว/ทนต่อ ความเครียด (vii) เพิ่มจำนวนตัวอย่างที่สามารถประมวลผลได้และลดเวลาในการประมวลผล ส่งผลให้ความรู้เกี่ยวกับนิเวศวิทยาของชนิดพันธุ์เพิ่มขึ้น (viii) เป็นวิธีการติดตามที่ไม่รุกรานเมื่อใช้วิธีeDNA ^{[ 80 ]}

การทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอเร็วกว่าวิธีการทางสัณฐานวิทยาแบบดั้งเดิม ตั้งแต่การฝึกอบรมไปจนถึงการจำแนกทางอนุกรมวิธาน ใช้เวลาน้อยกว่าในการฝึกฝนให้เชี่ยวชาญวิธีการทางดีเอ็นเอมากกว่าการเป็นผู้เชี่ยวชาญด้านอนุกรมวิธาน นอกจากนี้ กระบวนการทำงานของการทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอ (เช่น จากตัวอย่างไปจนถึงผลลัพธ์) โดยทั่วไปจะเร็วกว่ากระบวนการทำงานทางสัณฐานวิทยาแบบดั้งเดิม และช่วยให้สามารถประมวลผลตัวอย่างได้มากขึ้น

การทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอช่วยให้สามารถจำแนกกลุ่มสิ่งมีชีวิตจากระดับอนุกรมวิธานที่สูงขึ้น (เช่น วงศ์) ไปจนถึงระดับอนุกรมวิธานที่ต่ำกว่า (เช่น ชนิด) ซึ่งยากเกินกว่าจะระบุได้ด้วยวิธีการทางสัณฐานวิทยาแบบดั้งเดิม เช่น การระบุด้วยกล้องจุลทรรศน์ ตัวอย่างเช่นชิโรโนมิด (ริ้นที่ไม่กัด) มีการกระจายตัวอย่างกว้างขวางในระบบนิเวศทั้งบนบกและในน้ำจืด ความหลากหลายและความอุดมสมบูรณ์ของพวกมันทำให้พวกมันมีความสำคัญต่อกระบวนการและเครือข่ายทางนิเวศวิทยา และพวกมันเป็นหนึ่งในกลุ่มสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังหลายกลุ่มที่ใช้ในการตรวจสอบทางชีวภาพ ตัวอย่างสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังอาจมีชิโรโนมิดมากถึง 100 ชนิด ซึ่งมักคิดเป็นสัดส่วนมากถึง 50% ของตัวอย่าง แม้จะเป็นเช่นนั้น แต่โดยปกติแล้วจะไม่สามารถระบุได้ต่ำกว่าระดับวงศ์เนื่องจากต้องใช้ความเชี่ยวชาญทางอนุกรมวิธานและเวลา^{[ 81 ]}ซึ่งอาจส่งผลให้ชิโรโนมิดชนิดต่างๆ ที่มีความชอบทางนิเวศวิทยาที่แตกต่างกันถูกจัดกลุ่มเข้าด้วยกัน ส่งผลให้การประเมินคุณภาพน้ำไม่ถูกต้อง

การทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอเปิดโอกาสให้สามารถจำแนกกลุ่มสิ่งมีชีวิต และเชื่อมโยงผลกระทบของปัจจัยความเครียดกับกลุ่มสิ่งมีชีวิตเฉพาะ เช่น ชนิดของแมลงริ้นน้ำแต่ละชนิดได้โดยตรง ตัวอย่างเช่น Beermann et al. (2018) ได้ทำการทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอให้กับ Chironomidae เพื่อตรวจสอบการตอบสนองต่อปัจจัยความเครียดหลายอย่าง ได้แก่ การไหลลดลง ตะกอนละเอียดเพิ่มขึ้น และความเค็มเพิ่มขึ้น^{[ 82 ]}หลังจากทำบาร์โค้ดแล้ว พบว่าตัวอย่างแมลงริ้นน้ำประกอบด้วยหน่วยอนุกรมวิธานปฏิบัติการ (OTUs) จำนวน 183 หน่วย ซึ่งก็คือบาร์โค้ด (ลำดับ) ที่มักจะเทียบเท่ากับชนิดทางสัณฐานวิทยา OTUs ทั้ง 183 หน่วยนี้แสดงการตอบสนอง 15 รูปแบบ แทนที่จะเป็นการตอบสนอง 2 รูปแบบตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้^{[ 83 ]} เมื่อแมลงริ้นน้ำทั้งหมดถูกจัดกลุ่มเข้าด้วยกันในการศึกษาปัจจัยความเครียดหลายอย่างเดียวกัน แนวโน้มที่คล้ายกันนี้ถูกค้นพบในการศึกษาของ Macher et al. (2016) ซึ่งค้นพบความหลากหลายที่ซ่อนเร้นภายในแมลงชีปะขาวชนิด Deleatidium sp .ของนิวซีแลนด์การศึกษานี้พบรูปแบบการตอบสนองที่แตกต่างกันของ OTU โมเลกุล 12 ชนิดต่อปัจจัยที่ก่อให้เกิดความเครียด ซึ่งอาจเปลี่ยนแปลงฉันทามติที่ว่าแมลงชีปะขาวชนิดนี้ไวต่อมลพิษ^{[ 84 ]}

แม้ว่าการระบุรหัสดีเอ็นเอจะมีข้อดีหลายประการ แต่ก็มีข้อเสนอแนะว่าการระบุรหัสดีเอ็นเอควรใช้เป็นส่วนเสริมของวิธีการทางสัณฐานวิทยาแบบดั้งเดิมเท่านั้น^{[ 80 ]}ข้อแนะนำนี้ขึ้นอยู่กับความท้าทายที่รับรู้ได้หลายประการ

การเชื่อมโยงบาร์โค้ดดีเอ็นเอกับลักษณะทางนิเวศวิทยาของสิ่งมีชีวิตเป้าหมายนั้นไม่ใช่เรื่องง่ายอย่างที่คิด ซึ่งเป็นสิ่งจำเป็นหากจะนำบาร์โค้ดไปใช้ในการเฝ้าระวังทางชีวภาพ ตัวอย่างเช่น การตรวจจับดีเอ็นเอเป้าหมายในระบบนิเวศทางน้ำขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของโมเลกุลดีเอ็นเอในบริเวณนั้น ซึ่งอาจได้รับผลกระทบจากหลายปัจจัย การมีอยู่ของโมเลกุลดีเอ็นเอยังขึ้นอยู่กับการกระจายตัวในบริเวณนั้นด้วย เช่น ทิศทางหรือความแรงของกระแสน้ำ ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัดว่าดีเอ็นเอเคลื่อนที่อย่างไรในลำธารและทะเลสาบ ทำให้การเก็บตัวอย่างทำได้ยาก อีกปัจจัยหนึ่งอาจเป็นพฤติกรรมของสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย เช่น ปลาอาจมีการเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนไหวตามฤดูกาล กุ้งหรือหอยจะปล่อยดีเอ็นเอออกมาในปริมาณมากในช่วงเวลาใดเวลาหนึ่งของชีวิต (ลอกคราบ วางไข่) สำหรับดีเอ็นเอในดินนั้น ข้อมูลเกี่ยวกับการกระจายตัว ปริมาณ หรือคุณภาพของดีเอ็นเอยังมีน้อยมาก

ข้อจำกัดที่สำคัญของวิธีการบาร์โค้ดคือ การพึ่งพาห้องสมุดอ้างอิงบาร์โค้ดสำหรับการระบุอนุกรมวิธานของลำดับ การระบุอนุกรมวิธานจะถูกต้องก็ต่อเมื่อมีข้อมูลอ้างอิงที่เชื่อถือได้เท่านั้น อย่างไรก็ตาม ฐานข้อมูลส่วนใหญ่ยังไม่สมบูรณ์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับสิ่งมีชีวิตขนาดเล็ก เช่น เชื้อรา แพลงก์ตอนพืช ไส้เดือนฝอย เป็นต้น นอกจากนี้ ฐานข้อมูลปัจจุบันยังมีการระบุผิดพลาด การสะกดผิด และข้อผิดพลาดอื่นๆ มีความพยายามอย่างมากในการดูแลและทำให้ฐานข้อมูลสมบูรณ์สำหรับสิ่งมีชีวิตทั้งหมดที่จำเป็น โดยเกี่ยวข้องกับโครงการบาร์โค้ดขนาดใหญ่ (ตัวอย่างเช่น โครงการ iBOL สำหรับฐานข้อมูลอ้างอิง Barcode of Life Data Systems (BOLD)) ^{[ 85 ] [ 86 ]}อย่างไรก็ตาม การทำให้สมบูรณ์และการดูแลนั้นยากและใช้เวลานาน หากไม่มีตัวอย่างที่ได้รับการรับรอง ก็ไม่สามารถแน่ใจได้ว่าลำดับที่ใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงนั้นถูกต้องหรือไม่

ฐานข้อมูลลำดับดีเอ็นเอ เช่นGenBankมีลำดับจำนวนมากที่ไม่ได้เชื่อมโยงกับตัวอย่างอ้างอิง (เช่น ตัวอย่างจากพิพิธภัณฑ์พืช เซลล์เพาะเลี้ยง หรือบางครั้งก็เป็นภาพ) ซึ่งเป็นปัญหาเมื่อเผชิญกับประเด็นทางอนุกรมวิธาน เช่น ควรแยกหรือรวมหลายชนิดเข้าด้วยกัน หรือการระบุชนิดในอดีตนั้นถูกต้องหรือไม่ การนำลำดับที่ไม่เชื่อมโยงกับตัวอย่างอ้างอิงของสิ่งมีชีวิตที่ระบุผิดในตอนแรกมาใช้ซ้ำ อาจสนับสนุนข้อสรุปที่ไม่ถูกต้องและต้องหลีกเลี่ยง^{[ 87 ]}ดังนั้น วิธีปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการทำบาร์โค้ดดีเอ็นเอคือการจัดลำดับตัวอย่างอ้างอิง^{[ 88 ] [ 89 ]}อย่างไรก็ตาม สำหรับอนุกรมวิธานจำนวนมาก อาจเป็นเรื่องยากที่จะได้รับตัวอย่างอ้างอิง เช่น ตัวอย่างที่จับได้ยาก ตัวอย่างที่มีอยู่ได้รับการอนุรักษ์ไม่ดี หรือขาดความเชี่ยวชาญทางอนุกรมวิธานที่เพียงพอ^{[ 87 ]}

ที่สำคัญ บาร์โค้ด DNA ยังสามารถใช้สร้างอนุกรมวิธานชั่วคราวได้ ซึ่งในกรณีนี้ OTU สามารถใช้แทนชื่อวิทยาศาสตร์แบบละตินดั้งเดิมได้ จึงช่วยลดการพึ่งพาฐานข้อมูลอ้างอิงที่มีข้อมูลครบถ้วนได้อย่างมาก^{[ 90 ]}

การระบุรหัสดีเอ็นเอ (DNA barcoding) ยังมีความลำเอียงทางด้านวิธีการ ตั้งแต่การสุ่มตัวอย่างไปจนถึงการวิเคราะห์ข้อมูล ทางชีวสารสนเทศ

ตัวอย่างดีเอ็นเออาจปนเปื้อนด้วยสารยับยั้ง PCR ทำให้บางตัวอย่างแสดงผลบวกปลอม การทำ PCR ซ้ำมักจำเป็นเพื่อให้ได้ลำดับดีเอ็นเอที่มีคุณภาพและความไวสูง แต่ก็ทำให้ความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนเพิ่มขึ้นอย่างมาก

นอกจากความเสี่ยงของการปนเปื้อนของตัวอย่าง DNA ด้วยสารยับยั้ง PCR แล้ว อคติของไพรเมอร์ยังเป็นหนึ่งในแหล่งที่มาหลักของข้อผิดพลาดในการทำบาร์โค้ด DNA ^{[ 91 ] [ 92 ]}การแยกเครื่องหมาย DNA ที่มีประสิทธิภาพและการออกแบบไพรเมอร์เป็นกระบวนการที่ซับซ้อน และได้มีการพยายามอย่างมากในการพัฒนาไพรเมอร์สำหรับการทำบาร์โค้ด DNA ในกลุ่มอนุกรมวิธานต่างๆ แม้จะมีความพยายามนี้ แต่ก็ยังมีความเป็นไปได้ที่ไพรเมอร์จะไม่สามารถขยายลำดับที่แตกต่างกันอย่างไม่คาดคิดได้^{[ 93 ]}นอกจากนี้ ไพรเมอร์มักจะจับกับลำดับบางลำดับได้ดีกว่า ส่งผลให้ประสิทธิภาพและความจำเพาะของไพรเมอร์แตกต่างกัน และการประเมินชุมชนที่ไม่เป็นตัวแทนและการเพิ่มความหลากหลายของชนิดพันธุ์^{[ 94 ]}ดังนั้น องค์ประกอบของลำดับชุมชนในตัวอย่างจึงเปลี่ยนแปลงไปส่วนใหญ่ในขั้นตอน PCR

การศึกษาวิจัยหลายชิ้นได้ทดลองใช้วิธีการ "ปราศจาก PCR" เพื่อหลีกเลี่ยงอคติเหล่านี้ วิธีการหลักวิธีหนึ่งคือการใช้ตัวอย่างที่อุดมด้วยไมโทคอนเดรีย เพื่อให้ความเข้มข้นสูงของ DNA เป้าหมายทำให้ไม่จำเป็นต้องขยาย (ลำดับที่ยาวขึ้นที่ได้รับยังช่วยในการจำแนกอนุกรมวิธานด้วย) ^{[ 95 ] [ 96 ]}แต่ในปี 2018 เทคนิคเมตาบาร์โค้ด DNA หลักยังคงใช้การจัดลำดับแอมพลิคอนเป็นหลัก^{[ 93 ]}

อคติอื่นๆ เข้ามาเกี่ยวข้องในระหว่างกระบวนการจัดลำดับและการประมวลผลทางชีวสารสนเทศของลำดับเหล่านั้น เช่น การสร้างไคเมรา

แม้ว่าการใช้ DNA barcoding จะแพร่หลายและนำไปใช้มากขึ้น แต่ก็ยังไม่มีข้อตกลงเกี่ยวกับวิธีการเก็บรักษาหรือสกัด DNA การเลือกเครื่องหมาย DNA และชุดไพรเมอร์ หรือโปรโตคอล PCR พารามิเตอร์ของไปป์ไลน์ ชีวสารสนเทศ (เช่น การจัดกลุ่ม OTU อัลกอริทึมการกำหนดอนุกรมวิธาน หรือเกณฑ์ ฯลฯ) เป็นสาเหตุของการถกเถียงกันอย่างมากในหมู่ผู้ใช้ DNA barcoding ^{[ 93 ]}เทคโนโลยีการจัดลำดับก็กำลังพัฒนาอย่างรวดเร็วเช่นกัน พร้อมกับเครื่องมือสำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล DNA จำนวนมหาศาลที่สร้างขึ้น และจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องมีการกำหนดมาตรฐานของวิธีการเพื่อให้สามารถทำงานร่วมกันและแบ่งปันข้อมูลในระดับพื้นที่และเวลาที่กว้างขึ้น การกำหนดมาตรฐานของวิธีการ barcoding ในระดับยุโรปนี้เป็นส่วนหนึ่งของวัตถุประสงค์ของโครงการ COST Action DNAqua-net ของยุโรป^{[ 97 ]}และยังได้รับการกล่าวถึงโดย CEN (คณะกรรมการมาตรฐานแห่งยุโรป) ^{[ 98 ]}

ข้อวิจารณ์อีกประการหนึ่งของการใช้ดีเอ็นเอแบบบาร์โค้ดคือ ประสิทธิภาพที่จำกัดในการจำแนกความแตกต่างอย่างแม่นยำในระดับต่ำกว่าชนิด (เช่น การแยกแยะความแตกต่างระหว่างพันธุ์ย่อย) การตรวจจับลูกผสม และอัตราการวิวัฒนาการที่อาจส่งผลกระทบต่อวิธีการนี้

สิ่งสำคัญคือต้องทราบว่ารายการอนุกรมวิธานที่ได้จากการระบุแบบดั้งเดิม (ทางสัณฐานวิทยา) นั้นไม่สามารถเปรียบเทียบได้โดยตรงกับรายการอนุกรมวิธานที่ได้จากการระบุโดยใช้บาร์โค้ด เนื่องจากมีหลายสาเหตุ สาเหตุที่สำคัญที่สุดน่าจะเป็นความไม่สมบูรณ์และขาดความแม่นยำของฐานข้อมูลอ้างอิงโมเลกุล ซึ่งขัดขวางการกำหนดอนุกรมวิธานที่ถูกต้องของลำดับ eDNA อนุกรมวิธานที่ไม่มีอยู่ในฐานข้อมูลอ้างอิงจะไม่พบโดย eDNA และลำดับที่เชื่อมโยงกับชื่อที่ไม่ถูกต้องจะนำไปสู่การระบุที่ไม่ถูกต้อง^{[ 80 ]}สาเหตุอื่นๆ ที่ทราบกันดี ได้แก่ มาตราส่วนและขนาดของการสุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกันระหว่างตัวอย่างแบบดั้งเดิมและตัวอย่างโมเลกุล การวิเคราะห์สิ่งมีชีวิตที่ตายแล้ว ซึ่งอาจเกิดขึ้นได้หลายวิธีสำหรับทั้งสองวิธีขึ้นอยู่กับกลุ่มสิ่งมีชีวิต และการเลือกการระบุเฉพาะในแต่ละวิธี เช่น ความเชี่ยวชาญทางอนุกรมวิธานที่แตกต่างกัน หรือความเป็นไปได้ในการระบุกลุ่มสิ่งมีชีวิตบางกลุ่ม หรืออคติของไพรเมอร์ ซึ่งนำไปสู่การวิเคราะห์อนุกรมวิธานที่มีอคติได้เช่นกัน^{[ 80 ]}

โดย ทั่วไปแล้วบาร์โค้ดจะถูกเลือกเพื่อให้มีอัตราการกลายพันธุ์ที่เหมาะสมเพื่อกำหนดขอบเขตของสปีชีส์ แต่ไม่ได้หมายความว่าตำแหน่งบาร์โค้ดจะตรงกับประวัติของประชากรที่กลายเป็นสปีชีส์ที่แยกจากกันเสมอไป ในบางกรณี ตัวอย่างที่มีบาร์โค้ด DNA (COI) ที่เหมือนกันอย่างชัดเจนเป็นของสปีชีส์ที่แตกต่างกัน เช่น สปีชีส์ของปลาสกุลChromisกล่าวอีกนัยหนึ่ง สปีชีส์เหล่านี้มีแฮพลอไทป์เดียวกันสำหรับตำแหน่งบาร์โค้ดและยังไม่แยกออกจากกัน^{[ 99 ]}นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่ตำแหน่งจะแสดงการเรียงลำดับสายพันธุ์ที่ไม่สมบูรณ์ในเหตุการณ์การเกิดสปีชีส์บางอย่าง ซึ่งนำไปสู่การจัดกลุ่มที่ยากต่อการตีความ^{[ 100 ]}ตัวอย่างของ ILS ใน COI พบได้ในการศึกษาหลายตำแหน่งของMechanitisซึ่งการใช้หลายตำแหน่งช่วยเอาชนะปัญหานี้ได้^{[ 101 ]}

การใช้ตำแหน่งหลายตำแหน่งหรือลำดับที่ยาวขึ้นโดยทั่วไปจะช่วยปรับปรุงความละเอียด แม้ว่าสิ่งนี้มักจะมาพร้อมกับต้นทุนของการครอบคลุมฐานข้อมูลที่น้อยลงการกวาดจีโนมซึ่งไม่จำเป็นต้องใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาเป็นพิเศษ สามารถใช้เพื่อสร้างลำดับยาวสำหรับ DNA ที่มีจำนวนสำเนาสูง เช่น DNA ของไรโบโซมและออร์แกเนลล์^{[ 51 ]}

การทำบาร์โค้ดดีเอ็นเออาจทำให้ประเมินความหลากหลายของชนิดพันธุ์สูงเกินไปหรือต่ำเกินไป งานวิจัยบางชิ้นชี้ให้เห็นว่าสิ่งแปลกปลอม (การระบุชนิดพันธุ์ที่ไม่มีอยู่ในชุมชน) เป็นสาเหตุหลักของการประเมินความหลากหลายทางชีวภาพที่สูงเกินจริง^{[ 102 ] [ 103 ]}ปัญหาที่สำคัญที่สุดคือกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่มีจำนวนการอ่านลำดับต่ำ โดยปกติแล้วการอ่านเหล่านี้จะถูกลบออกในระหว่างกระบวนการกรองข้อมูล เนื่องจากงานวิจัยต่างๆ ชี้ให้เห็นว่าการอ่านที่มีความถี่ต่ำเหล่านี้ส่วนใหญ่อาจเป็นสิ่งแปลกปลอม^{[ 104 ]}อย่างไรก็ตาม กลุ่มสิ่งมีชีวิตที่หายากจริงๆ อาจมีอยู่ท่ามกลางการอ่านที่มีจำนวนน้อยเหล่านี้^{[ 105 ]}ลำดับที่หายากสามารถสะท้อนถึงสายพันธุ์เฉพาะในชุมชน ซึ่งทำให้ลำดับเหล่านั้นมีข้อมูลและมีคุณค่า ดังนั้นจึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งสำหรับอัลกอริทึมทางชีวสารสนเทศที่แข็งแกร่งกว่า ซึ่งช่วยให้สามารถแยกแยะระหว่างการอ่านที่มีข้อมูลและสิ่งแปลกปลอมได้ ห้องสมุดอ้างอิงที่สมบูรณ์จะช่วยให้สามารถทดสอบอัลกอริธึมชีวสารสนเทศได้ดียิ่งขึ้น โดยอนุญาตให้กรองสิ่งประดิษฐ์ได้ดีขึ้น (เช่น การกำจัดลำดับที่ไม่มีคู่เทียบในสปีชีส์ที่มีอยู่) และด้วยเหตุนี้จึงสามารถกำหนดสปีชีส์ได้อย่างแม่นยำยิ่งขึ้น^{[ 106 ]}ความหลากหลายที่ซ่อนเร้นอาจส่งผลให้ความหลากหลายทางชีวภาพเพิ่มขึ้น เนื่องจากสปีชีส์ทางสัณฐานวิทยาหนึ่งอาจแตกออกเป็นลำดับโมเลกุลที่แตกต่างกันหลายลำดับ^{[ 80 ]}สิ่งนี้จะช่วยสร้างข้อมูลอ้างอิง DNA ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งสำหรับการตรวจสอบความหลากหลายทางชีวภาพโดยใช้ DNA ในสิ่งแวดล้อม

เมกะบาร์โค้ดดิ้งเป็นคำที่ใช้อธิบายบาร์โค้ดดีเอ็นเอแบบความเร็วสูงที่ใช้ตัวอย่างจำนวนมาก โดยสามารถทำบาร์โค้ดตัวอย่างได้พร้อมกันหลายพันตัวอย่างเพื่อการระบุและการค้นพบสายพันธุ์^{[ 107 ] [ 108 ] [ 109 ] [ 110 ] [ 111 ]}

สิ่งนี้เป็นไปได้ด้วยการใช้ แพลตฟอร์ม การจัดลำดับรุ่นที่สามได้แก่ PacBio (Sequel I/II) โดยPacific Biosciencesและ MinION, PromethION โดยOxford Nanopore Technologyเมื่อเปรียบเทียบกับการจัดลำดับแบบ Sangerแล้ว เมกะบาร์โค้ดดิ้งนั้นเร็วกว่าและถูกกว่า ทำให้สามารถสร้างบาร์โค้ด DNA ขนาดใหญ่สำหรับหลายพันสายพันธุ์ได้^{[ 112 ]}

เมกะบาร์โค้ดสามารถช่วยเติม เต็ม ช่องว่างข้อมูลอ้างอิงบาร์โค้ดดีเอ็นเอของกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่ไม่ทราบชนิดสำหรับแมลงและเร่งการค้นพบสายพันธุ์^{[ 113 ] [ 114 ]}ทำความเข้าใจรูปแบบความหลากหลายของสายพันธุ์^{[ 115 ] [ 116 ] [ 117 ]}ประเมินความอุดมสมบูรณ์ของสายพันธุ์^{[ 118 ]}สร้างรายการสายพันธุ์ที่มีความหลากหลายทางชีวภาพอย่างรวดเร็ว^{[ 119 ]}ติดตามการเปลี่ยนแปลงของฐาน^{[ 120 ]}และจับคู่ระยะของวงจรชีวิต^{[ 121 ]}

เมตาบาร์โค้ดดิ้ง หมายถึง การสร้างบาร์โค้ดให้กับดีเอ็นเอหรือดีเอ็นเอจากสิ่งแวดล้อม (eDNA) ซึ่งช่วยให้สามารถระบุสิ่งมีชีวิตหลายชนิดพร้อมกันได้ในตัวอย่าง (สิ่งแวดล้อม) เดียวกัน โดยส่วนใหญ่มักอยู่ในกลุ่มสิ่งมีชีวิตเดียวกัน ความแตกต่างหลักระหว่างสองวิธีนี้คือ เมตาบาร์โค้ดดิ้งนั้นแตกต่างจากบาร์โค้ดดิ้งตรงที่ไม่เน้นสิ่งมีชีวิตชนิดใดชนิดหนึ่งโดยเฉพาะ แต่มีเป้าหมายเพื่อกำหนดองค์ประกอบของชนิดพันธุ์ภายในตัวอย่าง

กระบวนการเมตาบาร์โค้ดดิ้ง เช่นเดียวกับบาร์โค้ดดิ้งทั่วไป ครอบคลุมขั้นตอนการสกัด DNAการขยายสัญญาณ PCRการจัดลำดับและการวิเคราะห์ข้อมูลบาร์โค้ดประกอบด้วย บริเวณ ยีน แปรผันสั้นๆ (ตัวอย่างเช่น ดูเครื่องหมาย/บาร์โค้ดต่างๆ ) ซึ่งมีประโยชน์สำหรับการกำหนดอนุกรมวิธาน โดยมีบริเวณยีนที่อนุรักษ์ไว้สูงขนาบข้าง ซึ่งสามารถใช้ในการออกแบบไพรเมอร์ ได้ ^{[ 122 ]}มีการใช้ยีนที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับว่าเป้าหมายคือการทำบาร์โค้ดของสปีชีส์เดียวหรือเมตาบาร์โค้ดดิ้งหลายสปีชีส์ ในกรณีหลัง จะใช้ยีนที่เป็นสากลมากกว่า เมตาบาร์โค้ดดิ้งไม่ได้ใช้ DNA/RNA ของสปีชีส์เดียวเป็นจุดเริ่มต้น แต่ใช้ DNA/RNA จากสิ่งมีชีวิตหลายชนิดที่แตกต่างกันซึ่งได้มาจากตัวอย่างสิ่งแวดล้อมหรือตัวอย่างรวมเดียวกัน

เมตาบาร์โค้ดดิ้งมีศักยภาพที่จะเสริมมาตรการความหลากหลายทางชีวภาพ และแม้กระทั่งทดแทนได้ในบางกรณี โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อเทคโนโลยีพัฒนาขึ้นและขั้นตอนต่าง ๆ ค่อย ๆ มีราคาถูกลง ปรับปรุงให้เหมาะสมยิ่งขึ้น และแพร่หลายมากขึ้น^{[ 123 ] [ 124 ]}

การประยุกต์ใช้เมตาบาร์โค้ดดิ้งดีเอ็นเอ ได้แก่ การตรวจสอบความหลากหลายทางชีวภาพในสภาพแวดล้อมทางบกและทางน้ำบรรพชีวินวิทยาและระบบนิเวศโบราณปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชและแมลงผสมเกสรการวิเคราะห์อาหาร และความปลอดภัยของอาหาร

ข้อดีและข้อเสียทั่วไปของบาร์โค้ดที่กล่าวถึงข้างต้นนั้นใช้ได้กับเมตาบาร์โค้ดด้วยเช่นกัน ข้อเสียประการหนึ่งของการศึกษาเมตาบาร์โค้ดคือยังไม่มีข้อตกลงร่วมกันเกี่ยวกับการออกแบบการทดลองที่เหมาะสมที่สุดและเกณฑ์ทางชีวสารสนเทศที่จะนำมาใช้ในเมตาบาร์โค้ด eDNA ^{[ 125 ]}อย่างไรก็ตาม ปัจจุบันมีความพยายามร่วมกัน เช่น เครือข่าย EU COST DNAqua-Netเพื่อก้าวไปข้างหน้าโดยการแลกเปลี่ยนประสบการณ์และความรู้เพื่อสร้างมาตรฐานแนวปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการตรวจสอบทางชีวภาพ^{[ 80 ]}

ในปี 2014 นักวิจัยจาก ETH Zurich เสนอให้ใช้บาร์โค้ด DNA เทียมขนาดเล็กกว่าไมโครเมตรเป็น "แท็กน้ำมันที่มองไม่เห็น" บาร์โค้ดประกอบด้วยลำดับ DNA สังเคราะห์ภายในอนุภาคซิลิกาที่สามารถกู้คืนได้ด้วยแม่เหล็ก สามารถเติมลงในน้ำมันพืชในปริมาณน้อยมาก (ต่ำถึง 1 ppb) เป็นฉลาก และสามารถเรียกคืนได้ตลอดเวลาเพื่อทดสอบความถูกต้องโดยใช้ PCR/การจัดลำดับ วิธีนี้สามารถใช้ทดสอบน้ำมันมะกอกเพื่อตรวจหาการปลอมปนได้^{[ 126 ]}

หัวข้อย่อย:

หัวข้อที่เกี่ยวข้อง:

โปรดดูแถบนำทางด้านข้างที่ด้านบนของบทความด้วย

• สวีโบล
• ฟินโบล
• โครงการบาร์โค้ดชีวิตสากล (iBOL)
• ตัวหนา
• ยูนิท
• Diat.barcode ถูกเก็บถาวรเมื่อวันที่ 17 พฤศจิกายน 2019 ที่Wayback Machine