การถ่ายภาพ ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบวัดอายุการเรืองแสง (Fluorescence-lifetime imaging microscopyหรือFLIM)เป็นเทคนิคการถ่ายภาพที่อาศัยความแตกต่างของ อัตรา การลดลงแบบเอกซ์โปเนนเชียลของการปล่อยโฟตอนของ สาร เรืองแสงจากตัวอย่าง สามารถใช้เป็นเทคนิคการถ่ายภาพในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล (confocal microscopy) กล้องจุลทรรศน์แบบกระตุ้นด้วยโฟตอนสองตัว ( two-photon excitation microscopy ) และโทโมกราฟีแบบมัลติโฟตอน (multiphoton tomography)

ใน FLIM จะใช้ค่าอายุ การเรืองแสง (FLT) ของฟลูออโรฟอร์ แทนที่จะใช้ความเข้มของการเรืองแสง เพื่อสร้างภาพ ค่าอายุการเรืองแสงขึ้นอยู่กับสภาพแวดล้อมจุลภาคเฉพาะที่ของฟลูออโรฟอร์ ดังนั้นจึงป้องกันการวัดค่าความเข้มของการเรืองแสงที่ผิดพลาดอันเนื่องมาจากการเปลี่ยนแปลงความสว่างของแหล่งกำเนิดแสง ความเข้มของแสงพื้นหลัง หรือการฟอกสีด้วยแสงที่จำกัด เทคนิคนี้ยังมีข้อดีคือช่วยลดผลกระทบของการกระเจิงของโฟตอนในชั้นตัวอย่างที่หนา เนื่องจากขึ้นอยู่กับสภาพแวดล้อมจุลภาค การวัดค่าอายุการเรืองแสงจึงถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้สำหรับ^ค่า pH [ ^{1 ]}ความหนืด^{[ 2 ]} และ ความเข้มข้นของสารเคมี^{[ 3 ] [ 4 ]}

ฟลูออโรฟอร์ที่ถูกกระตุ้นด้วยโฟตอนจะกลับสู่สถานะพื้นฐานด้วยความน่าจะเป็นบางอย่าง โดยขึ้นอยู่กับอัตราการสลายตัวผ่านเส้นทางการสลายตัวที่แตกต่างกันหลายเส้นทาง (ทั้งแบบแผ่รังสีและ/หรือไม่แผ่รังสี) ในการสังเกตการเรืองแสง เส้นทางการสลายตัวอย่างน้อยหนึ่งเส้นทางจะต้องเป็นการ ปล่อย โฟตอนออกมาเอง ในคำอธิบาย แบบกลุ่มการเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจะสลายตัวไปตามเวลาตามสมการ

${\displaystyle I(t)=I_{0}e^{-t/\tau }}$

ที่ไหน

${\displaystyle {\frac {1}{\tau }}=\sum k_{i}}$.

ในข้างต้นคือเวลาคืออายุการเรืองแสงคือค่าการเรืองแสงเริ่มต้นที่และคืออัตราสำหรับแต่ละเส้นทางการสลายตัว ซึ่งอย่างน้อยหนึ่งเส้นทางจะต้องเป็นอัตราการสลายตัวของการเรืองแสงที่สำคัญกว่านั้น อายุการเรืองแสงนั้นเป็นอิสระจากความเข้มเริ่มต้นและแสงที่ปล่อยออกมา สิ่งนี้สามารถนำไปใช้ในการวัดที่ไม่ขึ้นอยู่กับความเข้มในการตรวจจับทางเคมีได้^{[ 5 ]}${\displaystyle t}$${\displaystyle \tau }$${\displaystyle I_{0}}$${\displaystyle t=0}$${\displaystyle k_{i}}$${\displaystyle k_{f}}$${\displaystyle \tau }$

การถ่ายภาพด้วยการวัดอายุการเรืองแสงจะให้ภาพที่มีความเข้มของแต่ละพิกเซลกำหนดโดยค่าดังกล่าวซึ่งช่วยให้สามารถมองเห็นความแตกต่างระหว่างวัสดุที่มีอัตราการสลายตัวของการเรืองแสงต่างกัน (แม้ว่าวัสดุเหล่านั้นจะเรืองแสงที่ความยาวคลื่นเดียวกันก็ตาม) และยังสร้างภาพที่แสดงการเปลี่ยนแปลงในเส้นทางการสลายตัวอื่นๆ เช่น ในการถ่ายภาพ FRETอีกด้วย ${\displaystyle \tau }$

สามารถกำหนดอายุการเรืองแสงในโดเมนเวลาได้โดยใช้แหล่งกำเนิดแสงแบบพัลส์ เมื่อกลุ่มของฟลูออโรฟอร์ถูกกระตุ้นด้วยพัลส์แสงที่สั้นมากหรือ พัลส์ เดลต้าการเรืองแสงที่วัดได้ในโดเมนเวลาจะลดลงแบบเอกซ์โปเนนเชียลดังที่ได้อธิบายไว้ข้างต้น อย่างไรก็ตาม หากพัลส์การกระตุ้นหรือการตอบสนองการตรวจจับกว้าง การเรืองแสงที่วัดได้ d(t) จะไม่เป็นแบบเอกซ์โปเนนเชียลอย่างแท้จริง ฟังก์ชันการตอบสนองของเครื่องมือ IRF(t) จะถูกรวมหรือผสมผสานกับฟังก์ชันการลดลง F(t)

${\displaystyle {d}(t)={IRF}(t)\otimes {F}(t)}$

การตอบสนองของแหล่งกำเนิดแสง ตัวตรวจจับ และอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์สามารถวัดได้ โดยปกติจากแสงกระตุ้นที่กระเจิง การกู้คืนฟังก์ชันการสลายตัว (และอายุการใช้งานที่สอดคล้องกัน) ก่อให้เกิดความท้าทายเพิ่มเติม เนื่องจาก1การหารในโดเมนความถี่มีแนวโน้มที่จะสร้างสัญญาณรบกวนสูงเมื่อตัวหารอยู่ใกล้ศูนย์

โดยทั่วไปจะใช้ การนับโฟตอนเดี่ยวแบบสัมพันธ์กับเวลา ( TCSPC ) เนื่องจากสามารถชดเชยความแปรผันของความเข้มของแหล่งกำเนิดและแอมพลิจูดของพัลส์โฟตอนเดี่ยวได้ การใช้อุปกรณ์ TCSPC เชิงพาณิชย์สามารถบันทึกเส้นโค้งการสลายตัวของฟลูออเรสเซนซ์ได้ด้วยความละเอียดของเวลาถึง 405 fs ^{[ 6 ]} ฮิสโตแกรมการสลายตัวของฟลูออเรสเซนซ์ที่บันทึกไว้เป็นไปตามสถิติปัวซองซึ่งนำมาพิจารณาในการกำหนดความเหมาะสมระหว่างการปรับให้เข้ากับข้อมูล โดยเฉพาะอย่างยิ่งTCSPCจะบันทึกเวลาที่โฟตอนแต่ละตัวถูกตรวจจับโดยตัวตรวจจับโฟตอนเดี่ยวความเร็วสูง (โดยทั่วไปคือหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์ ( PMT ) หรือโฟโตไดโอดอะวาแลนซ์โฟตอนเดี่ยว (SPAD)) เทียบกับพัลส์เลเซอร์กระตุ้น การบันทึกจะทำซ้ำสำหรับพัลส์เลเซอร์หลายพัลส์ และหลังจากบันทึกเหตุการณ์มากพอแล้ว จะสามารถสร้างฮิสโตแกรมของจำนวนเหตุการณ์ในช่วงเวลาที่บันทึกไว้ทั้งหมดได้ จากนั้นฮิสโตแกรมนี้สามารถปรับให้เข้ากับฟังก์ชันเอกซ์โพเนนเชียลที่มีฟังก์ชันการสลายตัวของอายุการใช้งานแบบเอกซ์โพเนนเชียลที่สนใจ และสามารถดึงพารามิเตอร์อายุการใช้งานออกมาได้ตามนั้น ระบบ PMT หลายช่องสัญญาณที่มีองค์ประกอบ 16 ^{[ 7 ]}ถึง 64 ตัวมีวางจำหน่ายในเชิงพาณิชย์แล้ว ในขณะที่ระบบ CMOS single-photon avalanche diode (SPAD)-TCSPC FLIM ที่เพิ่งได้รับการสาธิตเมื่อเร็ว ๆ นี้ สามารถนำเสนอจำนวนช่องสัญญาณการตรวจจับที่สูงขึ้นและตัวเลือกต้นทุนต่ำเพิ่มเติมได้^{[ 8 ]}

การกระตุ้นด้วยพัลส์ยังคงใช้ในวิธีการนี้ ก่อนที่พัลส์จะไปถึงตัวอย่าง แสงบางส่วนจะสะท้อนโดยกระจกไดโครอิกและถูกตรวจจับโดยโฟโตไดโอดซึ่งจะกระตุ้นตัวสร้างความล่าช้าที่ควบคุมตัวเพิ่มความเข้มแสงแบบเกต (GOI) ที่อยู่ด้านหน้าตัวตรวจจับ CCD GOI จะอนุญาตให้ตรวจจับได้เฉพาะในช่วงเวลาที่เปิดอยู่หลังจากความล่าช้าเท่านั้น ดังนั้น ด้วยตัวสร้างความล่าช้าที่ปรับได้ จึงสามารถรวบรวมการปล่อยแสงฟลูออเรสเซนซ์หลังจากเวลาหน่วงหลายช่วงที่ครอบคลุมช่วงเวลาของการสลายตัวของฟลูออเรสเซนซ์ของตัวอย่าง^{[ 9 ] [ 10 ]}ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา กล้อง CCD ที่มีตัวเพิ่มความเข้มแสงแบบรวมได้เข้าสู่ตลาด กล้องเหล่านี้ประกอบด้วยตัวเพิ่มความเข้มของภาพ เซ็นเซอร์ CCD และตัวสร้างความล่าช้าแบบรวม กล้อง ICCD ที่มีเวลาเกตที่สั้นที่สุดถึง 200ps และขั้นตอนความล่าช้า 10ps ช่วยให้สามารถ FLIM ที่มีความละเอียดระดับต่ำกว่านาโนวินาทีได้ เมื่อใช้ร่วมกับเอนโดสโคป เทคนิคนี้ใช้สำหรับการวินิจฉัยเนื้องอกในสมองระหว่างการผ่าตัด^{[ 11 ]}

สามารถกำหนดอายุการเรืองแสงได้ในโดเมนความถี่โดยวิธีปรับเฟส วิธีนี้ใช้แหล่งกำเนิดแสงที่เป็นพัลส์หรือปรับความถี่สูง (สูงถึง 500 MHz) เช่น LED เลเซอร์ไดโอด หรือ แหล่งกำเนิด คลื่นต่อเนื่องที่รวมกับตัวปรับสัญญาณไฟฟ้าเชิงแสงหรือตัวปรับสัญญาณอะคูสโตเชิงแสงการเรืองแสงจะ (ก.) ดีโมดูเลตและ (ข.) เลื่อนเฟส ปริมาณทั้งสองเกี่ยวข้องกับเวลาการสลายตัวลักษณะเฉพาะของฟลูออโรฟอร์ นอกจากนี้ ส่วนประกอบ y ของคลื่นไซน์การกระตุ้นและการเรืองแสงจะถูกปรับ และสามารถกำหนดอายุการเรืองแสงได้จากอัตราส่วนการปรับของส่วนประกอบ y เหล่านี้ ดังนั้น จึงสามารถกำหนดค่าอายุการเรืองแสงได้ 2 ค่าจากวิธีปรับเฟส อายุการเรืองแสงจะถูกกำหนดผ่านกระบวนการปรับพารามิเตอร์การทดลองเหล่านี้ ข้อดีของ FLIM ในโดเมนความถี่แบบ PMT หรือแบบกล้องคือการได้ภาพอายุการเรืองแสงที่รวดเร็ว ทำให้เหมาะสำหรับการใช้งานเช่นการวิจัยเซลล์มีชีวิต^{[ 12 ]}

เป้าหมายของอัลกอริธึมการวิเคราะห์คือการแยกเส้นโค้งการสลายตัวที่บริสุทธิ์ออกจากเส้นโค้งการสลายตัวที่วัดได้ และประมาณค่าอายุการใช้งาน โดยปกติแล้วการประมาณค่าอายุการใช้งานจะทำได้โดยการปรับฟังก์ชันเอกซ์โพเนนเชียลเดี่ยวหรือหลายฟังก์ชัน มีการพัฒนาวิธีการต่างๆ มากมายเพื่อแก้ปัญหานี้ เทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดคือการคำนวณการสังเคราะห์ซ้ำแบบกำลังสองน้อยที่สุด ซึ่งอิงจากการลดค่าผลรวมถ่วงน้ำหนักของค่าความคลาดเคลื่อน ในเทคนิคนี้ เส้นโค้งการสลายตัวแบบเอกซ์โพเนนเชียลทางทฤษฎีจะถูกสังเคราะห์ร่วมกับฟังก์ชันการตอบสนองของเครื่องมือ ซึ่งวัดแยกต่างหาก และจะหาค่าที่เหมาะสมที่สุดโดยการคำนวณค่าความคลาดเคลื่อนซ้ำๆ สำหรับอินพุตต่างๆ จนกว่าจะพบค่าต่ำสุด สำหรับชุดการสังเกต สัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ในช่วงเวลา i การประมาณค่าอายุการใช้งานจะดำเนินการโดยการลดค่า: ${\displaystyle d({{t}_{i}})}$

${\displaystyle {{\chi }^{2}}=\sum \limits _{i}{{\left[{{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau )\right]}^{2}}}$

นอกจากความยากลำบากในการทดลอง รวมถึงฟังก์ชันการตอบสนองของเครื่องมือที่ขึ้นอยู่กับความยาวคลื่นแล้ว การแก้ปัญหาการแยกส่วนประกอบแบบวนซ้ำทางคณิตศาสตร์ก็ไม่ใช่เรื่องง่ายและเป็นกระบวนการที่ช้า ซึ่งในยุคแรกๆ ของ FLIM ทำให้ไม่สามารถนำไปวิเคราะห์แบบพิกเซลต่อพิกเซลได้ วิธีการที่ไม่ต้องใช้การปรับให้เข้ากับข้อมูลจึงน่าสนใจ เพราะให้ผลลัพธ์ที่รวดเร็วมากในการประมาณอายุการใช้งาน หนึ่งในเทคนิคหลักและตรงไปตรงมาในหมวดหมู่นี้คือ วิธีการกำหนดอายุการใช้งานอย่างรวดเร็ว (RLD) RLD คำนวณอายุการใช้งานและแอมพลิจูดโดยตรงโดยการแบ่งเส้นโค้งการสลายตัวออกเป็นสองส่วนที่มีความกว้างเท่ากัน t การวิเคราะห์จะดำเนินการโดยการอินทิเกรตเส้นโค้งการสลายตัวในช่วงเวลาเท่ากันt: ${\displaystyle \delta }$${\displaystyle \delta }$

${\displaystyle {\begin{matrix}{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits _{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}}$

Ii คือสัญญาณที่บันทึกไว้ในช่องสัญญาณที่ i และ K คือจำนวนช่องสัญญาณ สามารถประมาณอายุการใช้งานได้โดยใช้สูตร:

${\displaystyle \tau =\delta t/\ln({{D}_{0}}/{{D}_{1}})}$

สำหรับการสลายตัวแบบหลายเอ็กซ์โพเนนเชียล สมการนี้จะให้ค่าอายุเฉลี่ย วิธีนี้สามารถขยายไปใช้ในการวิเคราะห์การสลายตัวแบบสองเอ็กซ์โพเนนเชียลได้ ข้อเสียเปรียบที่สำคัญอย่างหนึ่งของวิธีนี้คือ ไม่สามารถคำนึงถึงผลกระทบจากการตอบสนองของเครื่องมือได้ และด้วยเหตุนี้ ส่วนต้นของเส้นโค้งการสลายตัวที่วัดได้จึงควรถูกละเลยในการวิเคราะห์ ซึ่งหมายความว่าส่วนหนึ่งของสัญญาณจะถูกทิ้งไป และความแม่นยำในการประมาณค่าอายุสั้นจะลดลง

หนึ่งในคุณสมบัติที่น่าสนใจของทฤษฎีบทการสังเคราะห์ (convolution theorem) คือ อินทิกรัลของการสังเคราะห์เป็นผลคูณของตัวประกอบที่ประกอบกันเป็นอินทิกรัล มีเทคนิคบางอย่างที่ทำงานในพื้นที่ที่แปลงแล้วซึ่งใช้ประโยชน์จากคุณสมบัตินี้เพื่อกู้คืนเส้นโค้งการสลายตัวที่บริสุทธิ์จากเส้นโค้งที่วัดได้ การแปลงลาปลาสและการแปลงฟูริเยร์ รวมถึงการขยายอนุกรมเกาส์ของลากูร์ ได้ถูกนำมาใช้เพื่อประมาณอายุการใช้งานในพื้นที่ที่แปลงแล้ว วิธีการเหล่านี้เร็วกว่าวิธีการที่ใช้การแยกการสังเคราะห์ (deconvolution) แต่มีปัญหาเรื่องการตัดทอนและการสุ่มตัวอย่าง นอกจากนี้ การประยุกต์ใช้วิธีการเช่นการขยายอนุกรมเกาส์ของลากูร์นั้นมีความซับซ้อนทางคณิตศาสตร์ ในวิธีการฟูริเยร์ อายุการใช้งานของเส้นโค้งการสลายตัวแบบเอกซ์โพเนนเชียลเดี่ยวจะกำหนดโดย:

${\displaystyle \tau ={\frac {1}{n\omega }}{\frac {{A}_{n}}{{B}_{n}}}}$

ที่ไหน:

${\displaystyle {\begin{matrix}{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&\omega ={\frac {2\pi }{T}}\\\end{matrix}}}$

โดยที่ n คือเลขฮาร์มอนิก และ T คือช่วงเวลาทั้งหมดของการตรวจจับ

FLIM ถูกนำมาใช้เป็นหลักในทางชีววิทยาเป็นวิธีการตรวจจับสารไวแสงในเซลล์และเนื้องอก รวมถึง FRET ในกรณีที่การสร้างภาพแบบอัตราส่วนทำได้ยาก เทคนิคนี้ได้รับการพัฒนาในช่วงปลายทศวรรษ 1980 และต้นทศวรรษ 1990 (วิธีการเกตติ้ง: Bugiel et al. 1989, König 1989, ^{[ 13 ]}การปรับเฟส: Lakowicz at al. 1992, ^{[ 14 ] [ 15 ]} ) ก่อนที่จะถูกนำไปใช้อย่างกว้างขวางมากขึ้นในช่วงปลายทศวรรษ 1990 ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ มีการใช้เพื่อศึกษาการส่งสัญญาณของตัวรับ EGF ^{[ 16 ]}และการขนส่ง^{[ 17 ]} Time domain FLIM (tdFLIM) ยังถูกใช้เพื่อแสดงปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนเส้นใยระดับกลางนิวเคลียร์ทั้งสองชนิด ได้แก่ ลามิน A และ B1 ในโฮโมพอลิเมอร์ที่แตกต่างกันที่เยื่อหุ้มนิวเคลียส ซึ่งมีปฏิสัมพันธ์กันในโครงสร้างลำดับที่สูงขึ้น^{[ 18 ]}การถ่ายภาพ FLIM มีประโยชน์อย่างยิ่งในเซลล์ประสาท ซึ่งการกระเจิงของแสงโดยเนื้อเยื่อสมองเป็นปัญหาสำหรับการถ่ายภาพแบบอัตราส่วน^{[ 19 ]} ในเซลล์ประสาท การถ่ายภาพ FLIM โดยใช้การส่องสว่างแบบพัลส์ถูกนำมาใช้เพื่อศึกษา โปรตีนตระกูล Ras [ ^{20 ]} CaMKII , Racและ Ran ^{[ 21 ] FLIM ถูกนำมาใช้ในการถ่าย ภาพ} รังสีเอกซ์แบบหลายโฟตอนทางคลินิกเพื่อตรวจจับเซลล์มะเร็งในชั้นผิวหนัง รวมถึงสารประกอบทางเภสัชกรรมและเครื่องสำอาง

เมื่อไม่นานมานี้ FLIM ยังถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับฟลาวาโนลในเซลล์พืช อีกด้วย ^{[ 22 ]}

FLIM แบบมัลติโฟตอนถูกนำมาใช้มากขึ้นในการตรวจจับการเรืองแสงอัตโนมัติจากโคเอนไซม์เป็นเครื่องหมายสำหรับการเปลี่ยนแปลงในการเผาผลาญของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม^{[ 23 ] [ 24 ]}

เนื่องจากอายุการเรืองแสงของฟลูออโรฟอร์ขึ้นอยู่กับทั้งกระบวนการแผ่รังสี (เช่น การเรืองแสง) และกระบวนการที่ไม่แผ่รังสี (เช่น การดับแสง, FRET) การถ่ายโอนพลังงานจากโมเลกุลผู้ให้ไปยังโมเลกุลผู้รับจะทำให้อายุการเรืองแสงของผู้ให้ลดลง ดังนั้น การวัด FRET โดยใช้ FLIM จึงสามารถให้วิธีการแยกแยะระหว่างสถานะ/สภาพแวดล้อมของฟลูออโรฟอร์ได้^{[ 25 ]} ในทางตรงกันข้ามกับการวัด FRET ที่อิงตามความเข้ม การวัด FRET ที่อิงตาม FLIM ยังไม่ไวต่อความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์ และสามารถกรองสิ่งแปลกปลอมที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นและความเข้มของการปล่อยแสงทั่วทั้งตัวอย่างได้

• แนวทางเฟเซอร์สำหรับการวัดอายุการเรืองแสงและการสร้างภาพสเปกตรัม

• การถ่ายภาพอายุการเรืองแสงในสถานะกระตุ้น
• เครื่องมือวิเคราะห์อายุการใช้งานและสเปกตรัมใน ImageJ: http://spechron.com เก็บถาวรเมื่อ 11 มีนาคม 2013 ที่Wayback Machine
• กล้องจุลทรรศน์ภาพอายุการเรืองแสง
• หลักการของ TCSPC FLIM (Becker&Hickl GmbH)