ห้องสมุดจีโนมคือชุดของชิ้นส่วน DNA ที่ซ้อนทับกันซึ่งประกอบกันเป็นDNA จีโนมทั้งหมด ของสิ่งมีชีวิต หนึ่งเดียว DNA จะถูกเก็บไว้ในกลุ่มของเวกเตอร์ ที่เหมือนกัน โดยแต่ละเวกเตอร์จะมีชิ้นส่วน DNA ที่แตกต่างกัน เพื่อสร้างห้องสมุดจีโนม DNA ของสิ่งมีชีวิตจะถูกสกัดจากเซลล์แล้วย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะเพื่อตัด DNA ออกเป็นชิ้นส่วนที่มีขนาดเฉพาะ จากนั้นชิ้นส่วนเหล่านี้จะถูกแทรกเข้าไปในเวกเตอร์โดยใช้DNA ไลเกส [ ^{1 ] ต่อ}มา DNA ของเวกเตอร์สามารถถูกดูดซึมโดยสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน ซึ่งโดยทั่วไปคือประชากรของEscherichia coliหรือยีสต์โดยแต่ละเซลล์จะมีโมเลกุลเวกเตอร์เพียงหนึ่งโมเลกุล การใช้เซลล์เจ้าบ้านในการนำพาเวกเตอร์ทำให้สามารถขยาย และดึง โคลนเฉพาะจากห้องสมุดเพื่อการวิเคราะห์ ได้ง่าย ^{[ 2 ]}

มีเวกเตอร์หลายประเภทที่มีความจุในการแทรกที่แตกต่างกัน โดยทั่วไปแล้ว ไลบรารีที่สร้างจากสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนม ขนาดใหญ่กว่า จะต้องใช้เวกเตอร์ที่มีตัวแทรกขนาดใหญ่กว่า ดังนั้นจึงต้องการโมเลกุลเวกเตอร์น้อยลงในการสร้างไลบรารี นักวิจัยสามารถเลือกเวกเตอร์โดยพิจารณาจากขนาดของตัวแทรกที่เหมาะสมเพื่อหาจำนวนโคลนที่ต้องการซึ่งจำเป็นสำหรับการครอบคลุมจีโนมทั้งหมด^{[ 3 ]}

ห้องสมุดจีโนมมักใช้สำหรับ การ ประยุกต์ใช้การจัดลำดับมีบทบาทสำคัญในการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดของสิ่งมีชีวิตหลายชนิด รวมถึงจีโนมของมนุษย์และสิ่งมีชีวิตต้นแบบ หลายชนิด ^{[ 4 ] [ 5 ]}

จีโนมที่ใช้ดีเอ็นเอเป็นครั้งแรก ที่ได้รับการจัดลำดับอย่างสมบูรณ์นั้นสำเร็จได้โดย เฟรเดอริก แซงเกอร์ผู้ได้รับรางวัลโนเบลสองครั้งในปี 1977 แซงเกอร์และทีมงานนักวิทยาศาสตร์ของเขาได้สร้างคลังของแบคทีริโอเฟจphi X 174เพื่อใช้ในการจัดลำดับดีเอ็นเอ^{[ 6 ]}ความสำคัญของความสำเร็จนี้ส่งผลให้ความต้องการในการจัดลำดับจีโนมเพื่อการวิจัยการบำบัดด้วยยีน เพิ่มมากขึ้นเรื่อยๆ ปัจจุบันทีมงานสามารถจัดทำรายการโพลีมอร์ฟิซึมในจีโนมและตรวจสอบยีนที่อาจเป็นสาเหตุของโรคต่างๆ เช่นโรคพาร์กินสัน โรคอัลไซเมอร์โรคปลอกประสาทเสื่อมแข็ง โรคข้ออักเสบรูมาต อยด์ และโรคเบาหวานชนิดที่ 1 ^{[ 7 ]}สิ่งเหล่านี้เป็นผลมาจากความก้าวหน้าของการศึกษาความสัมพันธ์ทั่วทั้งจีโนมจากความสามารถในการสร้างและจัดลำดับคลังจีโนม ก่อนหน้านี้ การศึกษาการเชื่อมโยงและยีนเป้าหมายเป็นเพียงวิธีการบางส่วนเท่านั้น^{[ 8 ]}

การสร้างไลบรารีจีโนมเกี่ยวข้องกับการสร้าง โมเลกุล DNA ลูกผสม จำนวนมาก DNAจีโนมของสิ่งมีชีวิตจะถูกสกัดและย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะสำหรับสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมขนาดเล็กมาก(~10 kb)ชิ้นส่วนที่ถูกย่อยสามารถแยกออกจากกันได้ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสจากนั้นชิ้นส่วนที่แยกออกมาสามารถตัดและโคลนลงในเวกเตอร์แยกกันได้ อย่างไรก็ตาม เมื่อจีโนมขนาดใหญ่ถูกย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ จะมีชิ้นส่วนมากเกินไปที่จะตัดออกทีละชิ้น ชิ้นส่วนทั้งหมดจะต้องถูกโคลนร่วมกับเวกเตอร์ และการแยกโคลนสามารถเกิดขึ้นได้ในภายหลัง ไม่ว่าในกรณีใด ชิ้นส่วนจะถูกเชื่อมต่อเข้ากับเวกเตอร์ที่ถูกย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะเดียวกัน เวกเตอร์ที่มีชิ้นส่วน DNA จีโนมที่แทรกเข้าไปสามารถนำเข้าสู่สิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านได้^{[ 1 ]}

ด้านล่างนี้คือขั้นตอนการสร้างคลังข้อมูลจีโนมจากจีโนมขนาดใหญ่

1. สกัดและทำให้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์
2. ย่อยดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ กระบวนการนี้จะสร้างชิ้นส่วนที่มีขนาดใกล้เคียงกัน โดยแต่ละชิ้นส่วนประกอบด้วยยีนหนึ่งตัวหรือมากกว่านั้น
3. นำชิ้นส่วน DNA เข้าไปในเวกเตอร์ที่ถูกตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดเดียวกัน จากนั้นใช้เอนไซม์ DNA ไลเกสเชื่อมต่อชิ้นส่วน DNA เข้ากับเวกเตอร์ วิธีนี้จะสร้างโมเลกุลลูกผสมจำนวนมาก
4. โมเลกุลรีคอมบิแนนท์เหล่านี้จะถูกดูดซึมโดยแบคทีเรียเจ้าบ้านโดยการเปลี่ยนแปลงทำให้เกิดคลัง DNA ^{[ 9 ] [ 10 ]}

ด้านล่างนี้คือแผนภาพแสดงขั้นตอนต่างๆ ที่ได้กล่าวไว้ข้างต้น

หลังจากสร้างไลบรารีจีโนมด้วยเวกเตอร์ไวรัส เช่นแลมบ์ดาฟาจ แล้ว สามารถกำหนด ไทเตอร์ของไลบรารีได้ การคำนวณไทเตอร์ช่วยให้นักวิจัยสามารถประมาณจำนวนอนุภาคไวรัสที่ติดเชื้อที่สร้างขึ้นในไลบรารีได้สำเร็จ โดยใช้วิธีเจือจางไลบรารีเพื่อเปลี่ยนวัฒนธรรมของ E. coli ที่มีความเข้มข้นที่ทราบ จากนั้นนำวัฒนธรรมไปเพาะบนจานวุ้นและบ่มไว้ข้ามคืน นับจำนวนพลาคไวรัสและสามารถใช้คำนวณจำนวนอนุภาคไวรัสที่ติดเชื้อทั้งหมดในไลบรารีได้ เวกเตอร์ไวรัสส่วนใหญ่ยังมีเครื่องหมายที่ช่วยให้สามารถแยกแยะโคลนที่มีชิ้นส่วนแทรกออกจากโคลนที่ไม่มีชิ้นส่วนแทรกได้ ซึ่งช่วยให้นักวิจัยสามารถกำหนดเปอร์เซ็นต์ของอนุภาคไวรัสที่ติดเชื้อที่บรรจุชิ้นส่วนของไลบรารีได้จริง^{[ 11 ]}

สามารถใช้วิธีการที่คล้ายกันในการหาค่าความเข้มข้นของไลบรารีจีโนมที่สร้างด้วยเวกเตอร์ที่ไม่ใช่ไวรัส เช่นพลาสมิดและBAC สามารถใช้ การเชื่อมต่อทดสอบของไลบรารีเพื่อแปลง E. coli จากนั้นจึงกระจายการแปลงลงบนจานวุ้นและบ่มไว้ข้ามคืน ค่าความเข้มข้นของการแปลงจะถูกกำหนดโดยการนับจำนวนโคโลนีที่ปรากฏบนจาน เวกเตอร์เหล่านี้โดยทั่วไปจะมีเครื่องหมายที่เลือกได้ซึ่งช่วยให้สามารถแยกแยะโคลนที่มีชิ้นส่วนแทรกออกจากโคลนที่ไม่มีได้ โดยการทำการทดสอบนี้ นักวิจัยยังสามารถกำหนดประสิทธิภาพของการเชื่อมต่อและปรับเปลี่ยนตามความจำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่าพวกเขาได้รับจำนวนโคลนที่ต้องการสำหรับไลบรารี^{[ 12 ]}

เพื่อแยกโคลนที่มีบริเวณที่สนใจออกจากไลบรารี ไลบรารีจะต้องได้รับการคัดกรอง ก่อน วิธีการคัดกรองวิธีหนึ่งคือการไฮบริดไดเซชัน เซลล์โฮสต์ที่แปลงสภาพแต่ละเซลล์ของไลบรารีจะมีเวกเตอร์เพียงตัวเดียวที่มีดีเอ็นเอแทรกเพียงชิ้นเดียว ไลบรารีทั้งหมดสามารถเพาะลงบนแผ่นกรองเหนืออาหารเลี้ยงเชื้อได้ แผ่นกรองและโคโลนีจะถูกเตรียมสำหรับการไฮบริดไดเซชัน จากนั้นจึงติดฉลากด้วยโพรบ [ ^{13 ] ดีเอ็นเอ}เป้าหมาย - ดีเอ็นเอแทรกที่สนใจ - สามารถระบุได้โดยการตรวจจับ เช่นออโตเรดิโอกราฟีเนื่องจากการไฮบริดไดเซชันกับโพรบดังที่เห็นด้านล่าง

วิธีการคัดกรองอีกวิธีหนึ่งคือการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ไลบรารีบางส่วนถูกจัดเก็บในรูปแบบของกลุ่มโคลน และการคัดกรองด้วย PCR เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการระบุกลุ่มที่มีโคลนเฉพาะ^{[ 2 ]}

ขนาด จีโนมแตกต่างกันไปในสิ่งมีชีวิตต่าง ๆ และต้องเลือกเวกเตอร์โคลน ให้เหมาะสม สำหรับจีโนมขนาดใหญ่ ควรเลือกเวกเตอร์ที่มีความจุสูงเพื่อให้ โคลน จำนวนน้อยเพียงพอต่อการครอบคลุมจีโนมทั้งหมด อย่างไรก็ตาม การระบุลักษณะของ อินเสิร์ตที่อยู่ในเวกเตอร์ที่มีความจุสูงกว่ามักจะทำได้ยากกว่า^{[ 3 ]}

ด้านล่างนี้คือตารางแสดงเวกเตอร์หลายชนิดที่นิยมใช้สำหรับสร้างไลบรารีจีโนม และขนาดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่แต่ละชนิดสามารถบรรจุได้โดยทั่วไป

พลาสมิด เป็นโมเลกุล DNAแบบวงกลมสองสายที่ใช้กันทั่วไปในการโคลนนิ่งระดับโมเลกุลโดยทั่วไปพลาสมิดมีความยาว 2 ถึง 4 กิโลเบสแพร์ (kb) และสามารถบรรจุสารแทรกได้ถึง 15kb พลาสมิดมีต้นกำเนิดการจำลองแบบที่ช่วยให้สามารถจำลองแบบภายในแบคทีเรียได้อย่างอิสระจากโครโมโซม ของโฮสต์ พลาสมิดมักมียีนต้านทานยาปฏิชีวนะที่ช่วยให้สามารถคัดเลือกเซลล์แบคทีเรียที่มีพลาสมิดได้ พลาสมิดจำนวนมากยังมียีนรายงานที่ช่วยให้นักวิจัยสามารถแยกแยะโคลนที่มีสารแทรกออกจากโคลนที่ไม่มีสารแทรกได้^{[ 3 ]}

ฟาจ λเป็นไวรัสดีเอ็นเอสายคู่ที่ติดเชื้อE. coliโครโมโซม λ มีความยาว 48.5 กิโลเบส และสามารถบรรจุชิ้นส่วนแทรกได้ถึง 25 กิโลเบส ชิ้นส่วนแทรกเหล่านี้จะแทนที่ลำดับไวรัสที่ไม่จำเป็นในโครโมโซม λ ในขณะที่ยีนที่จำเป็นสำหรับการสร้างอนุภาคไวรัสและการติดเชื้อยังคงอยู่ครบถ้วน ดีเอ็นเอชิ้นส่วนแทรกจะถูกจำลองแบบพร้อมกับดีเอ็นเอไวรัส ดังนั้นจึงถูกบรรจุรวมกันเป็นอนุภาคไวรัส อนุภาคเหล่านี้มีประสิทธิภาพสูงในการติดเชื้อและการเพิ่มจำนวน ส่งผลให้มีการผลิตโครโมโซม λ ลูกผสมมากขึ้น^{[ 3 ]}อย่างไรก็ตาม เนื่องจากขนาดของชิ้นส่วนแทรกที่เล็กกว่า ไลบรารีที่สร้างด้วยฟาจ λ อาจต้องใช้โคลนจำนวนมากเพื่อให้ครอบคลุมจีโนมทั้งหมด^{[ 14 ]}

เวกเตอร์ คอสมิดเป็นพลาสมิดที่มีดีเอ็นเอของแบคทีริโอเฟจ λ ขนาดเล็กที่เรียกว่าลำดับคอส ลำดับนี้ทำให้คอสมิดสามารถบรรจุลงในอนุภาคแบคทีริโอเฟจ λ ได้ อนุภาคเหล่านี้ซึ่งมีคอสมิดแบบเส้นตรงอยู่ภายใน จะถูกนำเข้าสู่เซลล์โฮสต์โดยการถ่ายทอด เมื่ออยู่ภายในโฮสต์แล้ว คอสมิดจะกลายเป็นวงกลมด้วยความช่วยเหลือของ ดีเอ็นเอไลเกสของโฮสต์จากนั้นจึงทำหน้าที่เป็นพลาสมิด คอสมิดสามารถบรรจุสารแทรกที่มีขนาดได้ถึง 40kb ^{[ 2 ]}

เวกเตอร์แบค ทีริโอเฟจ P1สามารถบรรจุอินเสิร์ตขนาด 70 – 100kb ได้ โดยเริ่มต้นจากโมเลกุล DNA แบบเส้นตรงที่บรรจุอยู่ในอนุภาคแบคทีริโอเฟจ P1 อนุภาคเหล่านี้จะถูกฉีดเข้าไปในสายพันธุ์ E. coli ที่แสดงออกถึงCre recombinaseเวกเตอร์ P1 แบบเส้นตรงจะกลายเป็นวงกลมโดยการรีคอมบิเนชันระหว่างไซต์ loxP สองไซต์ในเวกเตอร์ เวกเตอร์ P1 โดยทั่วไปจะมียีนต้านทานยาปฏิชีวนะและเครื่องหมายการคัดเลือกเชิงบวกเพื่อแยกแยะโคลนที่มีอินเสิร์ตออกจากโคลนที่ไม่มี เวกเตอร์ P1 ยังมีรีพลิคอน พลาสมิด P1 ซึ่งทำให้มั่นใจได้ว่าจะมีเวกเตอร์เพียงสำเนาเดียวในเซลล์ อย่างไรก็ตาม ยังมีรีพลิคอน P1 ตัวที่สองที่เรียกว่ารีพลิคอนไลติก P1 ซึ่งถูกควบคุมโดยโปรโมเตอร์ ที่เหนี่ยวนำได้ โปรโมเตอร์นี้ช่วยให้สามารถขยายเวกเตอร์ ^ได้มากกว่าหนึ่งสำเนาต่อเซลล์ก่อนการสกัด DNA [ ^{2 ]}

โครโมโซมเทียม P1 (PACs) มีคุณสมบัติทั้งของเวกเตอร์ P1 และโครโมโซมเทียมแบคทีเรีย (BACs) คล้ายกับเวกเตอร์ P1 พวกมันประกอบด้วยพลาสมิดและรีพลิคอนไลติกดังที่กล่าวไว้ข้างต้น แตกต่างจากเวกเตอร์ P1 ตรงที่พวกมันไม่จำเป็นต้องบรรจุลงในอนุภาคแบคทีริโอเฟจเพื่อการถ่ายทอด แต่จะถูกนำเข้าสู่ E. coli ในรูปของโมเลกุล DNA วงกลมผ่านอิเล็กโทรโพเรชันเช่นเดียวกับ BACs ^{[ 2 ]}นอกจากนี้ยังคล้ายกับ BACs การเตรียม PACs ค่อนข้างยากกว่าเนื่องจากมีต้นกำเนิดการจำลองแบบเพียงจุดเดียว^{[ 14 ]}

โครโมโซมเทียมของแบคทีเรีย (BACs) เป็นโมเลกุล DNA วงกลม โดยทั่วไปมีความยาวประมาณ 7 กิโลเบส ซึ่งสามารถบรรจุชิ้นส่วนแทรกที่มีขนาดสูงสุด 300 กิโลเบส เวกเตอร์ BAC ประกอบด้วยรีพลิคอนที่ได้มาจากแฟกเตอร์ F ของ E. coli ซึ่งทำให้มั่นใจได้ว่าจะมีสำเนาเพียงหนึ่งชุดต่อเซลล์^{[ 4 ]}เมื่อชิ้นส่วนแทรกถูกเชื่อมเข้ากับ BAC แล้ว BAC จะถูกนำเข้าสู่ สายพันธุ์ E. coli ที่ขาดความสามารถ ในการรวมตัวใหม่โดยการใช้กระแสไฟฟ้า เวกเตอร์ BAC ส่วนใหญ่มียีนต้านทานยาปฏิชีวนะและเครื่องหมายการคัดเลือกเชิงบวก^{[ 2 ]}ภาพด้านขวาแสดงให้เห็นเวกเตอร์ BAC ที่ถูกตัดด้วยเอนไซม์จำกัด ตามด้วยการแทรก DNA ต่างประเทศที่ถูกเชื่อมต่อใหม่โดยไลเกส โดยรวมแล้ว เวกเตอร์นี้มีความเสถียรมาก แต่การเตรียมอาจทำได้ยากเนื่องจากมีต้นกำเนิดการจำลองแบบเพียงจุดเดียวเช่นเดียวกับ PACs ^{[ 14 ]}

โครโมโซมเทียมของยีสต์ (YACs) เป็นโมเลกุล DNA เชิงเส้นที่มีคุณสมบัติที่จำเป็นของโครโมโซมยีสต์ ที่แท้จริง รวมถึง เทโลเมียร์เซนโทรเมียร์และจุดเริ่มต้นของการจำลองแบบสามารถเชื่อมต่อชิ้นส่วน DNA ขนาดใหญ่เข้ากับตรงกลางของ YAC ได้ ทำให้มี "แขน" ของ YAC อยู่ทั้งสองด้านของชิ้นส่วนที่แทรกเข้าไป YAC ที่สร้างขึ้นใหม่จะถูกนำเข้าสู่ยีสต์โดยการแปลงสภาพ เครื่องหมายที่เลือกได้ที่มีอยู่ใน YAC ช่วยให้สามารถระบุทรานส์ฟอร์แมนต์ที่ประสบความสำเร็จได้ YAC สามารถบรรจุชิ้นส่วนได้ถึง 2000kb แต่ไลบรารี YAC ส่วนใหญ่มีชิ้นส่วนขนาด 250-400kb ในทางทฤษฎีแล้วไม่มีขีดจำกัดสูงสุดของขนาดชิ้นส่วนที่ YAC สามารถบรรจุได้ คุณภาพในการเตรียม DNA ที่ใช้สำหรับชิ้นส่วนที่แทรกจะเป็นตัวกำหนดขีดจำกัดขนาด^{[ 2 ]}แง่มุมที่ท้าทายที่สุดของการใช้ YAC คือความจริงที่ว่าพวกมันมีแนวโน้มที่จะเกิดการจัดเรียงใหม่^{[ 14 ]}

การเลือกเวกเตอร์จำเป็นต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าไลบรารีที่สร้างขึ้นเป็นตัวแทนของจีโนมทั้งหมด ชิ้นส่วนจีโนมใดๆ ที่ได้จากเอนไซม์จำกัดควรมีโอกาสเท่ากันที่จะอยู่ในไลบรารีเมื่อเทียบกับชิ้นส่วนอื่นๆ นอกจากนี้ โมเลกุลรีคอมบิแนนท์ควรมีชิ้นส่วนที่มีขนาดใหญ่พอที่จะทำให้ขนาดของไลบรารีสามารถจัดการได้อย่างสะดวก^{[ 14 ]}โดยเฉพาะอย่างยิ่งสิ่งนี้ถูกกำหนดโดยจำนวนโคลนที่จำเป็นต้องมีในไลบรารี จำนวนโคลนที่จะได้ตัวอย่างของยีนทั้งหมดถูกกำหนดโดยขนาดของจีโนมของสิ่งมีชีวิตรวมถึงขนาดเฉลี่ยของชิ้นส่วน สิ่งนี้แสดงโดยสูตร (หรือที่รู้จักกันในชื่อสูตรคาร์บอนและคลาร์ก): ^{[ 15 ]}

${\displaystyle N={\frac {ln(1-P)}{ln(1-f)}}}$

ที่ไหน,

${\displaystyle N}$คือจำนวนรีคอมบิแนนท์ที่จำเป็น^{[ 16 ]}

${\displaystyle P}$คือความน่าจะเป็นที่ต้องการว่าชิ้นส่วนใดๆ ในจีโนมจะปรากฏอย่างน้อยหนึ่งครั้งในไลบรารีที่สร้างขึ้น

${\displaystyle f}$คือสัดส่วนเศษส่วนของจีโนมในรีคอมบิแนนท์เดี่ยว

${\displaystyle f}$สามารถแสดงให้เห็นเพิ่มเติมได้ว่า:

${\displaystyle f={\frac {i}{g}}}$

ที่ไหน,

${\displaystyle i}$ขนาดของแผ่นแทรกคือ

${\displaystyle g}$ขนาดของจีโนม

ดังนั้น การเพิ่มขนาดของชิ้นส่วนแทรก (โดยการเลือกเวกเตอร์) จะทำให้ต้องใช้โคลนน้อยลงในการแสดงจีโนม สัดส่วนของขนาดชิ้นส่วนแทรกเทียบกับขนาดจีโนมแสดงถึงสัดส่วนของจีโนมแต่ละส่วนในโคลนเดียว^{[ 14 ]}นี่คือสมการที่พิจารณาทุกส่วนแล้ว:

${\displaystyle N={\frac {ln(1-P)}{ln(1-{\frac {i}{g}})}}}$

สูตรข้างต้นสามารถใช้เพื่อกำหนดระดับความเชื่อมั่น 99% ว่าลำดับทั้งหมดในจีโนมนั้นถูกแสดงโดยใช้เวกเตอร์ที่มีขนาดแทรก 20,000 คู่เบส (เช่น เวกเตอร์ของฟาจแลมบ์ดา) ขนาดจีโนมของสิ่งมีชีวิตในตัวอย่างนี้คือ 3,000 คู่เบส

${\displaystyle N={\frac {ln(1-0.99)}{ln[1-{\frac {2.0\times 10^{4}basepairs}{3.0\times 10^{9}basepairs}}]}}}$

${\displaystyle N={\frac {-4.61}{-6.7\times 10^{-6}}}}$

${\displaystyle N=688,060}$โคลน

ดังนั้น จึงจำเป็นต้องใช้โคลนประมาณ 688,060 ตัว เพื่อให้มั่นใจได้ว่ามีความน่าจะเป็น 99% ที่ลำดับดีเอ็นเอที่กำหนดจากจีโนมขนาดสามพันล้านเบสแพร์นี้ จะปรากฏอยู่ในไลบรารีโดยใช้เวกเตอร์ที่มีขนาดแทรกสองหมื่นเบสแพร์

หลังจากสร้างไลบรารีแล้ว จีโนมของสิ่งมีชีวิตสามารถถูกจัดลำดับเพื่ออธิบายว่ายีนมีผลต่อสิ่งมีชีวิตอย่างไร หรือเพื่อเปรียบเทียบสิ่งมีชีวิตที่คล้ายคลึงกันในระดับจีโนมการศึกษาการเชื่อมโยงทั่วทั้งจีโนม ที่กล่าวถึงข้างต้น สามารถระบุยีนเป้าหมายที่มาจากลักษณะการทำงานหลายอย่าง ยีนสามารถแยกได้จากไลบรารีจีโนมและนำไปใช้กับสายเซลล์ของมนุษย์หรือแบบจำลองสัตว์เพื่อการวิจัยเพิ่มเติม^{[ 17 ]}นอกจากนี้ การสร้างโคลนที่มีความแม่นยำสูงด้วยการแสดงจีโนมที่ถูกต้องและไม่มีปัญหาเรื่องความเสถียรจะช่วยได้เป็นอย่างดีในฐานะตัวกลางสำหรับการจัดลำดับแบบช็อตกันหรือการศึกษายีนทั้งหมดในการวิเคราะห์การทำงาน^{[ 10 ]}

การใช้งานหลักอย่างหนึ่งของไลบรารีจีโนมคือการจัดลำดับช็อตกันแบบลำดับชั้นซึ่งเรียกอีกอย่างว่าการจัดลำดับแบบท็อปดาวน์ แบบอิงแผนที่ หรือแบบโคลนต่อโคลน กลยุทธ์นี้ได้รับการพัฒนาขึ้นในช่วงทศวรรษ 1980 สำหรับการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดก่อนที่จะมีเทคนิคการจัดลำดับแบบความเร็วสูง โคลนแต่ละตัวจากไลบรารีจีโนมสามารถถูกตัดเป็นชิ้นส่วนเล็กๆ ซึ่งโดยทั่วไปจะมีขนาด 500bp ถึง 1000bp ซึ่งจัดการได้ง่ายกว่าสำหรับการจัดลำดับ^{[ 4 ]}เมื่อโคลนจากไลบรารีจีโนมได้รับการจัดลำดับแล้ว ลำดับนั้นสามารถนำมาใช้คัดกรองไลบรารีเพื่อหาโคลนอื่นๆ ที่มีชิ้นส่วนแทรกที่ทับซ้อนกับโคลนที่จัดลำดับแล้ว โคลนที่ทับซ้อนใหม่ใดๆ ก็สามารถจัดลำดับได้เพื่อสร้างคอนติ๊กเทคนิคนี้เรียกว่าการเดินโครโมโซมสามารถนำมาใช้เพื่อจัดลำดับโครโมโซมทั้งหมดได้^{[ 2 ]}

การจัดลำดับจีโนมแบบช็อตกัน (Whole genome shotgun sequencing)เป็นอีกวิธีหนึ่งในการจัดลำดับจีโนมที่ไม่ต้องใช้ไลบรารีของเวกเตอร์ความจุสูง แต่จะใช้อัลกอริธึมคอมพิวเตอร์ในการประกอบลำดับสั้นๆ เพื่อครอบคลุมจีโนมทั้งหมด ด้วยเหตุนี้ ไลบรารีจีโนมจึงมักใช้ร่วมกับการจัดลำดับจีโนมแบบช็อตกัน สามารถสร้างแผนที่ความละเอียดสูงได้โดยการจัดลำดับปลายทั้งสองข้างของชิ้นส่วนแทรกจากโคลนหลายๆ ตัวในไลบรารีจีโนม แผนที่นี้ให้ลำดับที่มีระยะห่างที่ทราบ ซึ่งสามารถนำมาใช้ช่วยในการประกอบลำดับที่ได้จากการจัดลำดับแบบช็อตกัน^{[ 4 ]}ลำดับจีโนมมนุษย์ ซึ่งได้รับการประกาศว่าสมบูรณ์ในปี 2546 ได้รับการประกอบโดยใช้ทั้งไลบรารี BAC และการจัดลำดับแบบช็อตกัน^{[ 18 ] [ 19 ]}

การศึกษาการเชื่อมโยงทั่วทั้งจีโนมเป็นการประยุกต์ใช้ทั่วไปเพื่อค้นหาเป้าหมายยีนและโพลีมอร์ฟิซึมที่เฉพาะเจาะจงภายในเผ่าพันธุ์มนุษย์ อันที่จริง โครงการ International HapMap ถูกสร้างขึ้นผ่านความร่วมมือของนักวิทยาศาสตร์และหน่วยงานจากหลายประเทศเพื่อจัดทำแคตตาล็อกและใช้ข้อมูลนี้^{[ 20 ]}เป้าหมายของโครงการนี้คือการเปรียบเทียบลำดับทางพันธุกรรมของบุคคลต่างๆ เพื่อชี้แจงความคล้ายคลึงและความแตกต่างภายในบริเวณโครโมโซม^{[ 20 ]}นักวิทยาศาสตร์จากทุกประเทศที่เข้าร่วมกำลังจัดทำแคตตาล็อกคุณลักษณะเหล่านี้ด้วยข้อมูลจากประชากรที่มีเชื้อสายแอฟริกัน เอเชีย และยุโรป การประเมินทั่วทั้งจีโนมดังกล่าวอาจนำไปสู่การวินิจฉัยและการบำบัดด้วยยาเพิ่มเติม ในขณะเดียวกันก็ช่วยให้ทีมในอนาคตมุ่งเน้นไปที่การวางแผนการรักษาโดยคำนึงถึงคุณลักษณะทางพันธุกรรม แนวคิดเหล่านี้กำลังถูกนำไปใช้ประโยชน์แล้วในวิศวกรรมพันธุกรรม^{[ 20 ]}ตัวอย่างเช่น ทีมวิจัยได้สร้างเวกเตอร์ PAC shuttle ที่สร้างไลบรารีที่แสดงถึงการครอบคลุมจีโนมมนุษย์สองเท่า^{[ 17 ]}สิ่งนี้สามารถทำหน้าที่เป็นแหล่งข้อมูลที่น่าทึ่งในการระบุยีน หรือชุดของยีน ที่ก่อให้เกิดโรค ยิ่งไปกว่านั้น การศึกษาเหล่านี้สามารถใช้เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการตรวจสอบการควบคุมการถอดรหัส ดังที่เห็นได้จากการศึกษาไวรัสบาคุโล^{[ 21 ]}โดยรวมแล้ว ความก้าวหน้าในการสร้างคลังจีโนมและการจัดลำดับดีเอ็นเอทำให้สามารถค้นพบเป้าหมายโมเลกุลต่างๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ^{[ 5 ]}การผสมผสานคุณสมบัติเหล่านี้ผ่านวิธีการที่มีประสิทธิภาพดังกล่าวสามารถเร่งการใช้ตัวยาใหม่ๆ ได้

Klug, Cummings, Spencer, Palladino (2010). สาระสำคัญของพันธุศาสตร์ . เพียร์สัน. หน้า  355–264 . ISBN 978-0-321-61869-6.{{cite book}}: CS1 maint: multiple names: authors list ( link )

• การสร้างไลบรารี BAC จีโนม