วิธีการวิเคราะห์เมทิลเลชันทางเลือกนี้ยังใช้ DNA ที่ผ่านการบำบัดด้วยไบซัลไฟต์ แต่หลีกเลี่ยงความจำเป็นในการจัดลำดับบริเวณที่สนใจ^{[ 16 ]}แทนที่จะเป็นเช่นนั้น คู่ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบให้เป็น "เฉพาะเมทิลเลชัน" โดยการรวมลำดับที่เสริมเฉพาะ5-เมทิลไซโตซีน ที่ไม่ถูกแปลง หรือในทางกลับกัน "เฉพาะไม่เมทิลเลชัน" โดยเสริมไทมีนที่แปลงมาจากไซโตซีนที่ไม่เมทิลเลชัน การเมทิลเลชันถูกกำหนดโดยความสามารถของไพรเมอร์เฉพาะในการทำให้เกิดการขยาย วิธีนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งในการตรวจสอบเกาะ CpGที่อาจมีความหนาแน่นของเมทิลเลชันสูง เนื่องจากจำนวนคู่ CpG ที่เพิ่มขึ้นในไพรเมอร์จะเพิ่มความจำเพาะของการทดสอบ การวางคู่ CpG ที่ปลาย 3' ของไพรเมอร์ยังช่วยเพิ่มความไวอีกด้วย รายงานเบื้องต้นที่ใช้ MSP อธิบายถึงความไวที่เพียงพอในการตรวจจับเมทิลเลชันของอัลลีล 0.1 % โดยทั่วไป MSP และโปรโตคอลที่เกี่ยวข้องถือว่ามีความไวสูงสุดในการตรวจสอบสถานะการเมทิลเลชั่นที่ตำแหน่ง เฉพาะ เจาะจง

วิธี MethyLight ใช้ MSP เป็นพื้นฐาน แต่ให้การวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยใช้PCR เชิงปริมาณ^{[ 17 ]} ใช้ไพรเมอร์เฉพาะเมทิลเลต และยังใช้โพรบรายงานฟลูออเรสเซนซ์เฉพาะเมทิลเลตที่จับกับบริเวณที่ขยาย ในอีกวิธีหนึ่ง สามารถออกแบบไพรเมอร์หรือโพรบโดยไม่ต้องมีความจำเพาะต่อเมทิลเลตหากต้องการแยกแยะระหว่างคู่ CpG ภายในลำดับที่เกี่ยวข้อง การหาปริมาณทำโดยอ้างอิงจาก DNA อ้างอิงที่มีเมทิลเลต การปรับเปลี่ยนโปรโตคอลนี้เพื่อเพิ่มความจำเพาะของ PCR สำหรับ DNA ที่แปลงด้วยไบซัลไฟต์สำเร็จ (ConLight-MSP) ใช้โพรบเพิ่มเติมกับ DNA ที่ไม่ได้แปลงด้วยไบซัลไฟต์เพื่อหาปริมาณการขยายที่ไม่จำเพาะนี้^{[ 18 ]}

ระเบียบวิธีเพิ่มเติมที่ใช้ DNA ที่ขยายด้วย MSP จะวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์โดยใช้การวิเคราะห์เส้นโค้งการหลอมเหลว (Mc-MSP) ^{[ 19 ]} วิธีนี้จะขยาย DNA ที่แปลงด้วยไบซัลไฟต์ด้วยไพรเมอร์เฉพาะสำหรับเมทิลเลตและไพรเมอร์เฉพาะสำหรับไม่มีเมทิลเลต และกำหนดอัตราส่วนเชิงปริมาณของผลิตภัณฑ์ทั้งสองโดยการเปรียบเทียบยอดที่แตกต่างกันที่เกิดขึ้นในการวิเคราะห์เส้นโค้งการหลอมเหลว วิธีการวิเคราะห์การหลอมเหลวที่มีความละเอียดสูงซึ่งใช้ทั้งPCR เชิงปริมาณและการวิเคราะห์การหลอมเหลวได้รับการแนะนำโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการตรวจจับเมทิลเลตระดับต่ำอย่างไว^{[ 20 ]}

วิธีการที่ใช้ ไมโครอาร์เรย์เป็นส่วนขยายเชิงตรรกะของเทคโนโลยีที่มีอยู่สำหรับการวิเคราะห์ DNA ที่ผ่านการบำบัดด้วยไบซัลไฟต์ เพื่อให้สามารถวิเคราะห์เมทิลเลชันทั่วทั้งจีโนมได้[ ^{21 ] ไมโคร}อาร์เรย์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ได้รับการออกแบบโดยใช้คู่ของโพรบไฮบริดไดเซ ชันโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ กำหนดเป้าหมายไป ยังไซต์ CpGที่สนใจ โพรบหนึ่งจะเสริมกับลำดับเมทิลเลชันที่ไม่เปลี่ยนแปลง และอีกโพรบหนึ่งจะเสริมกับลำดับที่ไม่ถูกเมทิลเลชันที่แปลงจาก C เป็น U โพรบเหล่านี้ยังมีความจำเพาะต่อไบซัลไฟต์เพื่อป้องกันการจับกับ DNA ที่แปลงไม่สมบูรณ์โดยไบซัลไฟต์การทดสอบเมทิลเลชันของ Illuminaเป็นหนึ่งในการทดสอบดังกล่าวที่ใช้เทคโนโลยีการจัดลำดับไบซัลไฟต์ในระดับไมโครอาร์เรย์เพื่อสร้างข้อมูลเมทิลเลชันทั่วทั้งจีโนม

การจัดลำดับบิซัลไฟต์ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในจีโนมของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม อย่างไรก็ตาม ความซับซ้อนได้เกิดขึ้นจากการค้นพบการดัดแปลง DNA ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมชนิดใหม่ คือ5- ไฮดรอกซีเมทิลไซโตซีน^{[ 22 ] [ 23 ]} 5-ไฮดรอกซีเมทิลไซโตซีนจะเปลี่ยนเป็นไซโตซีน-5-เมทิลซัลโฟเนตเมื่อได้รับการบำบัดด้วยบิซัลไฟต์ ซึ่งจะถูกอ่านเป็น C เมื่อทำการจัดลำดับ^{[ 24 ]}ดังนั้น การจัดลำดับบิซัลไฟต์จึงไม่สามารถแยกแยะระหว่าง 5-เมทิลไซโตซีนและ 5-ไฮดรอกซีเมทิลไซโตซีนได้ ซึ่งหมายความว่าผลลัพธ์จากการจัดลำดับบิซัลไฟต์ไม่สามารถนิยามได้ว่าเป็นเพียงการเมทิลเลชั่นของ DNA เท่านั้น เนื่องจากเป็นการรวมกันของ 5-เมทิลไซโตซีนและ 5-ไฮดรอกซีเมทิลไซโตซีน

การจัดลำดับบิซัลไฟต์อาศัยการแปลงสารตกค้างไซโตซีนที่ไม่ถูกเมทิลเลตทุกตัวให้เป็นยูราซิล หากการแปลงไม่สมบูรณ์ การวิเคราะห์ในภายหลังจะตีความไซโตซีนที่ไม่ถูกเมทิลเลตที่ไม่ถูกแปลงเป็นไซโตซีนที่ถูกเมทิลเลตอย่างไม่ถูกต้อง ส่งผลให้ได้ ผลลัพธ์ ที่เป็นบวกเท็จสำหรับการเมทิลเลต เฉพาะไซโตซีนในดีเอ็นเอสายเดี่ยวเท่านั้นที่ไวต่อการโจมตีโดยบิซัลไฟต์ ดังนั้นการทำให้ดีเอ็นเอที่กำลังวิเคราะห์เสีย สภาพจึงมีความสำคัญ ^{[ 2 ]}สิ่งสำคัญคือต้องแน่ใจว่าพารามิเตอร์ของปฏิกิริยา เช่น อุณหภูมิและความเข้มข้นของเกลือ เหมาะสมที่จะรักษาดีเอ็นเอให้อยู่ในโครงสร้างสายเดี่ยวและอนุญาตให้มีการแปลงอย่างสมบูรณ์ มีรายงานว่าการฝังดีเอ็นเอใน เจล อะกาโรสช่วยปรับปรุงอัตราการแปลงโดยการทำให้สายดีเอ็นเอแยกออกจากกันทางกายภาพ^{[ 25 ]}อัตราการแปลงที่ไม่สมบูรณ์สามารถประมาณและปรับแก้ได้หลังจากการเรียงลำดับโดยการรวมตัวควบคุมภายในไว้ในไลบรารีการเรียงลำดับ เช่น DNA ของแลมบ์ดาฟาจ (ซึ่งทราบกันว่าไม่มีการเติมหมู่เมทิล) หรือโดยการจัดเรียงลำดับการอ่านแบบไบซัลไฟต์กับบริเวณที่ไม่มีการเติมหมู่เมทิลที่ทราบในสิ่งมีชีวิต เช่น จีโนมของคลอโรพลาสต์^{[ 26 ]}

ความท้าทายสำคัญในการจัดลำดับบิซัลไฟต์คือการเสื่อมสภาพของ DNA ที่เกิดขึ้นพร้อมกับการแปลง เงื่อนไขที่จำเป็นสำหรับการแปลงที่สมบูรณ์ เช่น เวลาการบ่มที่ยาวนาน อุณหภูมิที่สูงขึ้น และความเข้มข้นของบิซัลไฟต์สูง อาจทำให้ DNA ที่บ่มไว้เสื่อมสภาพไปประมาณ 90% ^{[ 27 ]} เนื่องจากปริมาณ DNA เริ่มต้นมักมีจำกัด การเสื่อมสภาพอย่างกว้างขวางเช่นนี้จึงอาจเป็นปัญหาได้ การเสื่อมสภาพเกิดขึ้นใน รูปแบบของการกำจัดพิ วรีนส่งผลให้เกิดการแตกของสายแบบสุ่ม^{[ 28 ]}ดังนั้น ยิ่งแอมพลิคอนPCR ที่ต้องการยาวมาก เท่าใด จำนวนโมเลกุลแม่แบบที่สมบูรณ์ก็จะยิ่งมีจำกัดมากขึ้นเท่านั้น ซึ่งอาจนำไปสู่ความล้มเหลวของการขยายสัญญาณ PCR หรือการสูญเสียข้อมูลที่ถูกต้องเชิงปริมาณเกี่ยวกับระดับเมทิลเลชั่นอันเนื่องมาจากการสุ่มตัวอย่างโมเลกุลแม่แบบที่จำกัด ดังนั้น จึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องประเมินปริมาณการเสื่อมสภาพของ DNA ที่เกิดจากเงื่อนไขของปฏิกิริยาที่ใช้ และพิจารณาว่าสิ่งนี้จะส่งผลต่อแอมพลิคอน ที่ต้องการ อย่างไร เทคนิคต่างๆ สามารถนำมาใช้เพื่อลดการเสื่อมสภาพของ DNA เช่น การปรับอุณหภูมิการบ่มเป็นรอบๆ^{[ 28 ]}

ในปี 2020 New England Biolabsได้พัฒนา NEBNext Enzymatic Methyl-seq ซึ่งเป็นวิธีการทางเอนไซม์ทางเลือกเพื่อลดความเสียหายของ DNA แทนที่จะใช้ไบซัลไฟต์ จะใช้ APOBECในการแปลง C เป็น U ความแตกต่างระหว่าง C, 5mC และ 5hmC เกิดขึ้นจากการดัดแปลงเพิ่มเติมที่ "ปกป้อง" เบสที่ถูกดัดแปลงจาก APOBEC ^{[ 29 ] [ 30 ]}

ปัญหาสำคัญที่อาจเกิดขึ้นหลังจากการบำบัดด้วยไบซัลไฟต์คือการกำจัดซัลโฟเนตของ สารตกค้าง ไพริมิ ดีนไม่สมบูรณ์ เนื่องจากความเป็นด่างของสารละลายไม่เพียงพอ ซึ่งอาจยับยั้งเอนไซม์ DNA polymerase บางชนิด ทำให้การทำ PCR ในภายหลังเป็นไปได้ยาก อย่างไรก็ตาม สามารถหลีกเลี่ยงสถานการณ์นี้ได้โดยการตรวจสอบค่า pHของสารละลายเพื่อให้แน่ใจว่าการกำจัดซัลโฟเนตจะสมบูรณ์^{[ 2 ]}

ข้อกังวลสุดท้ายคือการบำบัดด้วยไบซัลไฟต์จะลดระดับความซับซ้อนของตัวอย่างลงอย่างมาก ซึ่งอาจเป็นปัญหาหากต้องดำเนินการปฏิกิริยา PCR หลายครั้ง (2006) ^{[ 5 ]} การออกแบบ ไพรเมอร์ทำได้ยากขึ้น และการผสมข้ามสายพันธุ์ที่ไม่เหมาะสมเกิดขึ้นบ่อยขึ้น