โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง ( HPLC ) ซึ่งเดิมเรียกว่าโครมาโทกราฟีของเหลวความดันสูงเป็น เทคนิค โครมาโทกราฟีในเคมีวิเคราะห์ ที่ใช้ใน การแยก ระบุ และหาปริมาณส่วนประกอบเฉพาะ ( สารวิเคราะห์ ) ในสารผสม สารผสมเหล่านี้อาจมาจากอาหาร สารเคมี ยา[ 1 ]ชีวภาพสิ่งแวดล้อมและ^{เกษตรกรรมเป็นต้นซึ่ง}ตัวอย่างที่วิเคราะห์เป็นของเหลวหรือละลายอยู่ในของเหลว^{[ 2 ]}

HPLC เป็นเทคนิค โครมาโทกราฟีแบบ คอลัมน์ ที่ใช้แรงดัน โดยใช้ปั๊มแรงดันแทนแรงโน้มถ่วง และใช้คอลัมน์ที่บางและยาวกว่า โดยมีอนุภาคตัวดูดซับขนาดเล็กกว่า ซึ่งช่วยเพิ่มความละเอียดในการวิเคราะห์

HPLC ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านการผลิต ( เช่นในระหว่างกระบวนการผลิตยาและผลิตภัณฑ์ชีวภาพ) ^{[ 3 ] [ 4 ]}ด้านกฎหมาย ( เช่นการตรวจหายาเพิ่มประสิทธิภาพในปัสสาวะ) ^{[ 5 ]}ด้านการวิจัย ( เช่นการแยกส่วนประกอบของตัวอย่างชีวภาพที่ซับซ้อน หรือสารเคมีสังเคราะห์ที่คล้ายคลึงกันออกจากกัน) และด้านการแพทย์ ( เช่นการตรวจวัดระดับวิตามินดีในซีรั่มในเลือด) ^{[ 6 ]}

ปั๊มแรงดันสูงจะบังคับให้ส่วนผสมของตัวทำละลายต่างๆ (เฟสเคลื่อนที่เช่นน้ำบัฟเฟอร์ อะซีโตไนไตรล์และ/หรือเมทานอล ) ไหลผ่านส่วนผสม ของตัวอย่างและดูดซับสารวิเคราะห์ ส่งไปยังกระบอก ( คอลัมน์โครมาโทกราฟี ) คอลัมน์นี้เต็มไปด้วยอนุภาคของแข็งที่ทำจากวัสดุดูดซับ ( เฟสคงที่ ) อนุภาคเหล่านี้มักทำจากซิลิกาโพลิเมอร์ และมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 1.5–50 ไมโครเมตร^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]}การชะล้างเกิดขึ้นเมื่อเฟสเคลื่อนที่ผ่านเฟสคงที่ ส่วนประกอบแต่ละชนิดในตัวอย่างจะทำปฏิกิริยากับวัสดุดูดซับและตัวทำละลายแตกต่างกัน ดังนั้นอัตราการชะล้างจึงแตกต่างกัน^{[ 2 ]}อัตราที่แตกต่างกันเหล่านี้ทำให้เกิดการแยกวิเคราะห์ของสารในของเหลวที่ไหลออกจากคอลัมน์ (สารชะล้าง) สารชะล้างจะเข้าสู่เครื่องตรวจจับโครมาโทกราฟี เฉพาะ เช่นเครื่องตรวจจับ UVซึ่งจะสร้างกราฟ ( โครมาโทแกรม ) โครมาโทแกรมคือกราฟแสดงความเข้มของสัญญาณตรวจจับเทียบกับเวลาหรือปริมาตรของเฟสเคลื่อนที่ หากสารวิเคราะห์แยกออกจากกันได้ดี โครมาโทแกรมจะแสดงยอดที่แยกออกจากกันได้ดี โดยมีหนึ่งยอดต่อสารวิเคราะห์หนึ่งชนิด สารวิเคราะห์แต่ละชนิดจะปรากฏในช่วงเวลาที่กำหนด (เวลาการคงตัว) โดยมีพื้นที่เป็นสัดส่วนกับปริมาณของสารวิเคราะห์นั้น^{[ 7 ]}

โครมาโทกราฟีสามารถอธิบายได้ว่าเป็นกระบวนการถ่ายโอนมวล ที่เกี่ยวข้องกับ การดูดซับและ/หรือการแบ่งส่วนดังที่กล่าวมาแล้ว HPLC อาศัยปั๊มในการส่งของเหลวที่มีแรงดันและส่วนผสมของตัวอย่างผ่านคอลัมน์ที่บรรจุด้วยสารดูดซับ (ส่วนประกอบที่ใช้งานของคอลัมน์) สารวิเคราะห์บางชนิดอาจยึดติดกับสารดูดซับมากกว่าตัวทำละลาย ในขณะที่สารวิเคราะห์อื่นๆ อาจทำตรงกันข้าม กล่าวคือ สารวิเคราะห์อาจมีค่าสัมประสิทธิ์การแบ่งส่วน ที่แตกต่างกัน ซึ่งนำไปสู่การแยกสารวิเคราะห์ ปฏิสัมพันธ์ระหว่างสารวิเคราะห์ เฟสของแข็ง และเฟสของเหลว เป็นแบบย้อนกลับได้ทางกายภาพหรือทางเคมี โดยปกติจะเป็นการรวมกันของปฏิสัมพันธ์ที่ไม่ใช่พันธะโควาเลนต์^{[ 10 ] [ 11 ]}

เครื่องโครมาโทกราฟของเหลวมีความซับซ้อน^{[ 12 ]}และมีเทคโนโลยีที่ซับซ้อนและละเอียดอ่อน เพื่อให้สามารถใช้งานระบบได้อย่างถูกต้อง จำเป็นต้องมีความเข้าใจพื้นฐานขั้นต่ำเกี่ยวกับวิธีการประมวลผลข้อมูลของอุปกรณ์เพื่อหลีกเลี่ยงข้อมูลที่ไม่ถูกต้องและผลลัพธ์ที่บิดเบือน^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]}

HPLC แตกต่างจากโครมาโทกราฟีของเหลว แบบดั้งเดิม ("ความดันต่ำ") เนื่องจากความดันในการทำงานสูงกว่ามาก (ประมาณ 50–1400 บาร์) ในขณะที่โครมาโทกราฟีของเหลวทั่วไปมักอาศัยแรงโน้มถ่วงในการส่งผ่านเฟสเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ที่บรรจุไว้ เนื่องจากปริมาณตัวอย่างที่แยกใน HPLC วิเคราะห์มีน้อย ขนาดของคอลัมน์โดยทั่วไปจึงมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 2.1–4.6 มม. และความยาว 30–250 มม. นอกจากนี้ คอลัมน์ HPLC ยังทำจากอนุภาคดูดซับที่มีขนาดเล็กกว่า (ขนาดอนุภาคเฉลี่ย 1.5–50 μm) ทำให้ HPLC มีความสามารถในการแยกสารผสมได้ดีกว่า (ความสามารถในการแยกแยะระหว่างสารประกอบ) ในระยะเวลาที่สั้นกว่า ซึ่งทำให้เป็นเทคนิคโครมาโทกราฟีที่ได้รับความนิยม^{[ 16 ]}

โดยทั่วไปแล้ว แผนผังของเครื่องมือ HPLC จะประกอบด้วยอ่างเก็บตัวทำละลาย ปั๊มหนึ่งตัวหรือมากกว่านั้นเครื่องกำจัด ก๊าซในตัวทำละลาย เครื่องเก็บตัวอย่าง คอลัมน์ และตัวตรวจจับ ตัวทำละลายจะถูกเตรียมล่วงหน้าตามความต้องการของการแยกสาร จากนั้นจะผ่านเครื่องกำจัดก๊าซเพื่อกำจัดก๊าซที่ละลายอยู่ ผสมกันเพื่อเป็นเฟสเคลื่อนที่ แล้วไหลผ่านเครื่องเก็บตัวอย่าง ซึ่งจะนำส่วนผสมของตัวอย่างเข้าสู่กระแสเฟสเคลื่อนที่ จากนั้นจึงนำตัวอย่างไปยังคอลัมน์ ปั๊มจะส่งเฟสเคลื่อนที่ในปริมาณและองค์ประกอบที่ต้องการผ่านเฟสคงที่ภายในคอลัมน์ จากนั้นส่งตรงไปยังเซลล์ไหลภายในตัวตรวจจับ ตัวตรวจจับจะสร้างสัญญาณที่แปรผันตามปริมาณของส่วนประกอบตัวอย่างที่ออกมาจากคอลัมน์ จึงทำให้สามารถ วิเคราะห์ เชิงปริมาณของส่วนประกอบตัวอย่างได้ ตัวตรวจจับยังบันทึกเวลาที่สารออกมา หรือเวลาการคงตัว ซึ่งใช้สำหรับการระบุส่วนประกอบเบื้องต้น ตัวตรวจจับที่ทันสมัยกว่านั้นยังให้ข้อมูลเพิ่มเติมที่เฉพาะเจาะจงกับลักษณะของสารวิเคราะห์ เช่นสเปกตรัมUV-VIS หรือ สเปกตรัมมวลซึ่งสามารถให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับลักษณะโครงสร้างของสารได้ เครื่องตรวจจับเหล่านี้มีการใช้งานทั่วไป เช่น UV/Vis, เครื่องตรวจจับอาร์เรย์ โฟโตไดโอด (PDA) / เครื่องตรวจจับอาร์เรย์ไดโอดและเครื่องตรวจจับสเปกโทรเมตรีมวล^{[ 17 ] [ 18 ]}

ไมโครโปรเซสเซอร์ดิจิทัลและซอฟต์แวร์ผู้ใช้ควบคุมเครื่องมือ HPLC และให้การวิเคราะห์ข้อมูล ปั๊มเชิงกลบางรุ่นในเครื่องมือ HPLC สามารถผสมตัวทำละลายหลายชนิดเข้าด้วยกันในอัตราส่วนที่เปลี่ยนแปลงตามเวลา ทำให้เกิดการไล่ระดับ องค์ประกอบ ในเฟสเคลื่อนที่ เครื่องมือ HPLC รุ่นใหม่มีเตาอบคอลัมน์ที่ช่วยให้สามารถปรับอุณหภูมิที่ใช้ในการแยกได้^{[ 19 ]}

ตัวอย่างผสมที่จะแยกและวิเคราะห์จะถูกป้อนเข้าไปในปริมาตรเล็กน้อย (โดยทั่วไปคือไมโครลิตร) ในกระแสของเฟสเคลื่อนที่ที่ไหลผ่านคอลัมน์ ส่วนประกอบของตัวอย่างจะเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ด้วยความเร็วที่แตกต่างกัน ซึ่งเป็นผลมาจากปฏิกิริยาทางกายภาพเฉพาะกับสารดูดซับหรือเฟสคงที่ ความเร็วของแต่ละส่วนประกอบขึ้นอยู่กับลักษณะทางเคมีของส่วนประกอบนั้น ลักษณะของเฟสคงที่ (ภายในคอลัมน์) และองค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่ เวลาที่สารวิเคราะห์เฉพาะตัวหนึ่งถูกชะล้างออกมา (ปรากฏออกจากคอลัมน์) เรียกว่าเวลาการกักเก็บ เวลาการกักเก็บที่วัดได้ภายใต้เงื่อนไขเฉพาะนั้นเป็นลักษณะเฉพาะที่ใช้ในการระบุสารวิเคราะห์นั้นๆ

มีคอลัมน์หลายประเภทให้เลือกใช้ โดยบรรจุด้วยสารดูดซับที่มีขนาดอนุภาคความพรุนและเคมีพื้นผิวแตกต่างกัน การใช้สารบรรจุที่มีขนาดอนุภาคเล็กกว่านั้นจำเป็นต้องใช้แรงดันในการทำงานที่สูงขึ้น ("แรงดันย้อนกลับ") และโดยทั่วไปจะช่วยปรับปรุงความละเอียด ในการแยกสารด้วยโครมาโทกราฟี (ระดับการแยกพีคระหว่างสารวิเคราะห์ที่ต่อเนื่องกันที่ออกมาจากคอลัมน์) อนุภาคของสารดูดซับอาจมีลักษณะเป็นไอออนิก ไฮโดรโฟบิก หรือโพลาร์

วิธีการโครมาโทกราฟีของเหลวที่พบได้บ่อยที่สุดคือแบบเฟสผกผัน (reversed phase ) โดยเฟสเคลื่อนที่ที่ใช้จะเป็นส่วนผสมที่เข้ากันได้ของน้ำหรือบัฟเฟอร์กับตัวทำละลายอินทรีย์ต่างๆ (ที่พบได้บ่อยที่สุดคืออะซีโตไนไตรล์และเมทานอล) เทคนิค HPLC บางวิธีใช้เฟสเคลื่อนที่ที่ปราศจากน้ำ (ดู โครมาโท กราฟีแบบเฟสปกติ (normal-phase chromatography ) ด้านล่าง) ส่วนประกอบที่เป็นน้ำของเฟสเคลื่อนที่อาจมีกรด (เช่น กรดฟอร์มิก กรดฟอสฟอริก หรือกรดไตรฟลูออโรอะเซติก ) หรือเกลือเพื่อช่วยในการแยกส่วนประกอบของตัวอย่าง องค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่อาจคงที่ ("โหมดการชะแบบไอโซคราติก") หรือเปลี่ยนแปลง ("โหมดการชะแบบไล่ระดับ") ในระหว่างการวิเคราะห์โครมาโทกราฟี การชะแบบไอโซคราติกมักมีประสิทธิภาพในการแยกสารผสมอย่างง่าย การชะแบบไล่ระดับจำเป็นสำหรับสารผสมที่ซับซ้อน ซึ่งมีการปฏิสัมพันธ์ที่แตกต่างกันกับเฟสคงที่และเฟสเคลื่อนที่ นี่คือเหตุผลที่ในการชะแบบไล่ระดับ องค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่มักจะเปลี่ยนแปลงจากความแรงในการชะต่ำไปสูง ความแรงในการชะล้างของเฟสเคลื่อนที่สะท้อนให้เห็นได้จากเวลาการคงอยู่ของสารวิเคราะห์ เนื่องจากความแรงในการชะล้างสูงจะทำให้การชะล้างเร็วขึ้น (ส่งผลให้เวลาการคงอยู่สั้นลง) ตัวอย่างเช่น โปรไฟล์การไล่ระดับทั่วไปในโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผันอาจเริ่มต้นที่อะซีโตไนไตรล์ 5% (ในน้ำหรือบัฟเฟอร์ที่เป็นน้ำ) และค่อยๆ เพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรงจนถึงอะซีโตไนไตรล์ 95% ในช่วงเวลา 5–25 นาที ช่วงเวลาที่องค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่คงที่ (ช่วงคงที่) อาจเป็นส่วนหนึ่งของโปรไฟล์การไล่ระดับด้วยเช่นกัน ตัวอย่างเช่น องค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่อาจคงที่ที่อะซีโตไนไตรล์ 5% เป็นเวลา 1–3 นาที ตามด้วยการเปลี่ยนแปลงเชิงเส้นจนถึงอะซีโตไนไตรล์ 95%

องค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่ที่เลือกใช้ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของปฏิกิริยาระหว่างส่วนประกอบต่างๆ ของตัวอย่าง ("สารวิเคราะห์") กับเฟสคงที่ ( เช่นปฏิกิริยาแบบไม่ชอบน้ำใน HPLC แบบเฟสผกผัน) สารวิเคราะห์จะกระจายตัวระหว่างเฟสคงที่และเฟสเคลื่อนที่ตามความสัมพันธ์ของสารกับเฟสเคลื่อนที่และเฟสเคลื่อนที่ กระบวนการกระจายตัวนี้คล้ายกับกระบวนการสกัดของเหลวต่อของเหลวแต่เป็นกระบวนการต่อเนื่อง ไม่ใช่แบบเป็นขั้นๆ

ในตัวอย่างที่ใช้การไล่ระดับความเข้มข้นของน้ำ/อะซีโตไนไตรล์ ส่วนประกอบที่มีคุณสมบัติไม่ชอบน้ำมากกว่าจะถูกชะล้างออกมา (แยกออกจากคอลัมน์) ในภายหลัง จากนั้น เมื่อเฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยอะซีโตไนไตรล์มากขึ้น ( เช่นเฟสเคลื่อนที่กลายเป็นสารละลายที่ถูกชะล้างมากขึ้น) การชะล้างของส่วนประกอบเหล่านั้นก็จะเร็วขึ้น

การเลือกส่วนประกอบของเฟสเคลื่อนที่ สารเติมแต่ง (เช่น เกลือหรือกรด) และสภาวะการไล่ระดับความเข้มข้นนั้นขึ้นอยู่กับลักษณะของคอลัมน์และส่วนประกอบของตัวอย่าง บ่อยครั้งที่ต้องทดลองกับตัวอย่างหลายครั้งเพื่อหาว่าวิธี HPLC ใดให้ผลการแยกที่เหมาะสม

ก่อนที่จะมีการใช้ HPLC นักวิทยาศาสตร์ใช้เทคนิคโครมาโทกราฟีของเหลวแบบคอลัมน์บนโต๊ะ ระบบโครมาโทกราฟีของเหลวส่วนใหญ่ไม่มีประสิทธิภาพเนื่องจากอัตราการไหลของตัวทำละลายขึ้นอยู่กับแรงโน้มถ่วง การแยกสารใช้เวลาหลายชั่วโมง และบางครั้งอาจใช้เวลาหลายวันกว่าจะเสร็จสมบูรณ์ ในขณะนั้น โครมาโทกราฟีแก๊ส (GC) มีประสิทธิภาพมากกว่าโครมาโทกราฟีของเหลว (LC) อย่างไรก็ตาม เป็นที่ชัดเจนว่าการแยกและการวิเคราะห์เฟสแก๊สของไบโอพอลิเมอร์ที่ มีน้ำหนักโมเลกุลสูงและมีขั้วมากนั้น เป็นไปไม่ได้^{[ 20 ]} GC ไม่ได้ผลสำหรับการใช้งานด้านวิทยาศาสตร์ชีวภาพและสุขภาพหลายอย่างสำหรับไบโอโมเลกุล เนื่องจากส่วนใหญ่ไม่ระเหยและไม่เสถียรต่อความร้อนที่อุณหภูมิสูงของ GC ^{[ 21 ]}ด้วยเหตุนี้ จึงมีการตั้งสมมติฐานเกี่ยวกับวิธีการทางเลือก ซึ่งในไม่ช้าก็จะนำไปสู่การพัฒนา HPLC

จากผลงานสำคัญของ Martin และ Synge ในปี 1941 Calvin Giddings [ ^{22 ] Josef Huber และคนอื่นๆ ได้ทำนายไว้ในช่วงทศวรรษ 1960 ว่า LC สามารถทำงานในโหมดประสิทธิภาพสูง ได้}โดยการลดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของอนุภาคบรรจุลงต่ำกว่าระดับ LC (และ GC) ทั่วไปที่ 150 μm และใช้แรงดันเพื่อเพิ่มความเร็วของเฟสเคลื่อนที่^{[ 20 ]}การทำนายเหล่านี้ได้รับการทดลองและปรับปรุงอย่างกว้างขวางตลอดช่วงทศวรรษ 1960 จนถึงทศวรรษ 1970 จนถึงปัจจุบัน^{[ 23 ]}การวิจัยพัฒนาในระยะแรกเริ่มปรับปรุงอนุภาค LC ตัวอย่างเช่น Zipax ที่มีประวัติยาวนาน ซึ่งเป็นอนุภาคที่มีรูพรุนที่ผิว^{[ 24 ]}

ทศวรรษ 1970 นำมาซึ่งการพัฒนามากมายในด้านฮาร์ดแวร์และเครื่องมือ นักวิจัยเริ่มใช้ปั๊มและหัวฉีดเพื่อสร้างการออกแบบระบบ HPLC ขั้นพื้นฐาน^{[ 25 ]}ปั๊มขยายแก๊สเหมาะอย่างยิ่งเพราะทำงานที่ความดัน คงที่ และไม่จำเป็นต้องใช้ซีลกันรั่วหรือวาล์วตรวจสอบเพื่อการไหลที่คงที่และการวัดปริมาณที่ดี^{[ 21 ]}ความก้าวหน้าด้านฮาร์ดแวร์เกิดขึ้นที่ Dupont IPD (Industrial Polymers Division) เช่น การใช้อุปกรณ์ไล่ระดับปริมาตรต่ำ รวมถึงการแทนที่หัวฉีดเซปตัมด้วยวาล์วฉีดแบบวนรอบ^{[ 21 ]}

แม้ว่าการพัฒนาเครื่องมือจะเป็นสิ่งสำคัญ แต่ประวัติศาสตร์ของ HPLC นั้นส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับประวัติศาสตร์และวิวัฒนาการของเทคโนโลยีอนุภาค [ ^{21 ] [ 26 ] หลังจาก}การนำอนุภาคชั้นพรุนมาใช้ ก็มีแนวโน้มที่ลดขนาดอนุภาคลงอย่างต่อเนื่องเพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพ^{[ 21 ]}อย่างไรก็ตาม การลดขนาดอนุภาคทำให้เกิดปัญหาใหม่ขึ้น ข้อเสียในทางปฏิบัติเกิดจากแรงดันตกคร่อมที่มากเกินไปซึ่งจำเป็นต่อการบังคับของเหลวเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ และความยากลำบากในการเตรียมการบรรจุวัสดุละเอียดมากอย่างสม่ำเสมอ^{[ 27 ]}ทุกครั้งที่ขนาดอนุภาคลดลงอย่างมีนัยสำคัญ มักจะต้องมีการพัฒนาเครื่องมืออีกรอบเพื่อรองรับแรงดัน^{[ 23 ] [ 21 ]}

โครมาโทกราฟีแบบแบ่งส่วนเป็นหนึ่งในโครมาโทกราฟีประเภทแรกๆ ที่นักเคมีพัฒนาขึ้น และแทบไม่ได้ใช้ในปัจจุบัน^{[ 28 ]}หลักการสัมประสิทธิ์การแบ่งส่วนถูกนำไปใช้ในโครมาโทกราฟีแบบกระดาษ โคร มาโทกราฟีแบบชั้นบาง การแยกเฟสแก๊สและ การ แยกของเหลว-ของเหลวรางวัลโนเบล สาขาเคมีประจำ ปี 1952 ได้รับโดยArcher John Porter MartinและRichard Laurence Millington Synge สำหรับ การพัฒนาเทคนิคนี้ ซึ่งใช้ในการแยกกรดอะมิโน ของพวกเขา ^{[ 29 ]}โครมาโทกราฟีแบบแบ่งส่วนใช้ตัวทำละลายที่กักเก็บไว้บนพื้นผิวหรือภายในเม็ดหรือเส้นใยของเมทริกซ์รองรับของแข็ง "เฉื่อย" เช่นเดียวกับโครมาโทกราฟีแบบกระดาษ หรือใช้ประโยชน์จากปฏิกิริยาคูลอมบ์และ/หรือตัวให้ไฮโดรเจนกับเฟสคงที่ โมเลกุลของสารวิเคราะห์จะแบ่งส่วนระหว่างเฟสคงที่ที่เป็นของเหลวและตัวชะล้าง เช่นเดียวกับในโครมาโทกราฟีปฏิสัมพันธ์ไฮโดรฟิลิก (HILIC; เทคนิคย่อยภายใน HPLC) วิธีนี้จะแยกสารวิเคราะห์ตามความแตกต่างของขั้ว HILIC มักใช้เฟสคงที่ แบบมีขั้วที่ยึดติดและเฟสเคลื่อนที่ที่ทำจาก อะซีโตไนไตรล์เป็นหลักโดยมีน้ำเป็นส่วนประกอบที่แข็งแรง HPLC แบบแบ่งส่วนถูกใช้ในอดีตบนตัวรองรับซิลิกาหรืออะลูมินาที่ไม่ยึดติด แต่ละวิธีทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพสำหรับการแยกสารวิเคราะห์ตามความแตกต่างของขั้วสัมพัทธ์ เฟสที่ยึดติดของ HILIC มีข้อได้เปรียบในการแยก สารละลายที่ เป็นกรดเบสและเป็นกลางในการดำเนินการโครมาโทกราฟีเพียงครั้งเดียว^{[ 30 ]}

สารวิเคราะห์ที่มีขั้วจะแพร่เข้าสู่ชั้นน้ำที่อยู่กับที่ซึ่งเกี่ยวข้องกับเฟสคงที่ที่มีขั้ว และถูกกักเก็บไว้ ยิ่งปฏิกิริยาระหว่างสารวิเคราะห์ที่มีขั้วและเฟสคงที่ที่มีขั้ว (เมื่อเทียบกับเฟสเคลื่อนที่) แข็งแกร่งมากเท่าใด เวลาในการชะล้างก็จะยิ่งนานขึ้นเท่านั้น ความแข็งแกร่งของปฏิกิริยาขึ้นอยู่กับหมู่ฟังก์ชันที่เป็นส่วนหนึ่งของโครงสร้างโมเลกุลของสารวิเคราะห์ โดยหมู่ที่มีขั้วมากขึ้น ( เช่น หมู่ ไฮดรอกซิล) และหมู่ที่สามารถสร้างพันธะไฮโดรเจนได้จะทำให้เกิดการกักเก็บมากขึ้นปฏิกิริยาคูลอมบ์ (ไฟฟ้าสถิต) ก็สามารถเพิ่มการกักเก็บได้เช่นกัน การใช้ตัวทำละลายที่มีขั้วมากขึ้นในเฟสเคลื่อนที่จะลดเวลาการกักเก็บของสารวิเคราะห์ ในขณะที่ตัวทำละลายที่ไม่ชอบน้ำมากขึ้นมักจะเพิ่มเวลาการกักเก็บ

โครมาโทกราฟีแบบเฟสปกติ (Normal–phase chromatography) เป็นหนึ่งในวิธีการ HPLC ประเภทแรกๆ ที่นักเคมีพัฒนาขึ้น แต่การใช้งานลดลงในช่วงหลายทศวรรษที่ผ่านมา วิธีนี้เรียกอีกอย่างว่า HPLC แบบเฟสปกติ (NP-HPLC) โดยแยกสารวิเคราะห์ตามความสัมพันธ์ของสารวิเคราะห์กับพื้นผิวคงที่ที่มีขั้ว เช่น ซิลิกา ดังนั้นจึงอาศัยความสามารถของสารวิเคราะห์ในการสร้างปฏิกิริยาแบบมีขั้ว (เช่นพันธะไฮโดรเจนหรือ ปฏิกิริยาแบบ ไดโพล-ไดโพล ) กับพื้นผิวของสารดูดซับ NP-HPLC ใช้เฟสเคลื่อนที่ที่ไม่มีขั้ว และไม่ใช่น้ำ ( เช่นคลอโรฟอร์ม ) และทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพในการแยกสารวิเคราะห์ที่ละลายได้ง่ายในตัวทำละลายที่ไม่มีขั้ว สารวิเคราะห์จะจับตัวและถูกกักไว้โดยเฟสคงที่ที่มีขั้ว ความแรงของการดูดซับจะเพิ่มขึ้นตามความมีขั้วของสารวิเคราะห์ที่เพิ่มขึ้น ความแรงของปฏิกิริยาขึ้นอยู่กับไม่เพียงแต่หมู่ฟังก์ชันที่มีอยู่ในโครงสร้างของโมเลกุลของสารวิเคราะห์เท่านั้น แต่ยังขึ้นอยู่กับปัจจัยทางสเตอริกด้วย ผลกระทบของสิ่งกีดขวางเชิงสเตอริกต่อความแข็งแรงของการปฏิสัมพันธ์ทำให้วิธีการนี้สามารถแยกแยะไอโซเมอร์เชิงโครงสร้างได้

การใช้ตัวทำละลายที่มีขั้วมากขึ้นในเฟสเคลื่อนที่จะช่วยลดเวลาการคงตัวของสารวิเคราะห์ ในขณะที่ตัวทำละลายที่ไม่ชอบน้ำมักจะทำให้การชะล้างช้าลง (เวลาการคงตัวเพิ่มขึ้น) ตัวทำละลายที่มีขั้วสูงมาก เช่น น้ำปริมาณเล็กน้อยในเฟสเคลื่อนที่ มีแนวโน้มที่จะดูดซับกับพื้นผิวของแข็งของเฟสคงที่ ทำให้เกิดชั้นยึดติด (น้ำ) ที่ถือว่ามีบทบาทสำคัญในการคงตัว พฤติกรรมนี้ค่อนข้างเฉพาะเจาะจงสำหรับโครมาโทกราฟีแบบเฟสปกติ เนื่องจากถูกควบคุมเกือบทั้งหมดโดยกลไกการดูดซับ ( กล่าวคือสารวิเคราะห์มีปฏิสัมพันธ์กับพื้นผิวของแข็งมากกว่ากับชั้นของลิแกนด์ที่ติดอยู่กับพื้นผิวของตัวดูดซับ ดูเพิ่มเติมที่ HPLC แบบเฟสผกผันด้านล่าง) โครมาโทกราฟีแบบดูดซับยังคงใช้สำหรับการแยกไอโซเมอร์โครงสร้างในรูปแบบโครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์และแบบแผ่นบางบนตัวรองรับซิลิกาหรืออะลูมินาที่ผ่านการกระตุ้น (แห้ง) อยู่บ้าง

เทคนิค Partition-HPLC และ NP-HPLC ไม่เป็นที่นิยมในช่วงทศวรรษ 1970 เนื่องจากการพัฒนาเทคนิคReversed-phase HPLC ขึ้นมา เพราะความไม่สม่ำเสมอของเวลาการคงตัว (repeatability of retention time) อันเนื่องมาจากการมีชั้นน้ำหรือตัวทำละลายอินทรีย์ที่มีโปรตอนอยู่บนพื้นผิวของตัวกลางโครมาโทกราฟีซิลิกาหรืออะลูมินาชั้นนี้จะเปลี่ยนแปลงไปตามการเปลี่ยนแปลงองค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่ ( เช่นระดับความชื้น) ทำให้เวลาการคงตัวคลาดเคลื่อนไป

เมื่อไม่นานมานี้ โครมาโทกราฟีแบบแบ่งส่วนกลับมาได้รับความนิยมอีกครั้ง เนื่องจากการพัฒนา เฟสที่ยึดติดด้วย Hilicซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการทำซ้ำที่ดีขึ้น และเนื่องจากความเข้าใจที่ดียิ่งขึ้นเกี่ยวกับขอบเขตการใช้งานของเทคนิคนี้

การใช้โครมาโทกราฟีแบบการแทนที่ค่อนข้างจำกัด และส่วนใหญ่ใช้สำหรับโครมาโทกราฟีแบบเตรียมการ หลักการพื้นฐานขึ้นอยู่กับโมเลกุลที่มีความสัมพันธ์สูงกับเมทริกซ์โครมาโทกราฟี (ตัวแทนที่) ซึ่งใช้ในการแข่งขันอย่างมีประสิทธิภาพสำหรับตำแหน่งการจับ และด้วยเหตุนี้จึงแทนที่โมเลกุลทั้งหมดที่มีความสัมพันธ์น้อยกว่า^{[ 31 ]} มีความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่างโครมาโทกราฟีแบบการแทนที่และการชะล้าง ในโหมดการชะล้าง สารต่างๆ มักจะปรากฏออกจากคอลัมน์เป็นยอดแคบๆ แบบเกาส์เซียน การแยกยอดที่กว้าง โดยเฉพาะอย่างยิ่งถึงเส้นฐาน เป็นสิ่งที่ต้องการเพื่อให้ได้การทำให้บริสุทธิ์สูงสุด ความเร็วที่ส่วนประกอบใดๆ ของสารผสมเคลื่อนที่ลงไปในคอลัมน์ในโหมดการชะล้างขึ้นอยู่กับหลายปัจจัย แต่เพื่อให้สารสองชนิดเคลื่อนที่ด้วยความเร็วที่ต่างกัน และแยกออกจากกันได้ จะต้องมีความแตกต่างอย่างมากในปฏิสัมพันธ์บางอย่างระหว่างโมเลกุลชีวภาพและเมทริกซ์โครมาโทกราฟี พารามิเตอร์การทำงานจะถูกปรับเพื่อเพิ่มผลกระทบของความแตกต่างนี้ให้สูงสุด ในหลายกรณี การแยกพีคออกจากกันอย่างชัดเจนนั้นทำได้เฉพาะด้วยการชะล้างแบบไล่ระดับความเข้มข้นและการบรรจุคอลัมน์ในปริมาณน้อยเท่านั้น ดังนั้น ข้อเสียสองประการของการโครมาโทกราฟีแบบชะล้าง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในระดับการเตรียมสาร คือ ความซับซ้อนในการดำเนินงาน เนื่องจากการปั๊มตัวทำละลายแบบไล่ระดับความเข้มข้น และปริมาณงานที่ต่ำ เนื่องจากการบรรจุคอลัมน์ในปริมาณน้อย โครมาโทกราฟีแบบการแทนที่ (Displacement chromatography) มีข้อดีกว่าโครมาโทกราฟีแบบชะล้างตรงที่สารประกอบต่างๆ จะถูกแยกออกเป็นโซนของสารบริสุทธิ์ต่อเนื่องกัน แทนที่จะเป็น "พีค" เนื่องจากกระบวนการนี้ใช้ประโยชน์จากความไม่เป็นเชิงเส้นของไอโซเทอร์ม จึงสามารถแยกสารที่ป้อนเข้าคอลัมน์ในปริมาณที่มากขึ้นได้บนคอลัมน์ที่กำหนด โดยสารประกอบที่บริสุทธิ์แล้วจะมีความเข้มข้นสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ

โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงแบบย้อนกลับ (RP-HPLC) ^{[ 32 ]}เป็นโหมดโครมาโทกราฟีที่แพร่หลายที่สุด มีเฟสคงที่ที่ไม่เป็นขั้วและเฟสเคลื่อนที่ที่เป็นน้ำและมีขั้วปานกลาง RP-HPLC เป็นที่นิยมใช้ในหมู่นักชีววิทยาและผู้ใช้ด้านวิทยาศาสตร์ชีวภาพ จนมักเรียกกันง่ายๆ ว่า "HPLC" อุตสาหกรรมยาใช้ RP-HPLC เป็นประจำเพื่อตรวจสอบคุณภาพของยาก่อนวางจำหน่าย

ในวิธีการแยกด้วยเฟสผกผัน สารที่มีคุณสมบัติไม่ชอบน้ำจะถูกกักเก็บไว้ในระบบได้ดีกว่า สำหรับการกักเก็บสารอินทรีย์ เฟสคงที่ส่วนใหญ่ประกอบด้วยเม็ดซิลิกาเจลที่มีรูพรุนบรรจุอยู่ในคอลัมน์ โดยทั่วไปจะมีรูปร่างเป็นทรงกลมที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางแตกต่างกัน (น้อยกว่า 2, 3, 5, 7, 10 ไมโครเมตร ) และมีเส้นผ่านศูนย์กลางรูพรุนแตกต่างกัน (60, 100, 150, 300 อังสตรอม ) บนพื้นผิวของเม็ดซิลิกาเจลจะมีลิแกนด์แอลคิลสายตรงที่เชื่อมต่อทางเคมี เช่น C3, C4, C8, C18 ตัวเลขนี้บอกจำนวนอะตอมคาร์บอนในลิแกนด์ ตัวอย่างเช่น ลิแกนด์ C3 ​​คือโพรพิลยิ่งลิแกนด์ไฮโดรคาร์บอนบนเฟสคงที่ยาวเท่าไหร่ ก็ยิ่งสามารถกักเก็บส่วนประกอบของตัวอย่างได้นานขึ้นเท่านั้น วิธีการแยกสารชีวการแพทย์ส่วนใหญ่ในปัจจุบันใช้เฟสคงที่ C18 ซึ่งบางครั้งเรียกด้วยชื่อทางการค้า เช่น ODS (octadecylsilane) หรือ RP-18 (Reversed Phase 18) ในการสร้างเฟสคงที่ดังกล่าว จะต้องปรับสภาพพื้นผิวของอนุภาคซิลิกาเจลด้วย RMe 2 โดยที่ R คือหมู่แอลคิลสายตรง เช่น C H หรือ C H

เพื่อแยกสารประกอบอะโรมาติกหรือโดยทั่วไปคือสารประกอบที่มีพันธะไพ จำนวนมาก เฟสคงที่สามารถมี ลิแกนด์ ฟีนิลที่พื้นผิวได้

ที่ค่า pH น้อยกว่า 2 พันธะระหว่างลิแกนด์กับซิลิกาเจลอาจสลายตัวได้ ที่ค่า pH มากกว่า 8 ซิลิกาเองอาจสลายตัวได้ เมื่อต้องการสารละลายที่มีค่า pH สูงมาก เฟสคงที่สามารถทำจากซิลิกาพอลิเมอไรซ์กับสารอินทรีย์ หรือพอลิเมอร์อินทรีย์ที่ไม่ชอบน้ำได้

ด้วยเฟสคงที่ดังกล่าว เวลาในการคงตัวจะนานกว่าสำหรับโมเลกุลที่ไม่เป็นขั้ว ในขณะที่โมเลกุลที่เป็นขั้วจะถูกชะล้างออกมาได้ง่ายกว่า (ปรากฏขึ้นในช่วงต้นของการวิเคราะห์) นักโครมาโทกราฟีสามารถเพิ่มเวลาในการคงตัวได้โดยการเติมน้ำลงในเฟสเคลื่อนที่มากขึ้น เนื่องจากน้ำมีความเป็นขั้วสูง จึงทำให้สารวิเคราะห์ที่ไม่เป็นขั้วมีปฏิกิริยากับเฟสคงที่ที่ไม่เป็นขั้วได้แรงขึ้น ในทำนองเดียวกัน นักวิจัยสามารถลดเวลาในการคงตัวได้โดยการเติมตัวทำละลายอินทรีย์ที่ไม่เป็นขั้วลงในเฟสเคลื่อนที่มากขึ้น

RP-HPLC ทำงานบนหลักการของปฏิกิริยาไฮโดรโฟบิก ซึ่งเกิดจากความสมมาตรสูงในโครงสร้างน้ำแบบไดโพลาร์ และมีบทบาทสำคัญที่สุดในทุกกระบวนการในวิทยาศาสตร์ชีวภาพ RP-HPLC ช่วยให้สามารถวัดแรงปฏิกิริยาเหล่านี้ได้ การจับตัวของสารวิเคราะห์กับเฟสคงที่นั้นเป็นสัดส่วนกับพื้นที่ผิวสัมผัสรอบส่วนที่ไม่เป็นขั้วของโมเลกุลสารวิเคราะห์เมื่อรวมตัวกับลิแกนด์บนเฟสคงที่ผลกระทบโซลโวโฟบิก นี้ ถูกครอบงำด้วยแรงของน้ำในการ "ลดโพรง" รอบสารวิเคราะห์และโซ่ C18 เทียบกับสารประกอบเชิงซ้อนของทั้งสอง พลังงานที่ปล่อยออกมาในกระบวนการนี้เป็นสัดส่วนกับ^แรงตึงผิวของตัวชะล้าง (น้ำ: 7.3 × 10⁻⁶ J /cm² ^เมทานอล: 2.2 × 10⁻⁶ ^J   /cm² ⁾และพื้นผิวไฮโดรโฟบิกของสารวิเคราะห์และลิแกนด์ตามลำดับ สามารถลดการกักเก็บสารได้โดยการเติมตัวทำละลายที่มีขั้วน้อยกว่า (เช่น เมทานอลอะซีโตไนไตรล์ ) ลงในเฟสเคลื่อนที่เพื่อลดแรงตึงผิวของน้ำ การแยก สารด้วยการไล่ระดับความเข้มข้นใช้ประโยชน์จากปรากฏการณ์นี้โดยการลดขั้วและแรงตึงผิวของเฟสเคลื่อนที่ที่เป็นน้ำโดยอัตโนมัติในระหว่างการวิเคราะห์

คุณสมบัติเชิงโครงสร้างของโมเลกุลสารวิเคราะห์มีบทบาทสำคัญต่อลักษณะการกักเก็บ ในทางทฤษฎี สารวิเคราะห์ที่มีพื้นที่ผิวที่ไม่ชอบน้ำ (hydrophobic surface area) มากกว่า (เช่น พันธะ C–H, C–C และพันธะอะตอมที่ไม่เป็นขั้ว เช่น SS และอื่นๆ) จะถูกกักเก็บได้นานกว่า เนื่องจากไม่ทำปฏิกิริยากับโครงสร้างของน้ำ ในทางกลับกัน สารวิเคราะห์ที่มีพื้นที่ผิวที่เป็นขั้ว (polar surface area) สูงกว่า (อันเป็นผลมาจากการมีหมู่ที่เป็นขั้ว เช่น -OH, -NH₂ ^, หรือ^-NH₃⁺ใน ) จะถูกกักเก็บได้น้อยกว่า เนื่องจากสามารถแทรกซึมเข้าไปในน้ำได้ดีกว่า ปฏิกิริยากับเฟสคงที่ยังอาจได้รับผลกระทบจากผลเชิงสเตอริก หรือผลเชิงการกีดกัน ซึ่งส่วนประกอบของโมเลกุลขนาดใหญ่มากอาจเข้าถึงรูพรุนของเฟสคงที่ได้จำกัดเท่านั้น ซึ่งเป็นบริเวณที่เกิดปฏิกิริยากับลิแกนด์บนพื้นผิว (โซ่แอลคิล) การกีดขวางบนพื้นผิวเช่นนี้มักส่งผลให้การกักเก็บลดลง

เวลาในการคงตัวจะเพิ่มขึ้นเมื่อโมเลกุลมีพื้นที่ผิวที่ไม่ชอบน้ำ (ไม่มีขั้ว) มากขึ้น ตัวอย่างเช่น สารประกอบที่มีโครงสร้างเป็นโซ่กิ่งจะถูกชะออกมาได้เร็วกว่าไอโซเมอร์เชิงเส้นที่สอดคล้องกัน เนื่องจากพื้นที่ผิวโดยรวมต่ำกว่า ในทำนองเดียวกัน สารประกอบอินทรีย์ที่มีพันธะ C–C เดี่ยว มักจะถูกชะออกมาช้ากว่าสารประกอบที่มีพันธะ C=C หรือ C≡C เนื่องจากพันธะคู่หรือพันธะสามทำให้โมเลกุลมีขนาดกะทัดรัดกว่าพันธะเดี่ยว

ปัจจัยสำคัญอีกประการหนึ่งคือ ค่า pHของเฟสเคลื่อนที่เนื่องจากค่า pH สามารถเปลี่ยนแปลงลักษณะที่ไม่ชอบน้ำของสารวิเคราะห์ที่แตกตัวเป็นไอออนได้ ด้วยเหตุนี้ วิธีการส่วนใหญ่จึงใช้สารบัฟเฟอร์เช่นโซเดียมฟอสเฟตเพื่อควบคุมค่า pH ผลของการควบคุมค่า pH และบัฟเฟอร์จะแตกต่างกันไปตามการใช้งาน แต่โดยทั่วไปจะช่วยปรับปรุงความละเอียดในการแยกสารวิเคราะห์ที่สามารถแตกตัวเป็นไอออนได้ บัฟเฟอร์มีประโยชน์หลายประการ:

• การควบคุมค่า pH ซึ่งส่งผลต่อสถานะการแตกตัวเป็นไอออนของสารวิเคราะห์ที่สามารถแตกตัวเป็นไอออนได้
• ส่งผลต่อประจุบนส่วนที่สามารถแตกตัวเป็นไอออนได้ของพื้นผิวของเฟสคงที่ ตัวอย่างเช่น พื้นผิวซิลิกาที่อยู่ระหว่างลิแกนด์ของเฟสที่ยึดติดกันมักจะถูกปกคลุมด้วยกลุ่มซิลาโนลที่สามารถดึงโปรตอนออกได้
• ทำหน้าที่เป็น สาร จับคู่ไอออนเพื่อทำให้ประจุของสารวิเคราะห์เป็นกลาง

หากใช้แมสสเปกโทรเมตรีในการวิเคราะห์สารละลายที่ได้จากการชะล้าง มักจะเติมกรดอินทรีย์ระเหยง่าย เช่นกรดอะซิติกหรือกรดฟอร์มิกลง ในสารละลายดังกล่าว โดยทั่วไปจะมีการเติม แอมโมเนียมฟอร์เมตเพื่อปรับปรุงการตรวจจับสารวิเคราะห์บางชนิดโดยการสร้างสารประกอบ เชิงซ้อนระหว่างสารวิเคราะห์กับแอมโมเนียม ซึ่งระเหยง่ายกว่าสารวิเคราะห์เอง

กรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA) ถูกใช้เป็นสารเติมแต่งในเฟสเคลื่อนที่อย่างแพร่หลายสำหรับตัวอย่างชีวการแพทย์ที่มีส่วนผสมซับซ้อน โดยส่วนใหญ่เป็นเปปไทด์และโปรตีน โดยใช้เครื่องตรวจจับแบบยูวีเป็นหลัก TFA ยังช่วยเพิ่มการกักเก็บสารวิเคราะห์ เช่นกรดคาร์บอกซิลิกในการใช้งานกับเครื่องตรวจจับอื่นๆ (เช่น UV-VIS) เนื่องจากเป็นกรดอินทรีย์ที่ค่อนข้างแรง อย่างไรก็ตาม มีการใช้ TFA ในวิธีการแมสสเปกโทรเมตรีค่อนข้างน้อย เนื่องจากอาจทิ้งสารตกค้างไว้ในเครื่องตรวจจับและระบบส่งตัวทำละลาย ซึ่งรบกวนการวิเคราะห์และการตรวจจับ

อนุภาคซิลิกาในคอลัมน์แบบรีเวิร์สเฟสมีโอกาสเสียหายได้น้อยกว่าอนุภาคซิลิกาในคอลัมน์แบบนอร์มัลเฟส เนื่องจากได้รับการปกป้องด้วยลิแกนด์ที่ไม่ชอบน้ำซึ่งยึดติดอยู่บนพื้นผิว อย่างไรก็ตาม คอลัมน์แบบรีเวิร์สเฟสส่วนใหญ่ประกอบด้วยอนุภาคซิลิกาที่ผ่านการดัดแปลงด้วยหมู่แอลคิล และมีแนวโน้มที่จะเกิดการไฮโดรไลซิสของซิลิกาในสภาวะที่เป็นกรด (pH < 2) นอกจากนี้ ซิลิกาเองก็ละลายได้ในสภาวะที่เป็นด่าง (pH > 8) มีคอลัมน์แบบรีเวิร์สเฟสบางยี่ห้อที่ใช้ซิลิกาแบบไฮบริดหรือแบบเสริมแรงซึ่งสามารถใช้งานได้ในสภาวะ pH ที่สุดขั้ว สภาวะที่เป็นกรดสูงอาจทำให้ชิ้นส่วนโลหะของอุปกรณ์ HPLC เกิดการกัดกร่อนได้เช่นกัน

โดยทั่วไป ในกรณีส่วนใหญ่ ควรล้างคอลัมน์ RP-HPLC ด้วยตัวทำละลายสะอาดหลังการใช้งาน เพื่อกำจัดกรดหรือบัฟเฟอร์ที่ตกค้าง และเก็บรักษาไว้ในตัวทำละลายที่มีส่วนประกอบที่เหมาะสม สำหรับการใช้งานทางชีวการแพทย์บางอย่าง จำเป็นต้องใช้สภาพแวดล้อมที่ปราศจากโลหะเพื่อให้ได้การแยกที่ดีที่สุด สำหรับกรณีที่ละเอียดอ่อนเช่นนี้ มีวิธีการทดสอบปริมาณโลหะในคอลัมน์โดยการฉีดตัวอย่างที่เป็นส่วนผสมของ 2,2'- และ 4,4'- bipyridineเนื่องจาก 2,2'-bipy สามารถจับกับโลหะได้ รูปร่างของพีคสำหรับ 2,2'-bipy จะบิดเบี้ยว (มีหาง) เมื่อ มี ไอออนของโลหะ อยู่บนพื้นผิวของซิลิกา ...

โครมาโทกราฟีแบบแยกตามขนาด ( SEC ) ^{[ 33 ]}แยกโมเลกุลโพลีเมอร์และโมเลกุลชีวภาพตามความแตกต่างของขนาดโมเลกุล (โดยรัศมีสโตกส์ ของอนุภาค ) กระบวนการแยกขึ้นอยู่กับความสามารถของโมเลกุลตัวอย่างในการซึมผ่านรูพรุนของทรงกลมเจลที่บรรจุอยู่ภายในคอลัมน์ และขึ้นอยู่กับขนาดสัมพัทธ์ของโมเลกุลวิเคราะห์และขนาดรูพรุนของสารดูดซับ กระบวนการนี้ยังอาศัยการไม่มีปฏิสัมพันธ์ใดๆ กับพื้นผิวของวัสดุบรรจุด้วย

SEC มี 2 ประเภทหลัก ได้แก่:

1. โครมาโทกราฟีแบบเจลเพอร์มีเอชัน (GPC) — การแยกโพลิเมอร์สังเคราะห์ (ที่ละลายได้ในน้ำหรือสารอินทรีย์) โดยใช้ตัวทำละลายอินทรีย์เป็นหลัก
2. โครมาโทกราฟีแบบเจลฟิลเทรชัน (GFC) — การแยกไบโอโพลีเมอร์ที่ละลายน้ำได้ (โดยทั่วไปคือโปรตีน) โดยใช้ตัวทำละลายที่เป็นน้ำเป็นหลัก

หลักการแยกสารใน SEC นั้นอาศัยการแทรกซึมของสารที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงในตัวอย่างเข้าไปในอนุภาคของเฟสคงที่ที่มีรูพรุนอย่างสมบูรณ์หรือบางส่วนในระหว่างการเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ ตัวทำละลายในเฟสเคลื่อนที่ถูกเลือกในลักษณะที่ป้องกันการเกิดปฏิกิริยากับพื้นผิวของเฟสคงที่โดยสิ้นเชิง ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ ยิ่งโมเลกุลมีขนาดเล็กเท่าใด ก็ยิ่งสามารถแทรกซึมเข้าไปในช่องว่างของรูพรุนได้มากขึ้น และการเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ก็จะใช้เวลานานขึ้น ในทางกลับกัน ยิ่งโมเลกุลมีขนาดใหญ่เท่าใด โอกาสที่โมเลกุลจะไม่สามารถแทรกซึมเข้าไปในรูพรุนของเฟสคงที่ได้อย่างสมบูรณ์ก็จะยิ่งสูงขึ้น และอาจเคลื่อนที่ไปรอบๆ รูพรุน ทำให้ถูกชะออกมาเร็วกว่า โมเลกุลจะถูกแยกตามลำดับน้ำหนักโมเลกุลที่ลดลง โดยโมเลกุลที่มีขนาดใหญ่ที่สุดจะถูกชะออกจากคอลัมน์ก่อน และโมเลกุลที่มีขนาดเล็กกว่าจะถูกชะออกมาทีหลัง โมเลกุลที่มีขนาดใหญ่กว่าขนาดของรูพรุนจะไม่สามารถเข้าไปในรูพรุนได้เลย และจะถูกชะออกมาพร้อมกันเป็นพีคแรกในโครมาโทแกรม ซึ่งเรียกว่าปริมาตรการแยกทั้งหมด (Total Exclusion Volume) ซึ่งกำหนดขีดจำกัดการแยกสำหรับคอลัมน์นั้นๆ โมเลกุลขนาดเล็กจะซึมผ่านรูพรุนของอนุภาคเฟสคงที่ได้อย่างสมบูรณ์และจะถูกชะออกมาเป็นลำดับสุดท้าย ซึ่งเป็นจุดสิ้นสุดของโครมาโทแกรม และอาจปรากฏเป็นเครื่องหมายแสดงการซึมผ่านทั้งหมด

ในวิทยาศาสตร์ชีวการแพทย์ โดยทั่วไปถือว่าเป็นโครมาโทกราฟีที่มีความละเอียดต่ำ ดังนั้นจึงมักสงวนไว้สำหรับขั้นตอนสุดท้ายหรือขั้นตอน "ขัดเกลา" ของการทำให้บริสุทธิ์ นอกจากนี้ยังเป็นประโยชน์สำหรับการกำหนดโครงสร้างระดับตติยภูมิและโครงสร้างระดับจตุรภูมิของโปรตีนที่บริสุทธิ์แล้ว SEC ใช้เป็นหลักสำหรับการวิเคราะห์โมเลกุลขนาดใหญ่ เช่น โปรตีนหรือพอลิเมอร์ SEC ยังทำงานในเชิงเตรียมการโดยการดักจับโมเลกุลขนาดเล็กในรูพรุนของอนุภาค โมเลกุลขนาดใหญ่จะผ่านรูพรุนไปเนื่องจากมีขนาดใหญ่เกินกว่าจะเข้าไปในรูพรุนได้ ดังนั้นโมเลกุลขนาดใหญ่จึงไหลผ่านคอลัมน์ได้เร็วกว่าโมเลกุลขนาดเล็ก กล่าวคือ โมเลกุลยิ่งเล็ก เวลาในการกักเก็บก็จะยิ่งนานขึ้น

เทคนิคนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในการกำหนดน้ำหนักโมเลกุลของพอลิแซ็กคาไรด์ SEC เป็นเทคนิคอย่างเป็นทางการของเภสัชตำรับยุโรปสำหรับการเปรียบเทียบน้ำหนักโมเลกุลของเฮปารินที่มี น้ำหนักโมเลกุลต่ำที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ต่างๆ ^{[ 34 ]}

โครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออน ( IEC ) หรือโครมาโทกราฟีไอออน ( IC ) ^{[ 35 ]}เป็นเทคนิคการวิเคราะห์สำหรับการแยกและการหาปริมาณสารละลายไอออนในตัวอย่างน้ำจากแหล่งกำเนิดสิ่งแวดล้อมและอุตสาหกรรม เช่น อุตสาหกรรมโลหะ น้ำเสียจากอุตสาหกรรม ในระบบชีวภาพ ตัวอย่างยา อาหาร เป็นต้น

ในคอลัมน์ IEC จะมีตำแหน่งที่มีประจุไฟฟ้าเกาะอยู่กับเฟสคงที่ ไอออนของสารละลายที่มีประจุเหมือนกับไอออนบนคอลัมน์จะถูกผลักออกและถูกชะล้างออกโดยไม่ถูกกักเก็บ ในขณะที่ไอออนของสารละลายที่มีประจุตรงข้ามกับตำแหน่งที่มีประจุบนคอลัมน์จะถูกกักเก็บไว้ โดยทั่วไป ไอออนที่มีประจุสูงกว่าและมีรัศมีเล็กกว่าจะถูกกักเก็บไว้ได้แน่นกว่า ไอออนของสารละลายที่ถูกกักเก็บไว้บนคอลัมน์สามารถถูกชะล้างออกได้โดยการเปลี่ยนองค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่ เช่น การเพิ่มความเข้มข้นของเกลือและค่า pH หรือการเพิ่มอุณหภูมิของเฟสคงที่ เป็นต้น

ประเภทของตัวแลกเปลี่ยนไอออน ได้แก่เรซินโพลีสไต รีน ตัวแลกเปลี่ยน ไอออนเซลลูโลสและเดกซ์แทรน (เจล) และแก้วที่มีรูพรุนควบคุมได้ หรือเจลซิลิกา ที่มีรูพรุน เรซินโพลีสไตรีนช่วยให้เกิดการเชื่อมโยงข้าม ซึ่งเพิ่มความเสถียรของสายโซ่ การเชื่อมโยงข้ามที่สูงขึ้นช่วยลดการเบี่ยงเบน ซึ่งเพิ่มเวลาในการปรับสมดุลและท้ายที่สุดก็ปรับปรุงการเลือกสรร ตัวแลกเปลี่ยนไอออนเซลลูโลสและเดกซ์แทรนมีขนาดรูพรุนที่ใหญ่กว่าและความหนาแน่นของประจุต่ำ ทำให้เหมาะสำหรับการแยกโปรตีน

การเพิ่มความเข้มข้นของไอออนประจุลบ (เมื่อเทียบกับหมู่ฟังก์ชันในเรซิน) จะลดเวลาการกักเก็บ เนื่องจากจะเกิดการแข่งขันอย่างรุนแรงกับไอออนของสารละลาย การลดค่า pH จะลดเวลาการกักเก็บในคอลัมน์แลกเปลี่ยนแคตไอออน ในขณะที่การเพิ่มค่า pH จะลดเวลาการกักเก็บในคอลัมน์แลกเปลี่ยนแอนไอออน ตัวอย่างเช่น การลดค่า pH ของตัวทำละลายในคอลัมน์แลกเปลี่ยนแคตไอออน จะทำให้มีไอออนไฮโดรเจนมากขึ้นเพื่อแข่งขันกับตำแหน่งบนเฟสคงที่ของแอนไอออน ทำให้แคตไอออนที่จับตัวกันอย่างอ่อนถูกชะล้างออกไปได้

โครมาโทกราฟีรูปแบบนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในงานต่างๆ ดังต่อไปนี้: การทำน้ำให้บริสุทธิ์ การเพิ่มความเข้มข้นของสารประกอบปริมาณน้อย โครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนลิแกนด์ โครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนของโปรตีน โครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนแอนไอออนที่ ค่า pH สูง ของคาร์โบไฮเดรตและโอลิโกแซ็กคาไรด์ และอื่นๆ

โครมาโทกราฟีความสัมพันธ์ประสิทธิภาพสูง (HPAC) ^{[ 36 ]}ทำงานโดยการส่งสารละลายตัวอย่างผ่านคอลัมน์ที่บรรจุด้วยเฟสคงที่ซึ่งมีลิแกนด์ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่ตรึงอยู่ ลิแกนด์นั้นเป็นสารตั้งต้นที่มีความสัมพันธ์ในการจับกับโมเลกุลเป้าหมายในสารละลายตัวอย่างโดยเฉพาะ โมเลกุลเป้าหมายจะจับกับลิแกนด์ ในขณะที่โมเลกุลอื่นๆ ในสารละลายตัวอย่างจะผ่านคอลัมน์ไปโดยมีการกักเก็บน้อยหรือไม่เลย จากนั้นโมเลกุลเป้าหมายจะถูกชะออกจากคอลัมน์โดยใช้บัฟเฟอร์ชะที่เหมาะสม

กระบวนการโครมาโทกราฟีนี้อาศัยความสามารถของสารออกฤทธิ์ที่จับตัวกันเป็นสารเชิงซ้อนที่เสถียร จำเพาะ และย้อนกลับได้ เนื่องจากสารเหล่านั้นสามารถจดจำส่วนประกอบเฉพาะบางอย่างในตัวอย่างได้ทางชีวภาพ การเกิดสารเชิงซ้อนเหล่านี้เกี่ยวข้องกับแรงโมเลกุลทั่วไป เช่นแรงแวนเดอร์วาลส์ แรงไฟฟ้าสถิต แรงดึงดูดระหว่างขั้ว แรงดึงดูดระหว่างโมเลกุลที่ไม่ชอบน้ำ และพันธะไฮโดรเจน พันธะที่มีประสิทธิภาพและจำเพาะจะเกิดขึ้นจากการทำงานพร้อมกันและประสานกันของแรงเหล่านี้หลายๆ แรงในบริเวณที่จับกันอย่างเหมาะสม

โครมาโทกราฟีเฟสปกติในน้ำ ( ANP ) เรียกอีกอย่างว่าโครมาโทกราฟีของเหลวแบบปฏิสัมพันธ์กับสารที่ชอบน้ำ ( HILIC ) ^{[ 37 ]}นี่คือเทคนิคโครมาโทกราฟีที่ครอบคลุมบริเวณเฟสเคลื่อนที่ระหว่างโครมาโทกราฟีเฟสผกผัน (RP) และโครมาโทกราฟีเฟสปกติอินทรีย์ (ONP) HILIC ใช้เพื่อให้ได้ความเลือกสรรเฉพาะสำหรับสารประกอบที่ชอบน้ำ^{[ 38 ]}โดยแสดงลำดับการชะล้างเฟสปกติโดยใช้ "ตัวทำละลายเฟสผกผัน" กล่าวคือ ตัวทำละลายที่มีขั้วค่อนข้างสูงและส่วนใหญ่ไม่ใช่น้ำในเฟสเคลื่อนที่^{[ 37 ]}โมเลกุลทางชีวภาพจำนวนมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่พบในของเหลวทางชีวภาพ เป็นสารประกอบที่มีขั้วขนาดเล็กซึ่งไม่สามารถกักเก็บได้ดีโดย HPLC เฟสผกผัน ทำให้โครมาโทกราฟีของเหลวแบบปฏิสัมพันธ์กับสารที่ชอบน้ำ (HILIC) เป็นทางเลือกที่น่าสนใจและมีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์โมเลกุลที่มีขั้ว นอกจากนี้ เนื่องจาก HILIC มักใช้กับส่วนผสมของน้ำแบบดั้งเดิมกับตัวทำละลายอินทรีย์ที่มีขั้ว เช่น ACN และเมทานอล จึงสามารถเชื่อมต่อกับ MS ได้อย่างง่ายดาย^{[ 38 ]}

ระหว่างการแยก องค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่อาจคงที่หรือเปลี่ยนแปลงได้ หากคงที่ กระบวนการนี้เรียกว่าไอโซแครติก (หมายถึงองค์ประกอบคงที่ ) คำนี้ถูกบัญญัติโดยCsaba Horvathซึ่งเป็นหนึ่งในผู้บุกเบิกของ HPLC ^{[ 39 ] [ 40 ]}

หากมีการเปลี่ยนแปลง กระบวนการนี้เรียกว่า การ ชะแบบไล่ระดับ^{[ 41 ] [ 42 ]}ตัวอย่างเช่น การไล่ระดับอาจเริ่มต้นที่เมทานอล 10% ในน้ำ และสิ้นสุดที่เมทานอล 90% ในน้ำหลังจาก 20 นาที ส่วนประกอบสองส่วนของเฟสเคลื่อนที่มักเรียกว่า "A" และ "B" โดยAคือตัวทำละลาย "อ่อน" ซึ่งทำให้สารละลายชะออกมาอย่างช้าๆ ในขณะที่Bคือตัวทำละลาย "แรง" ซึ่งชะสารละลายออกจากคอลัมน์อย่างรวดเร็ว ในโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผันตัวทำละลายAมักจะเป็นน้ำหรือบัฟเฟอร์ในน้ำ ในขณะที่Bเป็นตัวทำละลายอินทรีย์ที่ผสมกับน้ำได้ เช่นอะซีโตไนไตรล์ เมทานอลTHFหรือไอโซโพรพานอล

ในการชะแบบไอโซแครติก ความกว้างของพีคจะเพิ่มขึ้นตามเวลาการคงตัวแบบเชิงเส้นตามสมการสำหรับ N ซึ่งเป็นจำนวนเพลทเชิงทฤษฎี นี่อาจเป็นข้อเสียเปรียบที่สำคัญเมื่อวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีสารวิเคราะห์ที่มีปัจจัยการคงตัวที่หลากหลาย การใช้เฟสเคลื่อนที่ที่อ่อนกว่าจะทำให้เวลาในการวิเคราะห์นานขึ้นและส่งผลให้พีคที่ชะออกมาช้ามีความกว้าง ทำให้ความไวลดลง เฟสเคลื่อนที่ที่เข้มข้นกว่าจะช่วยปรับปรุงปัญหาเรื่องเวลาในการวิเคราะห์และความกว้างของพีคที่เกิดขึ้นในภายหลัง แต่จะทำให้การแยกพีคลดลง โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับสารวิเคราะห์ที่ชะออกมาเร็วซึ่งอาจมีเวลาไม่เพียงพอที่จะแยกออกจากกันได้อย่างสมบูรณ์ ปัญหานี้สามารถแก้ไขได้โดยการเปลี่ยนองค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่ในการชะแบบไล่ระดับความเข้มข้น

การเริ่มต้นด้วยเฟสเคลื่อนที่ที่อ่อนกว่าและค่อยๆ เพิ่มความเข้มข้นขึ้นในระหว่างการวิเคราะห์ จะช่วยลดการกักเก็บของส่วนประกอบที่ออกมาทีหลัง ทำให้ส่วนประกอบเหล่านั้นออกมาเร็วขึ้น ส่งผลให้ได้พีคที่แคบลง (และสูงขึ้น) สำหรับส่วนประกอบส่วนใหญ่ ในขณะเดียวกันก็ช่วยให้สามารถแยกส่วนประกอบที่ออกมาเร็วกว่าได้อย่างเหมาะสม นอกจากนี้ยังช่วยปรับปรุงรูปร่างของพีคที่มีหาง เนื่องจากความเข้มข้นของตัวทำละลายอินทรีย์ที่เพิ่มขึ้นจะผลักส่วนหางของพีคไปข้างหน้า ซึ่งจะทำให้ความสูงของพีคเพิ่มขึ้น (พีคดู "คมชัดขึ้น") ซึ่งมีความสำคัญในการวิเคราะห์สารปริมาณน้อย โปรแกรมการไล่ระดับความเข้มข้นอาจรวมถึงการเพิ่มเปอร์เซ็นต์ของส่วนประกอบอินทรีย์อย่างกะทันหัน หรือความชันที่แตกต่างกันในช่วงเวลาต่างๆ ทั้งหมดนี้ขึ้นอยู่กับความต้องการในการแยกสารที่ดีที่สุดในเวลาที่น้อยที่สุด

ในการชะแบบไอโซแครติก ลำดับการกักเก็บจะไม่เปลี่ยนแปลงหากขนาดของคอลัมน์ (ความยาวและเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) เปลี่ยนแปลง กล่าวคือ พีคจะถูกชะออกมาในลำดับเดียวกัน อย่างไรก็ตาม ในการชะแบบไล่ระดับ ลำดับการชะอาจเปลี่ยนแปลงได้เมื่อขนาดหรืออัตราการไหลเปลี่ยนแปลง หากไม่ได้ปรับขนาดลงหรือขึ้นตามการเปลี่ยนแปลง^{[ 43 ]}

แรงขับเคลื่อนหลักในโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผันเกิดจากโครงสร้างที่มีระเบียบสูงของน้ำ บทบาทของส่วนประกอบอินทรีย์ในเฟสเคลื่อนที่คือการลดระเบียบสูงนี้ลง และลดแรงต้านของส่วนประกอบที่เป็นน้ำลง ด้วย

ทฤษฎีโครมาโทกราฟีทั่วไปใช้ได้กับ HPLC ^{[ 44 ]}ทฤษฎีนี้เป็นพื้นฐานสำหรับการทดสอบความเหมาะสมของระบบของเภสัชตำรับของสหรัฐอเมริกา [ ^{45 ] ซึ่งเป็นชุดเกณฑ์เชิงปริมาณสำหรับความเหมาะสม ของ}ระบบ HPLC ต่อการวิเคราะห์ที่ต้องการในแต่ละขั้นตอน

ความสัมพันธ์นี้ยังแสดงออกมาในรูปของปัจจัยไร้หน่วยที่เป็นมาตรฐาน ซึ่งเรียกว่าปัจจัยการกักเก็บหรือ พารามิเตอร์การกักเก็บ ซึ่งเป็นการวัดเชิงทดลองของอัตราส่วนความจุ ดังแสดงในรูปเกณฑ์ประสิทธิภาพเช่นกัน t คือเวลาการกักเก็บของส่วนประกอบเฉพาะ และ t คือเวลาที่สารที่ไม่ถูกกักเก็บจะไหลผ่านระบบโดยไม่มีการกักเก็บใดๆ ดังนั้นจึงเรียกว่า เวลาว่างเปล่า (Void Time)

อัตราส่วนระหว่างค่าแฟคเตอร์การคงตัว (k') ของพีคที่อยู่ติดกันสองพีคในโครมาโทแกรมจะถูกนำมาใช้ในการประเมินระดับการแยกตัวระหว่างพีคเหล่านั้น และเรียกว่าแฟคเตอร์การเลือกสรร (α) ดังแสดงในกราฟเกณฑ์ประสิทธิภาพ

จำนวนเพลท N ที่ใช้เป็นเกณฑ์วัดประสิทธิภาพของระบบได้รับการพัฒนาขึ้นสำหรับสภาวะไอโซแครติก กล่าวคือ องค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่คงที่ตลอดการทำงาน ในสภาวะเกรเดียนต์ ซึ่งเฟสเคลื่อนที่เปลี่ยนแปลงตามเวลาในระหว่างการทำงานของโครมาโทกราฟี การใช้พารามิเตอร์ความจุพีค P เป็นตัววัดประสิทธิภาพของระบบ จึงเหมาะสมกว่า ^{[ 46 ]}นิยามของความจุพีคในโครมาโทกราฟีคือจำนวนพีคที่สามารถแยกออกจากกันได้ภายในช่วงเวลาการกักเก็บสำหรับปัจจัยความละเอียดที่กำหนดไว้ล่วงหน้าโดยเฉพาะ ซึ่งโดยปกติคือ ~1 นอกจากนี้ยังสามารถมองได้ว่าเป็นเวลาการทำงานที่วัดเป็นจำนวนความกว้างเฉลี่ยของพีค สมการแสดงอยู่ในรูปของเกณฑ์ประสิทธิภาพ ในสมการนี้ tg คือเวลาเกรเดียนต์ และ w(ave) คือความกว้างเฉลี่ยของพีคที่ฐาน

พารามิเตอร์เหล่านี้ส่วนใหญ่ได้มาจากทฤษฎีโครมาโทกราฟีสองชุด ได้แก่ ทฤษฎีเพลท (ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของโครมาโทกราฟีแบบแบ่งส่วน ) และทฤษฎีอัตราของโครมาโทกราฟี / สมการของแวน ดีมเตอร์แน่นอนว่าสามารถนำไปใช้ได้จริงโดยการวิเคราะห์โครมาโทแกรม HPLC แม้ว่าทฤษฎีอัตราจะถือว่าเป็นทฤษฎีที่แม่นยำกว่าก็ตาม

ค่าพารามิเตอร์ของ HPLC นั้นคล้ายคลึงกับการคำนวณ ค่าแฟคเตอร์การกักเก็บ ( retention factor)สำหรับ การแยกสารด้วยวิธี โครมาโทกราฟีบนกระดาษ แต่จะอธิบายว่า HPLC สามารถแยกสารผสมออกเป็นสองหรือมากกว่าสององค์ประกอบที่ตรวจพบเป็นพีค (แถบ) บนโครมาโทแกรมได้ดีเพียงใด พารามิเตอร์ของ HPLC ได้แก่ ปัจจัยประสิทธิภาพ ( N ) ปัจจัยการกักเก็บ (kappa prime) และปัจจัยการแยก (alpha) ปัจจัยเหล่านี้รวมกันเป็นตัวแปรในสมการความละเอียด ซึ่งอธิบายว่าพีคของสององค์ประกอบแยกออกจากกันหรือทับซ้อนกันได้ดีเพียงใด พารามิเตอร์เหล่านี้ส่วนใหญ่ใช้สำหรับอธิบายการแยกสารด้วยวิธี HPLC แบบเฟสผกผันและแบบเฟสปกติเท่านั้น เนื่องจากผลการแยกสารด้วยวิธีเหล่านี้มักจะละเอียดอ่อนกว่าวิธี HPLC อื่นๆ ( เช่นการแลกเปลี่ยนไอออนและการแยกตามขนาด)

ปริมาตรช่องว่าง (Void volume) คือปริมาณพื้นที่ในคอลัมน์ที่ถูกครอบครองโดยตัวทำละลาย เป็นพื้นที่ภายในคอลัมน์ที่อยู่นอกเหนือวัสดุบรรจุภายในคอลัมน์ ปริมาตรช่องว่างจะวัดจากโครมาโทแกรมโดยพิจารณาจากพีคขององค์ประกอบแรกที่ตรวจพบ ซึ่งโดยปกติจะเป็นตัวทำละลายที่อยู่ในส่วนผสมของตัวอย่าง ในอุดมคติแล้ว ตัวทำละลายของตัวอย่างควรไหลผ่านคอลัมน์โดยไม่ทำปฏิกิริยากับคอลัมน์ แต่ยังคงสามารถตรวจจับได้แตกต่างจากตัวทำละลายของ HPLC ปริมาตรช่องว่างนี้ใช้เป็นปัจจัยแก้ไข (correction factor)

ค่าประสิทธิภาพ ( N ) เป็นตัววัดความคมชัดของยอดพีคของสารประกอบบนโครมาโทแกรม โดยคิดเป็นอัตราส่วนของพื้นที่ของยอดพีค ("เวลาการคงตัว") เทียบกับความกว้างของยอดพีค ณ จุดที่กว้างที่สุด (ที่เส้นฐาน) ยอดพีคที่สูง คมชัด และค่อนข้างแคบ แสดงว่าวิธีการแยกสารนั้นสามารถกำจัดสารประกอบออกจากสารผสมได้อย่างมีประสิทธิภาพสูง ประสิทธิภาพขึ้นอยู่กับคอลัมน์ HPLC และวิธีการ HPLC ที่ใช้เป็นอย่างมาก ค่าประสิทธิภาพมีความหมายเหมือนกับจำนวนเพลท และ 'จำนวนเพลทเชิงทฤษฎี'

ค่าแฟคเตอร์การคงตัว ( แคปปาไพรม์ ) เป็นตัววัดระยะเวลาที่ส่วนประกอบของสารผสมเกาะติดกับคอลัมน์ โดยวัดจากพื้นที่ใต้เส้นโค้งของพีคในโครมาโทแกรม (เนื่องจากโครมาโทแกรม HPLC เป็นฟังก์ชันของเวลา) พีคแต่ละพีคในโครมาโทแกรมจะมีค่าแฟคเตอร์การคงตัวของตัวเอง ( เช่นแคปปา1สำหรับแฟคเตอร์การคงตัวของพีคแรก) ค่าแฟคเตอร์นี้สามารถปรับแก้ได้ด้วยปริมาตรว่างของคอลัมน์

ปัจจัยการแยก ( อัลฟา ) คือการเปรียบเทียบเชิงสัมพัทธ์ว่าส่วนประกอบสองส่วนที่อยู่ติดกันในสารผสมนั้นถูกแยกออกจากกันได้ดีเพียงใด ( เช่นแถบสองแถบที่อยู่ติดกันบนโครมาโทแกรม) ปัจจัยนี้ถูกกำหนดในแง่ของอัตราส่วนของปัจจัยการกักเก็บของคู่ยอดโครมาโทแกรมที่อยู่ติดกัน และอาจได้รับการแก้ไขโดยปริมาตรว่างของคอลัมน์ด้วย ยิ่งค่าปัจจัยการแยกมากกว่า 1.0 การแยกก็จะยิ่งดีขึ้น จนถึงประมาณ 2.0 ซึ่งหลังจากนั้นอาจไม่จำเป็นต้องใช้วิธี HPLC ในการแยกอีกต่อไป สมการความละเอียดเชื่อมโยงปัจจัยทั้งสามเข้าด้วยกัน โดยที่ประสิทธิภาพสูงและปัจจัยการแยกที่ดีจะช่วยปรับปรุงความละเอียดของยอดส่วนประกอบในการแยกด้วย HPLC

เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน (ID) ของคอลัมน์ HPLC เป็นพารามิเตอร์ที่สำคัญ^{[ 47 ]}ซึ่งอาจส่งผลต่อการตอบสนองการตรวจจับเมื่อลดลงเนื่องจากการแพร่กระจายด้านข้างของแถบสารละลายลดลง นอกจากนี้ยังอาจส่งผลต่อการเลือกการแยกเมื่ออัตราการไหลและปริมาตรการฉีดไม่ได้ปรับลดหรือเพิ่มตามสัดส่วนของเส้นผ่านศูนย์กลางที่เล็กกว่าหรือใหญ่กว่าที่ใช้ ทั้งในโหมดไอโซแครติกและโหมดเกรเดียนต์^{[ 48 ]} เส้นผ่านศูนย์กลาง ภายในเป็นตัวกำหนดปริมาณของสารวิเคราะห์ที่สามารถโหลดลงบนคอลัมน์ได้ คอลัมน์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางขนาดใหญ่กว่ามักพบในการใช้งานเชิงเตรียมการ เช่น การทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ยาเพื่อใช้ในภายหลัง^{[ 49 ]}คอลัมน์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายในต่ำมีความไวที่ดีขึ้นและการใช้ตัวทำละลายที่น้อยลงในโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ (UHPLC) ในปัจจุบัน^{[ 50 ]}

คอลัมน์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายในขนาดใหญ่ (มากกว่า 10 มม.) ใช้สำหรับทำให้วัสดุบริสุทธิ์ในปริมาณที่ใช้งานได้ เนื่องจากมีความสามารถในการรับน้ำหนักได้มาก

คอลัมน์ขนาดวิเคราะห์ (4.6 มม.) เป็นคอลัมน์ประเภทที่พบได้บ่อยที่สุด แม้ว่าคอลัมน์ที่แคบกว่าจะได้รับความนิยมเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว^{[ 50 ]}คอลัมน์เหล่านี้ใช้ในการวิเคราะห์เชิงปริมาณแบบดั้งเดิมของตัวอย่าง และมักใช้ เครื่องตรวจจับการดูดกลืนแสง UV - Vis

คอลัมน์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางแคบ (1–2 มม.) ใช้สำหรับงานที่ต้องการความไวสูงกว่า ไม่ว่าจะเป็นการใช้ร่วมกับเครื่องตรวจจับ UV-vis แบบพิเศษ การตรวจ จับด้วยฟลูออเรสเซนส์ หรือวิธีการตรวจจับอื่นๆ เช่นโครมาโทกราฟีของเหลว-แมสสเปกโทรเมตรี

คอลัมน์แคปิลลารี (ขนาดต่ำกว่า 0.3 มม.) มักใช้กับวิธีการตรวจวัดแบบอื่น เช่นแมสสเปกโทรเมตรีเป็น ส่วนใหญ่ โดยปกติจะทำจาก แคปิลลารี ซิลิกาหลอมเหลวแทนที่จะใช้ท่อสแตนเลสเหมือนที่ใช้ในคอลัมน์ขนาดใหญ่กว่า

โดยทั่วไปแล้ว HPLC แบบดั้งเดิมจะดำเนินการโดยใช้เฟสคงที่ที่ติดอยู่ด้านนอกของ อนุภาค ซิลิกาทรง กลมขนาดเล็ก (ลูกปัดขนาดเล็กมาก) อนุภาคเหล่านี้มีหลายขนาด โดยลูกปัดขนาด 5 μm เป็นขนาดที่พบได้บ่อยที่สุด อนุภาคขนาดเล็กกว่าโดยทั่วไปจะมีพื้นที่ผิวมากกว่าและให้การแยกที่ดีกว่า แต่ความดันที่ต้องการสำหรับความเร็วเชิงเส้นที่เหมาะสมจะเพิ่มขึ้นตามสัดส่วนผกผันของกำลังสองของเส้นผ่านศูนย์กลางอนุภาค^{[ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]}

ตามสมการ^{[ 54 ]}ของความเร็วคอลัมน์ ประสิทธิภาพ และแรงดันย้อนกลับการลดเส้นผ่านศูนย์กลางอนุภาคลงครึ่งหนึ่งและคงขนาดของคอลัมน์ไว้เท่าเดิม จะทำให้ความเร็วและประสิทธิภาพของคอลัมน์เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า แต่แรงดันย้อนกลับจะเพิ่มขึ้นสี่เท่า และอนุภาคขนาดเล็กใน HPLC ยังสามารถลดความกว้างของการขยายได้อีกด้วย^{[ 55 ]}อนุภาคขนาดใหญ่ใช้ใน HPLC แบบเตรียม (เส้นผ่านศูนย์กลางคอลัมน์ 5 ซม. ถึง >30 ซม.) และสำหรับการใช้งานที่ไม่ใช่ HPLC เช่นการ สกัดเฟสของแข็ง

เฟสคงที่หลายชนิดมีรูพรุนเพื่อให้มีพื้นที่ผิวมากขึ้น รูพรุนขนาดเล็กให้พื้นที่ผิวมากกว่า ในขณะที่ขนาดรูพรุนที่ใหญ่กว่าจะมีจลนศาสตร์ที่ดีกว่า โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับสารวิเคราะห์ขนาดใหญ่ ตัวอย่างเช่น โปรตีนที่มีขนาดเล็กกว่ารูพรุนเพียงเล็กน้อยอาจเข้าไปในรูพรุนได้ แต่จะไม่สามารถออกจากรูพรุนได้ง่ายเมื่อเข้าไปข้างในแล้ว

ปั๊มมีความสามารถในการรับแรงดันที่แตกต่างกัน แต่ประสิทธิภาพของปั๊มจะวัดจากความสามารถในการสร้างอัตราการไหลเชิงปริมาตร ที่สม่ำเสมอและทำซ้ำ ได้แรงดันอาจสูงถึง 60 MPa (6000  lbf/in² ⁾หรือประมาณ 600 บรรยากาศ ระบบ HPLC ที่ทันสมัยได้รับการปรับปรุงให้ทำงานที่แรงดันสูงขึ้นมาก ดังนั้นจึงสามารถใช้อนุภาคขนาดเล็กกว่ามากในคอลัมน์ (<2 μm) ระบบ "โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ" หรือ UHPLC ซึ่งอาจเรียกอีกอย่างว่าระบบโครมาโทกราฟีแรงดันสูงพิเศษ^{[ 56 ]}สามารถทำงานได้ที่แรงดันสูงถึง 120 MPa (17,405 lbf/in² ⁾หรือประมาณ 1200 บรรยากาศ^{[ 57 ]}คำว่า "UPLC" ^{[ 58 ]}เป็นเครื่องหมายการค้าของWaters Corporationแต่บางครั้งก็ใช้เพื่ออ้างถึงเทคนิคทั่วไปของ UHPLC

เครื่องตรวจจับ HPLC แบ่งออกเป็นสองประเภทหลัก ได้แก่ เครื่องตรวจจับแบบทั่วไปและแบบเลือก เครื่องตรวจจับแบบทั่วไปมักจะวัดคุณสมบัติโดยรวม ( เช่นดัชนีหักเห ) โดยการวัดความแตกต่างของคุณสมบัติทางกายภาพระหว่างเฟสเคลื่อนที่และเฟสเคลื่อนที่ที่มีตัวถูกละลาย ในขณะที่เครื่องตรวจจับแบบเลือกจะวัดคุณสมบัติของตัวถูกละลาย ( เช่นการดูดกลืนแสง UV-Vis ) โดยการตอบสนองต่อคุณสมบัติทางกายภาพหรือทางเคมีของตัวถูกละลาย^{[ 59 ]} HPLC มักใช้เครื่องตรวจจับการ ดูดกลืนแสง UV-Vis เป็นหลัก อย่างไรก็ตาม สามารถใช้เครื่องตรวจจับโครมาโทกราฟีอื่นๆ ได้หลากหลาย เครื่องตรวจจับแบบทั่วไปที่เสริมการตรวจจับการดูดกลืนแสง UV-Vis คือเครื่อง ตรวจจับละอองประจุ (CAD) เครื่องตรวจจับที่ใช้กันทั่วไปชนิดหนึ่ง ได้แก่ เครื่องตรวจจับดัชนีหักเห ซึ่งให้ค่าที่อ่านได้โดยการวัดการเปลี่ยนแปลงของดัชนีหักเหของตัวชะล้างขณะที่เคลื่อนที่ผ่านเซลล์การไหล ในบางกรณี สามารถใช้เครื่องตรวจจับหลายตัวได้ ตัวอย่างเช่นLCMSมักจะรวม UV-Vis เข้ากับเครื่องสเปกโทรเมตรมวล

เมื่อใช้ร่วมกับเครื่องตรวจจับทางไฟฟ้าเคมี (ECD) HPLC-ECD จะตรวจจับสารสื่อประสาท ได้อย่างเลือกสรร เช่นนอร์เอพิ เน ฟริน โดปามีน เซโรโทนินกลูตาเมต GABA อะเซทิลโคลีนและอื่นๆ ในการวิจัยการวิเคราะห์ทางประสาทเคมี^{[ 60 ]} HPLC-ECD ตรวจจับสารสื่อประสาทได้ใน ระดับ เฟมโตโมลาร์ วิธีการอื่นๆ ในการตรวจจับสารสื่อประสาท ได้แก่ โครมาโทกราฟีของเหลว-แมสสเปกโทรเมตรี ELISA หรือการตรวจวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันด้วยรังสี

สามารถฉีดตัวอย่างจำนวนมากเข้าไปในระบบ HPLC ได้โดยอัตโนมัติโดยใช้เครื่องฉีดตัวอย่างอัตโนมัติของ HPLC นอกจากนี้ เครื่องฉีดตัวอย่างอัตโนมัติของ HPLC ยังมีปริมาตรและเทคนิคการฉีดที่เหมือนกันทุกประการสำหรับการฉีดแต่ละครั้ง ดังนั้นจึงให้ความแม่นยำของปริมาตรการฉีดสูง สามารถเปิดใช้งานการกวนตัวอย่างภายในห้องสุ่มตัวอย่างได้ ซึ่งช่วยส่งเสริมความเป็นเนื้อเดียวกัน^{[ 61 ]}

HPLC มีการใช้งานมากมายทั้งในห้องปฏิบัติการและวิทยาศาสตร์ทางคลินิก เป็นเทคนิคที่ใช้กันทั่วไปในการพัฒนายา เนื่องจากเป็นวิธีที่เชื่อถือได้ในการได้มาและรับรองความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์^{[ 62 ]}แม้ว่า HPLC จะสามารถผลิตผลิตภัณฑ์ที่มีคุณภาพสูงมาก (บริสุทธิ์) ได้ แต่ก็ไม่ใช่วิธีหลักที่ใช้ในการผลิตวัตถุดิบยาจำนวนมากเสมอไป^{[ 63 ]}ตามตำราเภสัชกรรมของยุโรป HPLC ถูกใช้ในการสังเคราะห์เพียง 15.5% เท่านั้น^{[ 64 ]}อย่างไรก็ตาม ในตำราเภสัชกรรมของสหรัฐอเมริกา HPLC มีบทบาทในการสังเคราะห์ถึง 44% ^{[ 65 ]}นี่อาจเป็นเพราะความแตกต่างในข้อจำกัดด้านเงินทุนและเวลา เนื่องจาก HPLC ในระดับใหญ่เป็นเทคนิคที่มีราคาแพง การเพิ่มขึ้นของความจำเพาะ ความแม่นยำ และความถูกต้องที่เกิดขึ้นกับ HPLC นั้น สอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของต้นทุนอย่างน่าเสียดาย

เทคนิคนี้ยังใช้สำหรับการตรวจจับยาเสพติดผิดกฎหมายในตัวอย่างต่างๆ^{[ 66 ]}วิธีการตรวจจับยาเสพติดที่พบได้บ่อยที่สุดคือการตรวจวิเคราะห์ภูมิคุ้มกัน^{[ 67 ]}วิธีนี้สะดวกกว่ามาก อย่างไรก็ตาม ความสะดวกสบายนั้นมาพร้อมกับข้อจำกัดด้านความจำเพาะและการครอบคลุมยาเสพติดที่หลากหลาย ดังนั้น HPLC จึงถูกนำมาใช้เป็นอีกทางเลือกหนึ่ง เนื่องจาก HPLC เป็นวิธีการกำหนด (และอาจเพิ่ม) ความบริสุทธิ์ การใช้ HPLC เพียงอย่างเดียวในการประเมินความเข้มข้นของยาเสพติดจึงค่อนข้างไม่เพียงพอ ดังนั้น ในบริบทนี้ HPLC จึงมักดำเนินการร่วมกับการวิเคราะห์มวลสาร^{[ 68 ]}การใช้โครมาโทกราฟีของเหลว-การวิเคราะห์มวลสาร (LC-MS) แทนโครมาโทกราฟีแก๊ส-การวิเคราะห์มวลสาร (GC-MS) ช่วยหลีกเลี่ยงความจำเป็นในการทำอนุพันธ์ด้วยสารอะซิติเลตหรืออัลคิเลต ซึ่งอาจเป็นขั้นตอนเพิ่มเติมที่ยุ่งยาก^{[ 69 ]} LC-MS ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับสารต่างๆ เช่น สารกระตุ้นการทำงานของร่างกาย สารเมตาบอไลต์ของยา สารประกอบกลูคูโรไนด์ แอมเฟตามีน โอปิออยด์ โคเคน BZD เคตามีน LSD กัญชา และยาฆ่าแมลง^{[ 70 ] [ 71 ]}การทำ HPLC ร่วมกับการวิเคราะห์มวลสารช่วยลดความจำเป็นในการกำหนดมาตรฐานการทดลอง HPLC ลงอย่างมาก

การทดสอบที่คล้ายกันสามารถดำเนินการเพื่อวัตถุประสงค์ในการวิจัยได้ เช่น การตรวจจับความเข้มข้นของสารที่อาจนำไปใช้ในทางคลินิก เช่น ยาต้านเชื้อราและยาแก้หอบหืด^{[ 72 ]}เทคนิคนี้มีประโยชน์อย่างเห็นได้ชัดในการสังเกตหลายชนิดในตัวอย่างที่เก็บรวบรวมได้เช่นกัน แต่ต้องใช้สารละลายมาตรฐานเมื่อต้องการข้อมูลเกี่ยวกับเอกลักษณ์ของสายพันธุ์ นอกจากนี้ยังใช้เป็นวิธีการยืนยันผลลัพธ์ของปฏิกิริยาการสังเคราะห์ เนื่องจากความบริสุทธิ์เป็นสิ่งสำคัญในการวิจัยประเภทนี้ อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์มวลสารด้วยสเปกโทรเมตรียังคงเป็นวิธีที่เชื่อถือได้มากกว่าในการระบุสายพันธุ์

โดยทั่วไปแล้ว การใช้ HPLC ในทางการแพทย์จะใช้เครื่องแมสสเปกโทรเมตรี (MS) เป็นตัวตรวจจับ ดังนั้นเทคนิคนี้จึงเรียกว่า LC-MS ^{[ 73 ]}หรือ LC-MS/MS สำหรับ MS แบบคู่ขนาน ซึ่ง MS สองประเภทจะทำงานตามลำดับ^{[ 74 ]}เมื่อเครื่องมือ HPLC เชื่อมต่อกับตัวตรวจจับมากกว่าหนึ่งตัว จะเรียกว่าระบบ LC แบบไฮเฟเนเต็ด การใช้งานทางเภสัชกรรม^{[ 75 ]}เป็นผู้ใช้หลักของ HPLC, LC-MS และ LC-MS/MS ^{[ 76 ]}ซึ่งรวมถึงการพัฒนายา^{[ 77 ]}และเภสัชวิทยา ซึ่งเป็นการศึกษาทางวิทยาศาสตร์เกี่ยวกับผลกระทบของยาและสารเคมีต่อสิ่งมีชีวิต^{[ 78 ]}การแพทย์เฉพาะบุคคล^{[ 79 ]}สาธารณสุข^{[ 80 ] [ 81 ]}และการวินิจฉัยโรค^{[ 82 ]}ในขณะที่ปัสสาวะเป็นสื่อกลางที่ใช้กันทั่วไปในการวิเคราะห์ความเข้มข้นของยา เซรั่มในเลือดเป็นตัวอย่างที่เก็บรวบรวมสำหรับการวิเคราะห์ทางการแพทย์ส่วนใหญ่ด้วย HPLC ^{[ 83 ]}หนึ่งในบทบาทที่สำคัญที่สุดของ LC-MS และ LC-MS/MS ในห้องปฏิบัติการทางคลินิกคือการตรวจคัดกรองทารกแรกเกิด (NBS) สำหรับความผิดปกติทางเมตาบอลิซึม^{[ 84 ]}และการวินิจฉัยติดตามผล^{[ 85 ] [ 86 ]}ตัวอย่างของทารกมาในรูปแบบของจุดเลือดแห้ง (DBS) ^{[ 87 ]}ซึ่งง่ายต่อการเตรียมและขนส่ง ทำให้การวินิจฉัยมีความปลอดภัยและเข้าถึงได้ทั้งในระดับท้องถิ่นและระดับโลก

วิธีการตรวจจับโมเลกุลอื่นๆ ที่มีประโยชน์สำหรับการศึกษาทางคลินิกได้รับการทดสอบเทียบกับ HPLC ซึ่งได้แก่ อิมมูโนแอสเซย์ ในตัวอย่างหนึ่ง การทดสอบการจับโปรตีนแบบแข่งขัน (CPBA) และ HPLC ได้รับการเปรียบเทียบความไวในการตรวจจับวิตามินดี ซึ่งมีประโยชน์ในการวินิจฉัยภาวะขาดวิตามินดีในเด็ก พบว่าความไวและความจำเพาะของ CPBA นี้มีเพียง 40% และ 60% ตามลำดับ ของความสามารถของ HPLC ^{[ 88 ]}แม้ว่าจะเป็นเครื่องมือที่มีราคาแพง แต่ความแม่นยำของ HPLC นั้นแทบจะหาที่เปรียบไม่ได้

• ประวัติศาสตร์ของโครมาโทกราฟี
• อิเล็กโทรโครมาโทกราฟีแบบแคปิลลารี
• โครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์
• Csaba Horváth
• โครมาโทกราฟีไอออน
• โครมาโทกราฟีของเหลวไมเซลล์

• LR Snyder, JJ Kirkland และ JW Dolan, Introduction to Modern Liquid Chromatography, John Wiley & Sons, นิวยอร์ก, 2009
• MW Dong, HPLC สมัยใหม่สำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่ปฏิบัติงานจริง. Wiley, 2006.
• LR Snyder, JJ Kirkland และ JL Glajch, การพัฒนาวิธีการ HPLC เชิงปฏิบัติ, John Wiley & Sons, นิวยอร์ก, 1997
• S. Ahuja และ HT Rasmussen (บรรณาธิการ), การพัฒนาวิธี HPLC สำหรับเภสัชภัณฑ์, Academic Press, 2007
• S. Ahuja และ MW Dong (บรรณาธิการ), คู่มือการวิเคราะห์ทางเภสัชกรรมด้วยวิธี HPLC, Elsevier/Academic Press, 2005
• YV Kazakevich และ R. LoBrutto (บรรณาธิการ), HPLC สำหรับนักวิทยาศาสตร์ด้านเภสัชกรรม, Wiley, 2007
• UD Neue, คอลัมน์ HPLC: ทฤษฎี เทคโนโลยี และการปฏิบัติ, Wiley-VCH, นิวยอร์ก, 1997
• MC McMaster, HPLC, คู่มือการใช้งานเชิงปฏิบัติ, Wiley, 2007.

วิกิมีเดียคอมมอนส์มีสื่อที่เกี่ยวข้องกับ โคร มาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง

• หลักการและการประยุกต์ใช้โครมาโทกราฟี HPLC [บันทึกพื้นฐานที่Rxlalit.com]