หลังจากแทรกชิ้นส่วน Okazakiแล้ว ไพรเมอร์ RNA จะถูกกำจัดออก (กลไกการกำจัดจะแตกต่างกันระหว่างโปรคาริโอตและยูคาริโอต ) และแทนที่ด้วย ดีออก ซีไรโบนิวคลีโอไทด์ ใหม่ ที่เติมเต็มช่องว่างที่เคยมีไพรเมอร์ RNA อยู่ จากนั้นDNA ไลเกสจะเชื่อมสายที่แตกเป็นชิ้นๆ เข้าด้วยกัน ทำให้การสังเคราะห์สายล้าหลังเสร็จสมบูรณ์^{[ 1 ]}

ในโปรคาริโอต ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส I สังเคราะห์ชิ้นส่วนโอคาซากิจนกระทั่งถึงไพรเมอร์อาร์เอ็นเอตัวก่อนหน้า จากนั้นเอนไซม์จะทำหน้าที่เป็นเอ็กโซนิวคลีเอส 5′→ 3′ พร้อมกัน โดยกำจัด ไรโบนิว คลีโอไท ด์ไพรเมอร์ ด้านหน้าและเพิ่ม ดีออก ซีไรโบนิวคลีโอไทด์ด้านหลัง ทั้งกิจกรรมการพอลิเมอไรเซชันและการตัดไพรเมอร์อาร์เอ็นเอเกิดขึ้นใน ทิศทาง 5′→3′และพอลิเมอเรส I สามารถทำกิจกรรมเหล่านี้พร้อมกันได้ ซึ่งเรียกว่า "การแปลนิค" ^{[ 1 ]}การแปลนิคหมายถึงกิจกรรมที่ประสานกันของพอลิเมอเรส I ในการกำจัดไพรเมอร์อาร์เอ็นเอและเพิ่มดีออกซี ไรโบนิว คลีโอไทด์ต่อมาช่องว่างระหว่างสายจะเกิดขึ้นเรียกว่านิค ซึ่งจะถูกปิดผนึกโดยใช้ดีเอ็นเอไลเกส

ในยูคาริโอต การกำจัดไพรเมอร์ RNA ในสายล้าหลังเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการจำลองแบบให้เสร็จสมบูรณ์ ดังนั้น ในขณะที่สายล้าหลังถูกสังเคราะห์โดยDNA polymerase δในทิศทาง5′→3′ จะเกิด ชิ้นส่วน Okazakiขึ้น ซึ่งเป็นสาย DNA ที่ไม่ต่อเนื่อง จากนั้น เมื่อ DNA polymerase ไปถึงปลาย 5' ของไพรเมอร์ RNA จากชิ้นส่วน Okazaki ก่อนหน้า มันจะแทนที่ปลาย 5' ของไพรเมอร์ด้วยแผ่น RNA สายเดี่ยว ซึ่งจะถูกกำจัดออกโดยการตัดด้วยนิวคลีเอส การตัดแผ่น RNA เกี่ยวข้องกับวิธีการกำจัดไพรเมอร์ 3 วิธี ^{[ 3 ]}ความเป็นไปได้แรกของการกำจัดไพรเมอร์คือการสร้างแผ่นสั้นๆ ซึ่งจะถูกกำจัดออกโดยตรงโดยเอนโดนิวคลีเอส 1 (FEN-1) ที่จำเพาะต่อโครงสร้างแผ่นซึ่งจะตัดแผ่นที่ยื่นออกมาที่ 5' วิธีนี้เรียกว่าเส้นทางแผ่นสั้นของการกำจัดไพรเมอร์ RNA ^{[ 4 ]}วิธีที่สองในการตัดไพรเมอร์ RNA คือการย่อยสลายสาย RNA โดยใช้RNaseซึ่งในยูคาริโอตเรียกว่า RNase H2 เอนไซม์นี้จะย่อยสลายไพรเมอร์ RNA ที่จับคู่กันส่วนใหญ่ ยกเว้นนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ใกล้ปลาย 5' ของไพรเมอร์ ดังนั้นนิวคลีโอไทด์ที่เหลือจะแสดงออกมาเป็นแผ่นพับที่ถูกตัดออกโดยใช้ FEN-1 วิธีสุดท้ายที่เป็นไปได้ในการกำจัดไพรเมอร์ RNA เรียกว่าเส้นทางแผ่นพับยาว^{[ 4 ]}ในเส้นทางนี้ เอนไซม์หลายตัวจะถูกดึงเข้ามาเพื่อยืดไพรเมอร์ RNA แล้วตัดออก แผ่นพับจะถูกยืดออกโดยเฮลิเคส จาก 5' ไป 3' ซึ่งเรียกว่าPif1หลังจากที่ Pif1 เพิ่มนิวคลีโอไทด์เข้าไปในแผ่นพับแล้ว แผ่นพับยาวจะถูกทำให้เสถียรโดยโปรตีนการจำลองแบบ A (RPA) DNA ที่จับกับ RPA จะยับยั้งการทำงานหรือการดึงดูด FEN1 ส่งผลให้ต้องมีการดึงดูดนิวคลีเอสตัวอื่นมาตัดแผ่น^{[ 3 ]}นิวคลีเอสตัวที่สองนี้คือDNA2 นิวคลีเอสซึ่งมีกิจกรรมเฮลิเคส-นิวคลีเอส ที่ตัดแผ่นยาวของไพรเมอร์ RNA จากนั้นจะเหลือนิวคลีโอไทด์สองสามตัวที่ถูกตัดโดย FEN1 ในตอนท้าย เมื่อไพรเมอร์ RNA ทั้งหมดถูกกำจัดออกไปแล้ว จะเกิดรอยบากขึ้นระหว่างชิ้นส่วน Okazakiซึ่งจะถูกเติมเต็มด้วย ดีออกซีไรโบนิว คลีโอไทด์โดยใช้เอนไซม์ที่เรียกว่าไลเกส1ผ่านกระบวนการที่เรียกว่าการเชื่อมต่อ

ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ใช้ไพรเมอร์แบบกำหนดเองคู่หนึ่งเพื่อนำการยืดตัวของ DNA เข้าหากันที่ปลายตรงข้ามของลำดับที่กำลังขยาย ไพรเมอร์เหล่านี้โดยทั่วไปมีความยาวระหว่าง 18 ถึง 24 เบส และเป็นส่วนเสริมกับไซต์ต้นน้ำและปลายน้ำที่เฉพาะเจาะจงของลำดับที่กำลังขยาย^{[ 1 ]}

ไพรเมอร์คู่ได้รับการออกแบบให้มีอุณหภูมิหลอมเหลว ที่ใกล้เคียงกัน เนื่องจากการจับคู่ระหว่าง PCR เกิดขึ้นพร้อมกันทั้งสองสาย อุณหภูมิหลอมเหลวไม่ควรสูงหรือต่ำกว่าอุณหภูมิการจับคู่ ของปฏิกิริยามากเกินไป หากอุณหภูมิการจับคู่ต่ำเกินไป อาจเกิดโครงสร้างที่ไม่จำเพาะ ทำให้ประสิทธิภาพของปฏิกิริยาลดลง^{[ 5 ]}

นอกจากนี้ ลำดับไพรเมอร์จำเป็นต้องได้รับการเลือกเพื่อให้เลือกเฉพาะบริเวณของ DNA ได้อย่างเฉพาะเจาะจง โดยหลีกเลี่ยงความเป็นไปได้ของการเกิดไฮบริดกับลำดับที่คล้ายคลึงกันที่อยู่ใกล้เคียง วิธีการที่ใช้กันทั่วไปในการเลือกไซต์ไพรเมอร์คือ การค้นหา BLASTซึ่งสามารถมองเห็นบริเวณที่เป็นไปได้ทั้งหมดที่ไพรเมอร์อาจจับได้ ทั้งลำดับนิวคลีโอไทด์และไพรเมอร์เองสามารถค้นหาด้วย BLAST ได้ เครื่องมือฟรีของ NCBI ที่ชื่อ Primer-BLAST ได้รวมการออกแบบไพรเมอร์และการค้นหา BLAST เข้าไว้ในแอปพลิเคชันเดียว^{[ 6 ]}เช่นเดียวกับซอฟต์แวร์เชิงพาณิชย์ เช่น ePrime และBeacon Designer การทำ PCR ในคอมพิวเตอร์อาจดำเนินการเพื่อประเมินความจำเพาะของไพรเมอร์ที่ออกแบบ^{[ 7 ]}

การเลือกบริเวณ DNA ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการจับของไพรเมอร์ต้องพิจารณาเพิ่มเติมอีกหลายประการ ควรหลีกเลี่ยงบริเวณที่มีการทำซ้ำของโมโนนิวคลีโอไทด์และไดนิวคลีโอไทด์สูง เนื่องจากอาจเกิดการก่อตัวของลูปและส่งผลให้เกิดการจับคู่ผิดพลาด ไพรเมอร์ที่เสริมกันอาจนำไปสู่การก่อตัวของไพรเมอร์ไดเมอร์ ซึ่งลดประสิทธิภาพของปฏิกิริยาที่ต้องการ^{[ 8 ]}ไพรเมอร์ที่สามารถจับคู่กับตัวเองได้อาจก่อให้เกิดแฮร์พินและลูปภายในที่ขัดขวางการจับคู่กับแม่แบบ DNA ^{[ 8 ]}

เมื่อออกแบบไพรเมอร์ สามารถเพิ่มเบสนิวคลีโอไทด์เพิ่มเติมที่ปลายด้านหลังของแต่ละไพรเมอร์ ส่งผลให้มีลำดับแคปที่กำหนดเองที่ปลายแต่ละด้านของบริเวณที่ขยาย หนึ่งในการประยุกต์ใช้สำหรับแนวปฏิบัตินี้คือการใช้ในTA cloningซึ่งเป็นเทคนิคการโคลนย่อยพิเศษที่คล้ายกับ PCR ซึ่งสามารถเพิ่มประสิทธิภาพได้โดยการเพิ่มหาง AG ที่ปลาย 5′ และ 3′ ^{[ 9 ]}

ในบางสถานการณ์ อาจจำเป็นต้องใช้ไพรเมอร์แบบดีเจเนอเรต (degenerate primers)ซึ่งเป็นส่วนผสมของไพรเมอร์ที่คล้ายคลึงกัน แต่ไม่เหมือนกันทุกประการ ไพรเมอร์ชนิดนี้อาจมีประโยชน์เมื่อต้องการขยายยีน เดียวกัน จากสิ่งมีชีวิต ต่างชนิดกัน เนื่องจากลำดับเบสอาจคล้ายคลึงกันแต่ไม่เหมือนกัน เทคนิคนี้มีประโยชน์เพราะรหัสพันธุกรรมเองก็เป็นแบบดีเจเนอเรต หมายความว่า โคดอนหลายตัวสามารถเข้ารหัสกรดอะมิโน ชนิดเดียวกัน ได้ ทำให้สิ่งมีชีวิตต่างชนิดกันสามารถมีลำดับพันธุกรรมที่แตกต่างกันอย่างมาก แต่เข้ารหัสโปรตีนที่คล้ายคลึงกันมาก ด้วยเหตุนี้ ไพรเมอร์แบบดีเจเนอเรตจึงถูกนำมาใช้ในการออกแบบไพรเมอร์โดยอิงจากลำดับเบสของโปรตีนเนื่องจากไม่ทราบลำดับโคดอนที่เฉพาะเจาะจง ดังนั้น ลำดับไพรเมอร์ที่สอดคล้องกับกรดอะมิโนไอโซลิวซีนอาจเป็น "ATH" โดยที่ A แทนอะดีนีน T แทนไทมีนและ H แทนอะดีนีนไทมีนหรือไซโตซีนตามรหัสพันธุกรรมของแต่ละโคดอนโดยใช้สัญลักษณ์ IUPAC สำหรับเบสแบบดีเจเนอเรต ไพรเมอร์แบบดีเจเนอเรตอาจไม่จับคู่กับลำดับเป้าหมายได้อย่างสมบูรณ์ ซึ่งอาจลดความจำเพาะของการขยายสัญญาณ PCR ลงอย่างมาก

ไพรเมอร์แบบดีเจเนอเรต (Degenerate primers)ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายและมีประโยชน์อย่างยิ่งในสาขาชีววิทยาเชิงนิเวศของจุลินทรีย์ ไพรเมอร์ เหล่านี้ช่วยให้สามารถเพิ่มปริมาณยีนจากจุลินทรีย์ ที่ไม่สามารถเพาะเลี้ยงได้ หรือช่วยให้สามารถกู้คืนยีนจากสิ่งมีชีวิตที่ไม่มีข้อมูลทางจีโนมได้ โดยปกติแล้ว ไพรเมอร์แบบดีเจเนอเรตจะถูกออกแบบโดยการจัดเรียงลำดับยีนที่พบในGenBankความแตกต่างระหว่างลำดับจะถูกพิจารณาโดยใช้ค่าดีเจเนอเรซีของ IUPAC สำหรับเบสแต่ละตัว จากนั้นไพรเมอร์ PCR จะถูกสังเคราะห์ขึ้นเป็นส่วนผสมของไพรเมอร์ที่สอดคล้องกับการเรียงลำดับโคดอนทุกแบบ