STARR-seq (ย่อมาจากself-transcribing active regulatory region sequencing ) เป็นวิธีการทดสอบ กิจกรรม ของตัวเร่งปฏิกิริยาสำหรับผู้สมัครหลายล้านรายจากแหล่ง DNA ใดๆ ใช้เพื่อระบุลำดับที่ทำหน้าที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการถอดรหัสโดยตรง เชิงปริมาณ และทั่วทั้งจีโนม^{[ 1 ]}

ในยูคาริโอตการถอดรหัสจะถูกควบคุมโดยโปรตีนที่จับกับ DNA ที่มีลำดับจำเพาะ ( ปัจจัยการถอดรหัส ) ที่เกี่ยวข้องกับ โปรโมเตอร์ของยีนและโดยลำดับควบคุมระยะไกล รวมถึงเอนแฮนเซอร์ เอนแฮนเซอร์เป็น ลำดับ DNA ที่ไม่มีรหัสซึ่งมีตำแหน่งการจับหลายตำแหน่งสำหรับปัจจัยการถอดรหัสหลายชนิด^{[ 2 ]}โดยทั่วไปแล้ว เอนแฮนเซอร์จะดึงดูดปัจจัยการถอดรหัสที่ปรับเปลี่ยน โครงสร้าง ของโครมาตินและโต้ตอบโดยตรงกับกลไกการถอดรหัสที่วางไว้ที่โปรโมเตอร์ของยีน เอนแฮนเซอร์สามารถควบคุมการถอดรหัสของยีนเป้าหมายในลักษณะที่จำเพาะต่อชนิดของเซลล์^{[ 1 ]} โดย ไม่ขึ้นอยู่กับตำแหน่งหรือระยะห่างจากโปรโมเตอร์ของยีน ในบางบริบท (ดูTransvection (genetics) ) เอนแฮนเซอร์ยังสามารถควบคุมการถอดรหัสของยีนที่อยู่ในโครโมโซม ที่แตกต่างกันได้อีก ด้วย^{[ 3 ]} อย่างไรก็ตาม ความรู้เกี่ยวกับเอนแฮนเซอร์จนถึงปัจจุบันมีจำกัดอยู่เพียงการศึกษาเอนแฮนเซอร์จำนวนเล็กน้อย เนื่องจากเป็นการยากที่จะระบุได้อย่างแม่นยำในระดับจีโนม^{[ 2 ]}ยิ่งไปกว่านั้น องค์ประกอบควบคุมจำนวนมากทำงานเฉพาะในเซลล์บางประเภทและในสภาวะเฉพาะเท่านั้น^{[ 4 ]}

การตรวจจับตัวเร่งปฏิกิริยาในDrosophilaเป็นวิธีการดั้งเดิมที่ใช้การแทรกแบบสุ่มของเวกเตอร์ที่ได้จากทรานสโพซอนซึ่งเข้ารหัสโปรตีนรายงานไว้ด้านล่างของโปรโมเตอร์ขั้นต่ำ วิธีนี้ช่วยให้สามารถสังเกตการแสดงออกของโปรตีนรายงานในสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรมและให้ข้อมูลเกี่ยวกับยีนใกล้เคียงที่ถูกควบคุมโดยลำดับเหล่านี้ การค้นพบและลักษณะเฉพาะของชนิดเซลล์พร้อมกับยีนที่เกี่ยวข้องกับการกำหนดชนิดของเซลล์ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญโดยการค้นพบเทคนิคนี้^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]}

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา เทคโนโลยีหลังจีโนมิกส์ได้แสดงคุณสมบัติเฉพาะของเอนแฮนเซอร์ที่พร้อมใช้งานและทำงานอยู่ ซึ่งช่วยปรับปรุงการค้นพบเอนแฮนเซอร์^{[ 2 ]}การพัฒนาวิธีการใหม่ๆ เช่น การจัดลำดับเชิงลึกของไซต์ที่ไวต่อ DNase I ( DNase-Seq ) การแยกองค์ประกอบควบคุมโดยใช้ฟอร์มาลดีไฮด์ ( FAIRE-Seq ) การตกตะกอนภูมิคุ้มกันของโครมาตินตามด้วยการจัดลำดับเชิงลึก ( ChIP-sequencing ) และการวิเคราะห์การครอบครองซิสโทรมที่กำหนดโดย MNase (MOA-seq ^{[ 9 ]} ) ช่วยให้สามารถทำนายเอนแฮนเซอร์ทั่วทั้งจีโนมโดยใช้คุณสมบัติโครมาตินที่เกี่ยวข้องกับเอนแฮนเซอร์^{[ 1 ]}

อย่างไรก็ตาม DNase-seq และ FAIRE-seq เพียงอย่างเดียวไม่สามารถให้ผลลัพธ์เชิงฟังก์ชันหรือเชิงปริมาณโดยตรงของกิจกรรมของเอนแฮนเซอร์ได้ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการทดสอบรีพอร์เตอร์ที่สามารถอนุมานความแรงของเอนแฮนเซอร์จากความเข้มข้นเชิงปริมาณของรีพอร์เตอร์ทรานสคริปต์เพื่อประเมินกิจกรรมของเอนแฮนเซอร์ในเชิงปริมาณ แต่การทดสอบเหล่านี้ไม่ใช่การทดสอบที่มีปริมาณมาก ( ชีววิทยาที่มีปริมาณมาก ) เนื่องจากเป็นไปไม่ได้ที่จะทำการทดสอบหลายล้านครั้งที่จำเป็นสำหรับการระบุเอนแฮนเซอร์ในลักษณะทั่วทั้งจีโนม^{[ 1 ]} การพัฒนา STARR-seq พยายามที่จะหลีกเลี่ยงอุปสรรคในการวิเคราะห์นี้ โดยใช้ประโยชน์จากความรู้ที่ว่าเอนแฮนเซอร์สามารถทำงานได้อย่างอิสระจากตำแหน่งสัมพัทธ์ของมัน ลำดับผู้สมัครจะถูกวางไว้ด้านล่างของโปรโมเตอร์ขั้นต่ำ ทำให้เอนแฮนเซอร์ที่ทำงานอยู่สามารถถอดรหัสตัวเองได้ จากนั้นความแรงของเอนแฮนเซอร์แต่ละตัวจะสะท้อนให้เห็นจากความเข้มข้นสัมพัทธ์ในหมู่ RNA ของเซลล์ การเชื่อมโยงโดยตรงของลำดับผู้สมัครกับกิจกรรมของเอนแฮนเซอร์ทำให้สามารถประเมินชิ้นส่วน DNA นับล้านชิ้นจากแหล่งที่มาใดๆ ได้พร้อมกัน^{[ 1 ]}

ดีเอ็นเอจีโนมิกจะถูกตัดและแยกออกเป็นชิ้นส่วนเล็กๆ แบบสุ่ม อะแดปเตอร์จะถูกเชื่อมเข้ากับชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เลือกขนาดไว้ จากนั้น ชิ้นส่วนที่เชื่อมด้วยอะแดปเตอร์จะถูกขยาย และ ผลิตภัณฑ์ PCRจะถูกทำให้บริสุทธิ์ ตามด้วยการวางลำดับผู้สมัครไว้ด้านล่างของโปรโมเตอร์ขั้นต่ำของเวกเตอร์คัดกรอง เพื่อให้มีโอกาสถอดรหัสตัวเอง จากนั้นเซลล์ผู้สมัครจะถูกทรานสเฟคด้วยไลบรารีรีพอร์เตอร์และเพาะเลี้ยง หลังจากนั้นRNA ทั้งหมด จะถูกสกัดและแยก RNA โพลีเอ ออกมา โดยใช้ วิธีการถอดรหัสย้อนกลับ จะ มีการผลิต cDNAขยาย และใช้ชิ้นส่วนผู้สมัครสำหรับการจัดลำดับแบบคู่ปลายที่ มีความเร็วสูง อ่านลำดับจะถูกแมปกับจีโนมอ้างอิงและดำเนินการประมวลผลข้อมูลด้วยคอมพิวเตอร์^{[ 1 ]}

เมื่อนำเทคโนโลยีนี้ไปใช้กับจีโนมของ Drosophila Arnold et al. ^{[ 1 ]}พบว่า 96% ของจีโนมที่ไม่ซ้ำกันมีการครอบคลุมอย่างน้อย 10 เท่า ผู้เขียนค้นพบว่าตัวเร่งปฏิกิริยาที่ระบุส่วนใหญ่ (55.6%) อยู่ภายในอินทรอนโดยเฉพาะอย่างยิ่งในอินทรอนแรกและบริเวณระหว่างยีน 4.5% ของตัวเร่งปฏิกิริยาตั้งอยู่ที่ตำแหน่งเริ่มต้นการถอดรหัส (TSS) ซึ่งบ่งชี้ว่าตัวเร่งปฏิกิริยาเหล่านี้สามารถเริ่มต้นการถอดรหัสและปรับปรุงการถอดรหัสจาก TSS ที่อยู่ไกลออกไปได้^{[ 1 ]}ตัวเร่งปฏิกิริยาที่แข็งแกร่งที่สุดอยู่ใกล้กับยีนพื้นฐานเช่น เอนไซม์หรือส่วนประกอบของโครงกระดูกเซลล์และตัวควบคุมการพัฒนา เช่น ปัจจัยการถอดรหัส ตัวเร่งปฏิกิริยาที่แข็งแกร่งที่สุดตั้งอยู่ภายในอินทรอนของปัจจัยการถอดรหัส zfh1 ปัจจัยการถอดรหัสนี้ควบคุม การแสดงออกของ นิวโรเปปไทด์และการเจริญเติบโตของจุดเชื่อมต่อประสาทกล้ามเนื้อของตัวอ่อนใน Drosophila ^{[ 10 ]}ยีนโปรตีนไรโบโซมเป็นกลุ่มยีนเดียวที่มีอันดับตัวเร่งปฏิกิริยาต่ำ ยิ่งไปกว่านั้น ผู้เขียนได้แสดงให้เห็นว่ายีนจำนวนมากถูกควบคุมโดยตัวเร่งปฏิกิริยาที่ทำงานอิสระหลายตัวแม้ในเซลล์ประเภทเดียวกัน นอกจากนี้ ระดับการแสดงออกของยีนโดยเฉลี่ยยังมีความสัมพันธ์กับผลรวมของความแข็งแรงของตัวเร่งปฏิกิริยาต่อยีน ซึ่งสนับสนุนการเชื่อมโยงโดยตรงระหว่างการแสดงออกของยีนและกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยา^{[ 1 ]}

^{Vockley และคณะ [ 11 ]}ได้นำเทคโนโลยีนี้ไปใช้ในการจำแนกลักษณะและการค้นพบอัลลีลตัวแปรควบคุมโดยจำแนกลักษณะผลกระทบของความแปรผันทางพันธุกรรมของมนุษย์ต่อการทำงานขององค์ประกอบควบคุมที่ไม่ใช่รหัส โดยวัดกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยาที่คาดว่าจะมีอยู่ 100 ตัว ซึ่งจับได้โดยตรงจากจีโนมของสมาชิก 95 คนในกลุ่มตัวอย่างการศึกษา วิธีการนี้ช่วยให้สามารถทำแผนที่ละเอียดของตัวแปรควบคุมที่เป็นสาเหตุในบริเวณที่มีความไม่สมดุลของการเชื่อมโยงสูง ซึ่งระบุโดย การวิเคราะห์ eQTLวิธีการนี้เป็นแนวทางทั่วไปในการระบุการรบกวนในองค์ประกอบควบคุมยีนที่ก่อให้เกิดฟีโนไทป์ที่ซับซ้อน

STARR-seq ถูกนำมาใช้เพื่อวัดกิจกรรมการควบคุมของชิ้นส่วน DNA ที่ได้รับการเสริมความเข้มข้นสำหรับไซต์ที่ถูกครอบครองโดยปัจจัยการถอดรหัสเฉพาะ การโคลนไลบรารีChIP DNA ที่สร้างขึ้นจากการตกตะกอนภูมิคุ้มกันของโค รมาตินของ ตัวรับกลูโคคอร์ติ คอยด์ ลงใน STARR-seq ทำให้สามารถวัดปริมาณกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยาที่เหนี่ยวนำโดยกลูโคคอร์ติคอยด์ในระดับจีโนมได้^{[ 12 ]} แนวทางนี้มีประโยชน์สำหรับการวัดความแตกต่างในกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยาระหว่างไซต์ที่ถูกจับโดยปัจจัยการถอดรหัสเดียวกัน

ด้วยการผสมผสานแนวทางแบบดั้งเดิมเข้ากับเทคโนโลยีการจัดลำดับแบบความเร็วสูงและวิธีการคำนวณทางชีวภาพที่เชี่ยวชาญเป็นพิเศษ STARR-seq จึงสามารถตรวจจับตัวเร่งปฏิกิริยาในเชิงปริมาณและทั่วทั้งจีโนมได้ การศึกษาการควบคุมยีนและเส้นทางที่เกี่ยวข้องในจีโนมระหว่างการพัฒนาตามปกติและในโรคต่างๆ นั้นมีความต้องการสูงมาก ดังนั้น การประยุกต์ใช้ STARR-seq กับเซลล์หลายประเภทในสิ่งมีชีวิตต่างๆ จึงสนับสนุนการระบุองค์ประกอบควบคุมยีนเฉพาะเซลล์ และประเมิน การกลาย พันธุ์ ที่ไม่ใช่รหัส ที่ก่อให้เกิดโรคได้อย่างเป็นรูปธรรม เมื่อเร็วๆ นี้ ได้มีการพัฒนาแนวทางที่เกี่ยวข้องโดยการเชื่อมโยงการจับภาพบริเวณที่สนใจเข้ากับเทคนิค STARR-seq และได้รับการตรวจสอบอย่างกว้างขวางในสายเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม^{[ 13 ]}