การตกผลึกของไวรัสคือการจัดเรียงส่วนประกอบของไวรัส ใหม่ให้กลายเป็น อนุภาคผลึกแข็ง^{[ 1 ]}ผลึกเหล่านี้ประกอบด้วยไวรัส ชนิดใดชนิดหนึ่งในรูปแบบที่ไม่ทำงานหลายพันรูปแบบ เรียงตัวกันเป็นรูปทรงปริซึม^{[ 2 ]}ลักษณะที่ไม่ทำงานของผลึกไวรัสเป็นข้อได้เปรียบสำหรับนักภูมิคุ้มกันวิทยา ในการวิเคราะห์โครงสร้างและหน้าที่ของไวรัสได้อย่างมีประสิทธิภาพ ความเข้าใจ ในลักษณะดังกล่าวได้รับการพัฒนาขึ้นด้วยความก้าวหน้าและความหลากหลายของเทคโนโลยีการตกผลึก ผลึกไวรัสมีประวัติอันยาวนานในการนำไปใช้อย่างกว้างขวางในระบาดวิทยา และไวรัสวิทยา และยังคงเป็นตัวเร่งในการศึกษาแบบแผนของไวรัสเพื่อลด การระบาดของโรค ที่อาจเกิด ขึ้น ได้จนถึงทุกวันนี้

ผลึกไวรัสมีต้นกำเนิดย้อนกลับไปในช่วงปลายศตวรรษที่ 19 ซึ่ง การค้นพบ การตกผลึกโปรตีน ครั้ง แรกเกิดขึ้นโดยนักชีววิทยาชาวเยอรมันRitthausenและOsborneโดยส่วนใหญ่เป็นฮีโมโกลบินในหนอนและปลา^{[ 3 ]}การสังเกตการณ์ในช่วงแรกเหล่านี้ถูกมองว่าเป็นเพียงสิ่งแปลกใหม่ในห้องปฏิบัติการ สิ่งที่เริ่มต้นจากการเป็นเพียงสิ่งแปลกใหม่ได้พัฒนาไปสู่ความต้องการในการทำให้บริสุทธิ์และแยกโปรตีนเพื่อการมองเห็นที่ชัดเจนยิ่งขึ้น จึงนำไปสู่การตกผลึกโปรตีนเทคนิคการตกผลึกโปรตีนได้รับการนำมาใช้ในวิทยาไวรัส ในที่สุด หลังจากการค้นพบไวรัสโมเสกยาสูบ (TMV)ซึ่งเป็นไวรัสชนิดแรกที่ถูกค้นพบ^{[ 4 ]}

การมองเห็นไวรัสได้อย่างชัดเจนโดยใช้เทคโนโลยีที่มีจำกัด เช่นกล้องจุลทรรศน์เป็นเรื่องยากเนื่องจากไวรัสมีขนาดเล็กมาก โดยไวรัสที่เล็กที่สุดมีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 20 นาโนเมตร^{[ 5 ]}ดังนั้นกล้องจุลทรรศน์จึงเป็นสาขาที่ค่อนข้างท้าทาย และมีความต้องการวิธีการสังเกตแบบอื่นสูง ไวรัส TMVถูกทำให้ตกผลึกเป็นครั้งแรกโดยWendell Stanleyซึ่งแสดงให้เห็นว่า ไวรัส TMVยังคงมีฤทธิ์ในการติดเชื้อแม้ในรูปผลึก^{[ 3 ]}ในช่วงเวลานี้เองที่นักวิจัยค้นพบว่าไวรัสที่ตกผลึก (เช่นเดียวกับโปรตีนและโมเลกุลอินทรีย์อื่นๆ) สามารถเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์ได้ ซึ่งบ่งชี้ถึงกลไกโครงสร้างที่ซับซ้อนในตัวไวรัส ความก้าวหน้านี้เป็นพื้นฐานสำหรับการขยายขอบเขตของวิทยาไวรัสไปสู่การตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์^{[ 3 ]}

การตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ได้รับการพัฒนาในช่วงกลางศตวรรษที่ 20 จากความพยายามของนักวิทยาศาสตร์ในการศึกษาลักษณะของไวรัสที่ตกผลึกในการวิจัยในห้องปฏิบัติการ หนึ่งในนั้นคือDorothy Hodgkinผู้เชี่ยวชาญด้านจุลชีววิทยาโมเลกุล ซึ่งได้กำหนด โครงสร้าง ของ TMVผ่านผลึกไวรัสที่สามารถเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์ได้^{[ 7 ]}การค้นพบนี้เป็นพื้นฐานสำหรับการปรับปรุงวิธีการตกผลึกไวรัสอย่างต่อเนื่อง ซึ่งต่อมานำไปสู่การกำหนดโครงสร้างของไวรัส อื่นๆ อีกมากมาย รวมถึงไวรัสโปลิโอไวรัสไรโนและไวรัสเรโทรไวรัสของมนุษย์ (HIV)ความก้าวหน้าดังกล่าวให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีค่าเกี่ยวกับกลไก การติดเชื้อ และการจำลองแบบ ของ ไวรัสจึงอำนวยความสะดวกในการพัฒนายาต้านไวรัสและวัคซีนในช่วงปลายศตวรรษที่ 20

ในช่วงปลายศตวรรษที่ 20 นักวิทยาศาสตร์ตระหนักว่าไวรัสที่ล้อมรอบด้วยเยื่อไขมัน หนา ไม่สามารถสร้างผลึกที่เป็นระเบียบได้^{[ 3 ]}ไวรัสดังกล่าวทำให้การได้ผลลัพธ์การเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ อย่างถูกต้องเป็นเรื่องยาก ^{[ 3 ]}เพื่อตอบสนองต่อเรื่องนี้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอเจนิก (cryo-EM)จึงเกิดขึ้นมาเป็นวิธีการทางเลือกใหม่สำหรับการศึกษาโครงสร้างของไวรัส Cryo -EMช่วยให้นักวิทยาศาสตร์สามารถมองเห็นไวรัสได้ที่ความละเอียดใกล้เคียงระดับอะตอมโดยไม่ต้องมีการตกผลึก^{[ 3 ]}การผสมผสานระหว่างการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์และcryo-EMได้มีส่วนช่วยในด้านสัณฐานวิทยาและพฤติกรรมของไวรัสในระบบภูมิคุ้มกันความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีดังกล่าวไม่เพียงแต่ทำให้เข้าใจลักษณะของไวรัสมากขึ้นเท่านั้น แต่ยังได้ปฏิวัติวิทยาไวรัสโดยรวม และยังคงได้รับความสนใจอย่างมากจนถึงทุกวันนี้

ไวรัสถูกนิยามว่าเป็น "ปรสิตภายในเซลล์ที่จำเป็น" ซึ่งมีDNAหรือRNA อยู่ ในแกนจีโนมของไวรัส และถูกห่อหุ้มด้วยโปรตีนป้องกัน^{[ 8 ]}โดยทั่วไป แกนจะถูกห่อหุ้มด้วย โปรตีน แคปซิดในโครงสร้างชั้นเดียวหรือสองชั้น^{[ 8 ]}ไวรัสบางชนิด เช่นโคโรนาไวรัส บางชนิด ยังพัฒนาเยื่อไขมันขนาดใหญ่ที่เรียกว่าซองหุ้มเมื่อพบในโฮสต์บางชนิด^{[ 9 ]}เยื่อนี้ประกอบด้วยชั้นไขมันสองชั้นล้อมรอบชั้นของโปรตีนที่ยึดติดกับเยื่อหุ้มเซลล์ โดยมีไกลโคโปรตีน บนพื้นผิว หรือโปรตีนหนามยื่นออกมาจากด้านนอกเซลล์ ซองหุ้มไวรัสดังกล่าวโดยทั่วไปจะได้รับเมื่อเดินทางผ่านพลาสมาหรือเมทริกซ์ภายในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตที่เป็นโฮสต์ และอาจแตกต่างกันในองค์ประกอบขึ้นอยู่กับปริมาณไขมันในเยื่อหุ้มเซลล์ของโฮสต์และโปรตีนของเซลล์โฮสต์^{[ 8 ]}โครงสร้างที่สำคัญสำหรับการตกผลึกและการระบุคือโครงสร้างโปรตีนแคปซิดไวรัสส่วนใหญ่มีโครงสร้างทรงยี่สิบหน้า โดยโครงสร้างที่พบได้บ่อยรองลงมาคือโครงสร้างแบบ เกลียวคล้ายสปริง^{[ 10 ]}โครงสร้างแคปซิดของไวรัสถูกจัดเรียงในลักษณะที่ทำให้การขนส่งสาย RNA หรือ DNA ที่มีความยาวเฉพาะของมันมีประสิทธิภาพสูงสุด^{[ 11 ]}จลนศาสตร์ ของโปรตีนแค ปซิดอาจมีบทบาทในการจัดเรียงตัวของมันเช่นกัน แม้ว่าจะยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างครบถ้วน^{[ 12 ]}ความสมมาตรและเรขาคณิตของไวรัสได้รับการอำนวยความสะดวกโดยการตกผลึกของไวรัส (และโดยเฉพาะอย่างยิ่งหน่วยย่อยโปรตีนแคปซิด) เพื่อศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนซึ่งเป็นตัวแทนของคุณสมบัติและหน้าที่ของแคปซิด^{[ 1 ]}

โครงสร้างแคปซิดแบบเกลียวขึ้นอยู่กับความยาวของจีโนม RNA หรือDNA ของไวรัส เป็นหลัก ^{[ 11 ]}เนื่องจากลักษณะการบรรจุโปรตีนที่ไม่สมมาตรที่เหมือนกันโดยไม่มีสมมาตรการหมุนเพื่อลดการรบกวนพันธะโปรตีน-โปรตีนที่ตำแหน่งการจับและตัวรับที่เฉพาะเจาะจง โครงสร้างโปรตีนแคปซิดที่ประกอบด้วยหน่วยย่อยโปรตีนที่เหมือนกันซ้ำๆ จึงจำเป็นต้องจัดเรียงตัวเองเป็นโครงตาข่ายที่พับเพื่อห่อหุ้มเนื้อหาภายในในโครงสร้างเกลียว คล้ายกับโครงสร้างเกลียวที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติในDNA ^{[ 11} ] โครงสร้างเกลียวที่เกิดขึ้นนี้เป็นผลมาจากข้อจำกัดทางเรขาคณิตและลักษณะสมมาตรที่จำเป็นโดยการจัดเรียงย่อยของโปรตีนและการโต้ตอบระหว่างโปรตีนกับ^{โปรตีน[ 11 ]}ไวรัสโมเสกยาสูบที่แคสปาร์และคลักศึกษาในการตกผลึกในปี พ.ศ. 2505 พบว่าประกอบด้วย 'กลุ่มย่อยโปรตีนแคปซิด 2 ถึง 5 หน่วย' เรียงตัวเป็นโครงสร้างแคปซิดแบบเกลียว^{[ 11 ]}

โครงสร้างแคปซิดทรงยี่สิบหน้าขึ้นอยู่กับประสิทธิภาพ ด้านพลังงาน และ ข้อจำกัด ทางเรขาคณิตของการบรรจุจีโนม เป็นหลัก ^{[ 11 ]}คล้ายกับข้อจำกัดที่ทำให้ โครงสร้างแคปซิด แบบเกลียว มีลักษณะ สมมาตร ข้อจำกัดทางเรขาคณิตเฉพาะเจาะจงจะนำมาใช้กับโครงสร้างที่เป็นไปได้ของโครงสร้างที่ห่อหุ้ม โครงสร้างแคปซิดทรงยี่สิบหน้าเป็นรูปแบบที่พบได้บ่อยที่สุดเนื่องจากสมมาตร 2-3-5 ของรูปทรงที่เป็นชื่อเรียก ทำให้สามารถใช้หน่วยสมมาตรสามเหลี่ยมที่เหมือนกันได้มากถึงจำนวนสูงสุด (60 หน่วย) เพื่อสร้างเปลือกทรงกลมเพื่อห่อหุ้มวัสดุที่กำหนดในขนาดใดก็ได้^{[ 12 ]}ในแง่ของการเพิ่มประสิทธิภาพอัตราส่วนของจำนวนชุดย่อยโปรตีนที่ต้องการและพื้นที่ผิวที่ห่อหุ้ม พบว่าสมมาตรทรงยี่สิบหน้าเป็นสมมาตรที่เล็กที่สุดและมีประสิทธิภาพมากที่สุดที่จะนำมาใช้^{[ 11 ]}โครงสร้างแคปซิดทรงยี่สิบหน้าเป็นการออกแบบที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการห่อหุ้มวัสดุเนื่องจากคุณสมบัติทางเรขาคณิตและความสมมาตร ทำให้การออกแบบที่มีประสิทธิภาพนี้ถูกนำมาใช้โดยธรรมชาติและจำเป็นโดยสายพันธุ์ไวรัสส่วนใหญ่^{[ 11 ]}ลักษณะสมมาตรและเป็นระเบียบสูงของผลึกไวรัสส่วนใหญ่สามารถอธิบายได้จากความสมมาตรโดยธรรมชาติของโครงสร้างแคปซิดทรงยี่สิบหน้าและปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีน^{[ 1 ]}

โดยทั่วไปไวรัสจะบุกรุกและยึดครองเซลล์เจ้าบ้านเพื่อใช้เป็นวิธีการจำลองตัวเอง^{[ 13 ]}เมื่อติดเชื้อแล้ว เซลล์เจ้าบ้านจะมีกระบวนการของเซลล์ที่บกพร่องเนื่องจากโปรตีนที่เข้ารหัสโดยไวรัสถูกผลิตขึ้นจากการจำลองและการแพร่กระจายของไวรัส^{[ 13 ]}กระบวนการนี้ประกอบด้วยปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนของ โครงสร้าง หลักและโครงสร้างตติยภูมิของแคปซิดและได้รับความสนใจอย่างมากเพื่อความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับ กลไก ทางโมเลกุลและชีวเคมีของพฤติกรรมของไวรัส^{[ 1 ]}

จุดประสงค์ของการตกผลึกคือการปลูกผลึกไวรัสที่มีขนาดเหมาะสมและมีคุณภาพสูงเพื่อให้สามารถอ่านได้อย่างถูกต้องในระหว่างกระบวนการสร้างภาพ^{[ 1 ]}การตกผลึกเทียมในห้องปฏิบัติการโดยทั่วไปดำเนินการในสี่ขั้นตอนหลัก:

1. การขยายพันธุ์

ไวรัสสายพันธุ์เฉพาะจะถูกนำไปไว้ในตู้อบที่มีเซลล์ที่แข็งแรง ซึ่งเลียนแบบสภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำงานอย่างถูกต้อง^{[ 3 ]}เมื่อมีเซลล์ที่แข็งแรงอยู่ ไวรัสจะเกาะติดและเกิดการจำลองตัวเองเพื่อสร้างตัวอย่างจำนวนมาก^{[ 13 ]}

2. การสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ (การแยกสาร)

อนุภาคไวรัสที่จำลองแบบจะถูกสกัดออกมา จากนั้นจึงทำการทำให้บริสุทธิ์เพื่อกำจัดสารที่ไม่ต้องการ เช่น เศษซาก^{[ 3 ]}กระบวนการนี้จะแยกอนุภาคไวรัสและทิ้งไว้ในสารละลายที่มีความเข้มข้นสูง^{[ 3 ]}จากนั้นจึงทำการปั่นเหวี่ยงซึ่งจะแยกของเหลวส่วนบน ออกจาก ตะกอนไวรัสที่เป็นของแข็ง[ ^{3 ] กระบวนการ}นี้จะทำซ้ำจนกระทั่งตะกอนมีความหนาแน่นมากขึ้นกลายเป็นเม็ดไวรัส^{[ 3 ]}

3. การเกิดนิวเคลียส

เม็ดไวรัสที่มีความเข้มข้นสูงจะได้รับการบำบัดด้วยสารเคมีที่ช่วยให้เกิดนิวเคลียสผลึกขนาดเล็ก ขั้นตอนดังกล่าวเรียกว่า การเกิด นิวเคลียสซึ่งเป็นกระบวนการที่สำคัญในช่วงเริ่มต้นของการตกผลึก โดยกลุ่มโปรตีนเปลือกหุ้มขนาดเล็กจะรวมตัวกันเพื่อสร้างหน่วยโครงสร้างของแคปซิดชั้นนอก^{[ 15 ]}โปรตีนเปลือกหุ้มบางชนิดมีประจุและทำให้เกิดแรงผลักทางไฟฟ้าสถิตซึ่งจำเป็นต้องเอาชนะด้วยปฏิกิริยาไฮโดรโฟบิกเพื่อให้แคปซิดตกผลึก^{[ 15 ]}ปฏิกิริยาไฮโดรโฟบิกหมายถึงแนวโน้มของ บริเวณ ที่ไม่เป็นขั้วของโมเลกุลที่รวมตัวกันอย่างแน่นหนาใน สภาพแวดล้อม ที่เป็นน้ำแต่ลดการสัมผัสกับน้ำให้น้อยที่สุด^{[ 16 ]}

4. การเจริญเติบโตของผลึก

โดยทั่วไปผลึกไวรัสจะเจริญเติบโตในหลอดทดลองเมื่อนิวเคลียสผลึกเริ่มต้นก่อตัวขึ้น^{[ 17 ]}การเจริญเติบโตของผลึกไวรัสอาจได้รับอิทธิพลจากปัจจัยต่างๆ เช่นอุณหภูมิ ค่า pH และการมีสารเติมแต่งหรือสารตกตะกอนเฉพาะในสารละลาย^{[ 3 ]}เมื่อประสบความสำเร็จ อนุภาคไวรัสจะเรียงตัวและรวมตัวกันในรูปแบบปกติ ก่อให้เกิดโครงสร้างตาข่าย สามมิติที่ ซ้ำ กัน ^{[ 3 ]}กระบวนการเจริญเติบโตอาจใช้เวลาหลายชั่วโมงถึงหลายวัน ขึ้นอยู่กับไวรัสและสภาวะการตกผลึก

โครงสร้างผลึกของผลึกไวรัสได้รับการถ่ายภาพเพื่อสร้างผลลัพธ์ทางภาพ มีการพัฒนาเพื่อให้ได้ข้อมูลเกี่ยวกับการจัดเรียงระดับจุลภาคในอนุภาคไวรัสที่ตรึงอยู่กับที่ การถ่ายภาพได้รับการปรับปรุงเมื่อเวลาผ่านไป เนื่องจากความก้าวหน้าในแหล่งกำเนิดรังสีเอกซ์ ตัวตรวจจับ และโปรแกรมการถ่ายภาพบนคอมพิวเตอร์ช่วยเพิ่มความเป็นไปได้ในกระบวนการต่างๆ เช่น ผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์ และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอ เจนิ ก^{[ 18 ]}

การตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ใช้ประโยชน์จากความสามารถของผลึกไวรัสในการเลี้ยวเบนคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าเมื่อได้รับรังสี^{[ 21 ]} ในกรณีนี้ การเลี้ยวเบนหมายถึงการรบกวนของคลื่นที่กระจัดกระจายซึ่งปล่อยออกมาในทิศทางต่างๆ ทั่วแลตติส^{[ 21 ]}รูปแบบการเลี้ยวเบนขึ้นอยู่กับลำดับภายในของผลึก^{[ 3 ]}ลำดับภายในสูงที่มีการจัดเรียงหนาแน่นจะสร้างรูปแบบการเลี้ยวเบนที่กว้างขวางมากขึ้นด้วยความละเอียดสูงขึ้น ทำให้สามารถกำหนดตำแหน่งอะตอมได้อย่างแม่นยำยิ่งขึ้น^{[ 3 ]}เครื่องวัดการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ใช้ในการวัดความสามารถของผลึกในการเลี้ยวเบนคลื่นเมื่อได้รับรังสีเอกซ์^{[ 21 ]}

การตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ไม่ได้รับประกันประสิทธิภาพที่แม่นยำสำหรับผลึกไวรัสทั้งหมด ตัวอย่างเช่น ผลึกไวรัสที่มีขนาดระดับโมเลกุล ขนาดใหญ่มีข้อจำกัดที่สำคัญเมื่อเทียบกับผลึกขนาดเล็กกว่า ^{[ 3 ]}ผลึกเหล่านี้อ่อนนุ่มกว่าและไวต่อความเสียหายมากกว่า และสามารถสลายตัวได้ง่ายเมื่อได้รับรังสีในปริมาณสูง^{[ 3 ]}ซึ่งเป็นผลมาจากปริมาณของเหลวระหว่างโมเลกุลจำนวนมาก โดยมี ปริมาณ ตัวทำละลายเฉลี่ย ประมาณ 50% ^{[ 3 ]}ตัวทำละลายประกอบด้วยน้ำและโมเลกุลขนาดเล็กอื่นๆ ที่แพร่กระจายได้อย่างอิสระผ่านช่องว่างระหว่างผลึก^{[ 3 ]}การมีอยู่ของช่องที่เต็มไปด้วยตัวทำละลายที่ไม่พึงประสงค์ภายในผลึกระดับโมเลกุลขนาดใหญ่จะขัดขวางการอ่านรูปแบบการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์^{[ 3 ]}

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอเจนิก (Cryo-EM)ใช้จลนศาสตร์ของลำแสงอิเล็กตรอนในการตรวจจับและสร้างภาพตัวอย่าง^{[ 22 ]} Cryo-EM ให้ประสิทธิภาพโดยรวมที่ดีกว่ากล้องจุลทรรศน์แสง แบบดั้งเดิม เนื่องจากมีความละเอียดและกำลังขยายสูงกว่า^{[ 22 ]}

ใน cryo-EM ไม่จำเป็นต้องมีการตกผลึก และสามารถสังเกตตัวอย่างทางชีวภาพได้โดยตรง เช่น เซลล์โฮสต์ที่ติดเชื้อและไวรัสที่ทำงานอยู่^{[ 17 ]}ซึ่งให้ข้อได้เปรียบที่สำคัญเหนือการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์เมื่อตรวจสอบโครงสร้างไวรัสที่ซับซ้อนซึ่งเป็นความท้าทายในระหว่างการตกผลึก โดยเฉพาะอย่างยิ่งมีประโยชน์ในการสังเกตการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของไวรัส ซึ่งทำได้ยากหากใช้การตกผลึก^{[ 17 ]}

อย่างไรก็ตาม แม้ว่า Cryo-EM จะสามารถให้ความละเอียดสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงได้แต่ก็ยังไม่เพียงพอที่จะเหนือกว่าการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์^{[ 17 ]}การตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ยังคงเป็นวิธีการที่เหมาะสมที่สุดเมื่อพิจารณาถึงโครงสร้างระดับอะตอมและปฏิสัมพันธ์ระดับไมโครโมเลกุล^{[ 17 ]}ดังนั้น นักวิจัยจึงผสมผสานทั้ง Cryo-EM และการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์เข้าด้วยกันเพื่อเป็นวิธีการเอาชนะข้อจำกัดของกันและกัน

ความก้าวหน้าล่าสุดในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM)ได้ขยายขอบเขตที่นักวิจัยสามารถค้นพบสัณฐานวิทยาของไวรัสได้ Cryo-EM เริ่มมีคุณสมบัติของตัวตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรง (DEDs)ซึ่งเกี่ยวข้องกับการแปลงอิเล็กตรอนที่ถูกปล่อยออกมาเป็นสัญญาณไฟฟ้าโดยตรง จึงช่วยปรับปรุงความเร็วและความเป็นไปได้ของกระบวนการสร้างภาพ^{[ 23 ]}ข้อจำกัดในการศึกษาโมเลกุลเชิงซ้อนขนาดใหญ่ได้รับการแก้ไขด้วยการนำcryo-electron tomography (cryo-ET)มาใช้ ซึ่งเป็นทางเลือกอื่นนอกเหนือจาก cryo-EM ที่ช่วยให้สามารถมองเห็นสภาพแวดล้อมและการปฏิสัมพันธ์ภายนอกเซลล์โฮสต์ที่ไวรัสอาศัยอยู่ได้^{[ 23 ]}ความก้าวหน้าดังกล่าวได้ผลักดันความเข้าใจเกี่ยวกับกิจกรรมของไวรัสในสภาพแวดล้อมของเซลล์โฮสต์ แทนที่จะมุ่งเน้นเฉพาะตัวไวรัสเอง^{[ 23 ]}

ความก้าวหน้าในการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ภายใต้ชื่อการตกผลึกโมเลกุลขนาดใหญ่ (MX)มีส่วนเกี่ยวข้องกับขั้นตอนการปรับปรุงเทคโนโลยีภาพด้วยเช่นกัน^{[ 18 ]} MX ถือเป็นสาขาวิทยาศาสตร์ใหม่ที่ปรับใช้เครื่องมือขั้นสูงและกระบวนการอัตโนมัติ โดยดำเนินการด้วย แหล่งกำเนิด ซินโครตรอนเครื่องตรวจจับความเร็วสูง และวิธีการส่งตัวอย่างที่เป็นนวัตกรรมใหม่เพื่อศึกษาคุณลักษณะแบบไดนามิกของโมเลกุลขนาดใหญ่^{[ 18 ]}เทคนิคดังกล่าวที่สังเกตพลวัตของไวรัสมากกว่าองค์ประกอบคงที่ของมันเรียกว่าการตกผลึกแบบเวลาที่กำหนด^{[ 18 ]}

การศึกษาผลึกแบบเวลาจำเพาะได้รับการอำนวยความสะดวกโดยเลเซอร์อิเล็กตรอนอิสระเอ็กซ์เรย์ (XFELs)ซึ่งเป็นแหล่งกำเนิดแสงรุ่นใหม่ที่สืบทอดมาจากรังสีซินโครตรอน แบบดั้งเดิม เนื่องจากช่วยให้สามารถควบคุมกำลังแสงและระยะได้มากขึ้น^{[ 18 ] [ 24 ]}แม้ว่า Cryo-EM จะพัฒนาอย่างรวดเร็วและไม่จำเป็นต้องใช้การตกผลึก แต่ MX และ XFELs ก็ทำให้การตกผลึกของไวรัสยังคงมีความเกี่ยวข้องและมีบทบาทสำคัญในการให้รายละเอียดระดับอะตอมของไวรัส^{[ 18 ]}

ประเด็นที่ว่าไวรัส 'มีชีวิต' หรือไม่นั้นเป็นหัวข้อที่มีการถกเถียงกันอย่างมากทั่วโลก แม้ว่าไวรัสจะแสดงพฤติกรรมบางอย่างที่สามารถอธิบายได้ว่าเป็น 'มีชีวิต' เช่น ความสามารถในการจำลองตัว เอง และวิวัฒนาการ แต่ไวรัสก็ขาดคุณสมบัติที่สำคัญบางอย่างที่มักเกี่ยวข้องกับสิ่งมีชีวิต เช่น โครงสร้างของเซลล์และการเผาผลาญที่เป็นอิสระ^{[ 25 ]} การเอาชนะข้อจำกัดในการตกผลึกของไวรัสสามารถให้รายละเอียดที่สำคัญเกี่ยวกับปฏิสัมพันธ์ระดับโมเลกุลที่ไม่รู้จักซึ่งกำหนดพฤติกรรมที่คล้ายสิ่งมีชีวิตของไวรัส ทำให้สามารถเปรียบเทียบคุณลักษณะของไวรัสกับสิ่งมีชีวิตในอาณาจักรชีวภาพได้

ด้วยการพัฒนาที่สำคัญในด้านการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอนักวิจัยจึงหันกลับมาให้ความสนใจกับกระบวนการเจริญเติบโตของผลึก อีก ครั้ง เนื่องจากยังคงเป็นประเด็นสำคัญที่จำกัดความแปรปรวนของขนาดผลึก จำเป็นต้องให้ความสำคัญกับการเอาชนะข้อจำกัดของผลึกโมเลกุลขนาดใหญ่มากขึ้น เนื่องจากความต้องการในหมู่นักวิจัยกำลังเพิ่มขึ้น^{[ 26 ]}ผลึกไวรัสจำนวนมากอยู่ในประเภทนี้ ดังนั้นเทคนิคการตกผลึกแบบดั้งเดิมจึงคาดว่าจะได้รับความสนใจมากขึ้นในอนาคต^{[ 26 ]}