กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นเทคนิคการถ่ายภาพด้วยแสงเพื่อเพิ่มความละเอียดและความคมชัดของภาพจุลทรรศน์ด้วยการใช้รูเข็มในเชิงพื้นที่เพื่อปิดกั้นแสงที่อยู่นอกโฟกัสในการสร้างภาพ^{[ 1 ]}การจับภาพสองมิติหลายภาพที่ระดับความลึกต่างกันในตัวอย่างทำให้สามารถสร้างโครงสร้างสามมิติขึ้นใหม่ได้ (กระบวนการที่เรียกว่าการตัดด้วยแสง ) ภายในวัตถุ เทคนิคนี้ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในวงการวิทยาศาสตร์ และอุตสาหกรรม และการใช้งานทั่วไป ได้แก่วิทยาศาสตร์ชีวภาพ การตรวจสอบ เซมิคอนดักเตอร์และวิทยาศาสตร์ วัสดุ

ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดา แสงจะเดินทางผ่านตัวอย่างเข้าไปในชิ้นงานได้ลึกที่สุดเท่าที่จะทำได้ ในขณะที่กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลจะโฟกัสลำแสงขนาดเล็กกว่าไปยังระดับความลึกที่แคบเพียงระดับเดียวในแต่ละครั้ง กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลเลเซอร์สแกนนิ่ง (CLSM) จึงสามารถควบคุมและจำกัดความชัดลึกได้อย่างแม่นยำ

หลักการของการถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลได้รับการจดสิทธิบัตรในปี พ.ศ. 2490 โดยMarvin Minsky ^{[ 2 ]}และมีจุดมุ่งหมายเพื่อเอาชนะข้อจำกัดบางประการของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ แบบสนามกว้างแบบ ดั้งเดิม^{[ 3 ]} ใน กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบทั่วไป (เช่น แบบสนามกว้าง) ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกส่องสว่างอย่างสม่ำเสมอจากแหล่งกำเนิดแสง ทุกส่วนของตัวอย่างสามารถถูกกระตุ้นได้พร้อมกัน และ ฟลู ออเรสเซนต์ ที่เกิดขึ้นจะถูกตรวจจับโดย โฟโตดีเทคเตอร์หรือกล้องของกล้องจุลทรรศน์รวมถึงส่วนพื้นหลังที่ไม่โฟกัสขนาดใหญ่ ในทางตรงกันข้าม กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลใช้การส่องสว่างแบบจุด (ดูฟังก์ชันการกระจายจุด ) และรูเล็กๆ ในระนาบที่ประสานกันทางแสงด้านหน้าตัวตรวจจับเพื่อกำจัดสัญญาณที่อยู่นอกโฟกัส – ชื่อ "คอนโฟคอล" มาจากการกำหนดค่านี้ เนื่องจากสามารถตรวจจับเฉพาะแสงที่เกิดจากฟลูออเรสเซนต์ที่อยู่ใกล้ระนาบโฟกัสมากเท่านั้นความละเอียดเชิงแสงของภาพโดยเฉพาะอย่างยิ่งในทิศทางความลึกของตัวอย่าง จึงดีกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบสนามกว้างมาก อย่างไรก็ตาม เนื่องจากแสงส่วนใหญ่จากฟลูออเรสเซนซ์ของตัวอย่างถูกปิดกั้นที่รูเข็ม ความละเอียดที่เพิ่มขึ้นนี้จึงมาพร้อมกับการลดลงของความเข้มของสัญญาณ ดังนั้นจึง มักต้องใช้เวลาใน การเปิดรับ แสงนาน เพื่อชดเชยการลดลงของสัญญาณหลังจากรูเข็มความเข้มของแสงจะถูกตรวจจับโดยตัวตรวจจับที่ไวต่อแสง ซึ่งโดยปกติจะเป็น หลอด โฟโตมัลติพลายเออร์ (PMT) หรือโฟโตไดโอดแบบอะวาแลนซ์โดยแปลงสัญญาณแสงเป็นสัญญาณไฟฟ้า^{[ 4 ]}

เนื่องจากมีการส่องสว่างเพียงจุดเดียวในตัวอย่างในแต่ละครั้ง การสร้างภาพ 2 มิติหรือ 3 มิติ จึงต้องใช้การสแกนตามแนวเส้นสแกนขนานที่สม่ำเสมอ (เช่น รูปแบบสี่เหลี่ยมผืนผ้า) ในชิ้นงาน ลำแสงจะถูกสแกนไปทั่วตัวอย่างในระนาบแนวนอนโดยใช้กระจกสะท้อนแสงแบบสั่น ( ควบคุมด้วย เซอร์โว ) หนึ่งบานหรือมากกว่า วิธีการสแกนนี้โดยทั่วไปมี ความหน่วงในการตอบสนองต่ำและสามารถปรับความเร็วในการสแกนได้ การสแกนที่ช้าลงจะให้อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน ที่ดีกว่า ส่งผลให้ได้ความคมชัด ที่ดี กว่า

ความหนาของระนาบโฟกัสที่ทำได้นั้นส่วนใหญ่กำหนดโดยความยาวคลื่นของแสงที่ใช้หารด้วยค่ารูรับแสงเชิงตัวเลขของเลนส์วัตถุแต่ยังขึ้นอยู่กับคุณสมบัติทางแสงของชิ้นงานด้วยการตัดภาพด้วยแสง ที่บางมาก ทำให้กล้องจุลทรรศน์ประเภทนี้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการสร้างภาพสามมิติและการวิเคราะห์พื้นผิวของตัวอย่าง

การตัดเฉือนต่อเนื่องกันจะประกอบเป็น 'z-stack' ซึ่งสามารถนำไปประมวลผลเพื่อสร้างภาพ 3 มิติ หรือรวมเข้าเป็น 2 มิติ (โดยส่วนใหญ่จะใช้ค่าความเข้มของพิกเซลสูงสุด วิธีอื่นๆ ที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ การใช้ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานหรือการรวมพิกเซล) ^{[ 1 ]}

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลให้ความสามารถในการตัดภาพแบบอนุกรม โดยตรงและไม่รุกราน ของตัวอย่างที่มีชีวิต หนา และสมบูรณ์ โดยมีการเตรียมตัวอย่างน้อยที่สุด รวมถึงมีการปรับปรุงความละเอียดด้านข้างเล็กน้อยเมื่อเทียบกับกล้องจุลทรรศน์แบบสนามกว้าง^{[ 4 ]}ตัวอย่างทางชีวภาพมักได้รับการบำบัดด้วยสีย้อมเรืองแสงเพื่อให้มองเห็นวัตถุที่เลือกได้ อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นของสีย้อมจริงอาจต่ำเพื่อลดการรบกวนระบบชีวภาพให้น้อยที่สุด เครื่องมือบางชนิดสามารถติดตามโมเลกุลเรืองแสงเดี่ยวได้ นอกจากนี้ เทคนิค การดัดแปลงพันธุกรรมสามารถสร้างสิ่งมีชีวิตที่ผลิตโมเลกุลไคเมอริกเรืองแสงของตัวเองได้ (เช่น การรวมกันของ GFP โปรตีนเรืองแสงสีเขียวกับโปรตีนที่สนใจ) กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลทำงานบนหลักการของการกระตุ้นจุดในตัวอย่าง (จุดจำกัดการเลี้ยวเบน) และการตรวจจับจุดของสัญญาณเรืองแสงที่เกิดขึ้น รูเล็กๆ ที่ตัวตรวจจับทำหน้าที่เป็นกำแพงทางกายภาพที่ปิดกั้นการเรืองแสงที่อยู่นอกโฟกัส เฉพาะจุดที่อยู่ในโฟกัสหรือจุดศูนย์กลางของดิสก์ Airy เท่านั้น ที่จะถูกบันทึก

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลมีวางจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ 4 ประเภท:

กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนนิ่งแบบคอนโฟคอลใช้กระจกหลายบาน (โดยทั่วไป 2 หรือ 3 บาน สแกนในแนวเส้นตรงตามแกน x และ y) เพื่อสแกนเลเซอร์ไปทั่วตัวอย่างและ "สแกนกลับ" ภาพผ่านรูรับแสงและตัวตรวจจับที่คงที่ กระบวนการนี้มักจะช้าและไม่เหมาะสำหรับการถ่ายภาพสิ่งมีชีวิต แต่สามารถเป็นประโยชน์ในการสร้างภาพที่มีความละเอียดสูงของตัวอย่าง ที่ตรึงไว้ได้

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟ คอลแบบจานหมุน ( จานนิปโคว์ ) ใช้ชุดรูเล็กๆ ที่เคลื่อนที่ได้บนแผ่นดิสก์เพื่อสแกนจุดแสง เนื่องจากชุดรูเล็กๆ สแกนพื้นที่แบบขนานกัน ทำให้แต่ละรูสามารถลอยอยู่เหนือพื้นที่เฉพาะได้นานขึ้น ซึ่งช่วยลดพลังงานกระตุ้นที่จำเป็นในการส่องสว่างตัวอย่างเมื่อเทียบกับกล้องจุลทรรศน์แบบสแกนด้วยเลเซอร์ พลังงานกระตุ้นที่ลดลงช่วยลดความเป็นพิษต่อแสงและการซีดจางของตัวอย่าง ทำให้ระบบนี้มักเป็นระบบที่นิยมใช้สำหรับการถ่ายภาพเซลล์หรือสิ่งมีชีวิตที่มีชีวิต

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบ ไมโครเลนส์เสริมหรือแบบจานหมุนคู่ทำงานภายใต้หลักการเดียวกันกับกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบจานหมุน ยกเว้นว่าจะมีจานหมุนที่สองซึ่งมีไมโครเลนส์วางอยู่ก่อนจานหมุนที่มีรูเล็กๆ แต่ละรูจะมีไมโครเลนส์ที่เกี่ยวข้อง ไมโครเลนส์ทำหน้าที่จับแถบแสงกว้างและโฟกัสแสงไปยังแต่ละรู ทำให้ปริมาณแสงที่ส่งไปยังแต่ละรูเพิ่มขึ้นอย่างมาก และลดปริมาณแสงที่ถูกปิดกั้นโดยจานหมุน ดังนั้นกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบไมโครเลนส์เสริมจึงมีความไวมากกว่าระบบจานหมุนมาตรฐานอย่างมากบริษัท Yokogawa Electricคิดค้นเทคโนโลยีนี้ในปี 1992 ^{[ 5 ]}

กล้องจุลทรรศน์แบบอาร์เรย์ที่ตั้งโปรแกรมได้ (PAM)ใช้ตัวปรับแสงเชิงพื้นที่ ที่ควบคุมด้วยระบบอิเล็กทรอนิกส์ (SLM) ซึ่งสร้างชุดรูเล็กๆ ที่เคลื่อนที่ได้ SLM เป็นอุปกรณ์ที่ประกอบด้วยอาร์เรย์ของพิกเซล โดยแต่ละพิกเซลมีคุณสมบัติบางอย่าง ( ความทึบแสงการสะท้อนแสงหรือการหมุนเชิงแสง ) ซึ่งสามารถปรับเปลี่ยนได้ด้วยระบบอิเล็กทรอนิกส์ SLM ประกอบด้วยกระจกไมโครอิเล็กโทรเมคานิกส์หรือ ส่วนประกอบ ผลึกเหลวโดยปกติแล้วภาพจะถูกบันทึกโดย กล้อง CCD ( charge-coupled device )

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแต่ละประเภทเหล่านี้มีข้อดีและข้อเสียเฉพาะตัว ระบบส่วนใหญ่ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับความเร็วในการบันทึก (เช่น การจับภาพวิดีโอ) หรือความละเอียดเชิงพื้นที่สูง กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนนิ่งคอนโฟคอลสามารถมีความหนาแน่นของการสุ่มตัวอย่างที่ตั้งโปรแกรมได้และความละเอียดสูงมาก ในขณะที่ Nipkow และ PAM ใช้ความหนาแน่นของการสุ่มตัวอย่างคงที่ซึ่งกำหนดโดยความละเอียดของกล้องอัตราเฟรม ภาพ โดยทั่วไปจะช้ากว่าสำหรับระบบเลเซอร์สแกนนิ่งแบบจุดเดียวเมื่อเทียบกับระบบจานหมุนหรือ PAM กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบจานหมุนเชิงพาณิชย์มีอัตราเฟรมมากกว่า 50 เฟรมต่อวินาที^{[ 6 ]}ซึ่งเป็นคุณสมบัติที่พึงประสงค์สำหรับการสังเกตแบบไดนามิก เช่น การถ่ายภาพเซลล์มีชีวิต

ความก้าวหน้าล่าสุดในการพัฒนากล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนแบบคอนโฟคอล ทำให้สามารถถ่ายภาพได้เร็วกว่าอัตราเฟรมวิดีโอมาตรฐาน (60 เฟรมต่อวินาที) โดยใช้กระจกสแกนแบบไมโครอิเล็กโทรเมคานิกส์หลายตัว

การถ่ายภาพ ฟลูออเรสเซนซ์เอกซ์เรย์แบบคอนโฟ คอล เป็นเทคนิคใหม่ที่ช่วยให้สามารถควบคุมความลึกได้ นอกเหนือจากการเล็งในแนวนอนและแนวตั้ง เช่น เมื่อวิเคราะห์ชั้นที่ฝังอยู่ในภาพวาด^{[ 7 ]}

CLSM เป็นเทคนิคการถ่ายภาพแบบสแกน ซึ่งความละเอียดที่ได้นั้นสามารถอธิบายได้ดีที่สุดโดยการเปรียบเทียบกับเทคนิคการสแกนอื่นๆ เช่นกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (SEM) CLSM มีข้อดีคือไม่จำเป็นต้องใช้หัววัดที่แขวนอยู่ห่างจากพื้นผิวในระดับนาโนเมตร เหมือนในAFMหรือSTMเป็นต้น ซึ่งภาพได้มาจากการสแกนด้วยปลายแหลมขนาดเล็กบนพื้นผิว ระยะห่างจากเลนส์วัตถุถึงพื้นผิว (เรียกว่าระยะการทำงาน ) โดยทั่วไปจะเทียบได้กับกล้องจุลทรรศน์แบบออปติคอลทั่วไป ระยะการทำงานจะแตกต่างกันไปตามการออกแบบทางแสงของระบบ แต่โดยทั่วไประยะการทำงานจะอยู่ระหว่างหลายร้อยไมโครเมตรถึงหลายมิลลิเมตร

ในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล (CLSM) ตัวอย่างจะถูกส่องสว่างด้วยแหล่งกำเนิดแสงเลเซอร์แบบจุด และแต่ละองค์ประกอบปริมาตรจะสัมพันธ์กับความเข้มของการกระเจิงหรือการเรืองแสงแบบไม่ต่อเนื่อง ขนาดของปริมาตรการสแกนจะถูกกำหนดโดยขนาดจุด (ใกล้เคียงกับ ขีดจำกัด การเลี้ยวเบน ) ของระบบออปติก เนื่องจากภาพของเลเซอร์สแกนไม่ใช่จุดเล็ก ๆ ที่ไม่มีที่สิ้นสุด แต่เป็นรูปแบบการเลี้ยวเบนสามมิติ ขนาดของรูปแบบการเลี้ยวเบนนี้และปริมาตรโฟกัสที่กำหนดจะถูกควบคุมโดยรูรับแสงเชิงตัวเลขของเลนส์วัตถุของระบบและความยาวคลื่นของเลเซอร์ที่ใช้ นี่อาจมองได้ว่าเป็นขีดจำกัดความละเอียดแบบคลาสสิกของกล้องจุลทรรศน์แบบออปติกทั่วไปที่ใช้การส่องสว่างแบบสนามกว้าง อย่างไรก็ตาม ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล เราสามารถปรับปรุงขีดจำกัดความละเอียดของเทคนิคการส่องสว่างแบบสนามกว้างได้ดียิ่งขึ้น เนื่องจากรูรับแสงแบบคอนโฟคอลสามารถปิดลงเพื่อกำจัดลำดับที่สูงกว่าของรูปแบบการเลี้ยวเบนได้ ตัวอย่างเช่น หากตั้งค่าเส้นผ่านศูนย์กลางของรูเข็มเป็น 1 หน่วย Airyเฉพาะลำดับแรกของรูปแบบการเลี้ยวเบนเท่านั้นที่จะผ่านรูรับแสงไปยังตัวตรวจจับ ในขณะที่ลำดับที่สูงกว่าจะถูกปิดกั้น ซึ่งจะช่วยปรับปรุงความละเอียดโดยแลกกับการลดความสว่างลงเล็กน้อย ในการสังเกตการณ์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลมักถูกจำกัดด้วยอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนที่เกิดจากจำนวนโฟตอนที่มีอยู่น้อยในกล้องจุลทรรศน์แบบฟลูออเรสเซนซ์ สามารถชดเชยผลกระทบนี้ได้โดยใช้โฟโตดีเทคเตอร์ที่มีความไวสูงกว่า หรือโดยการเพิ่มความเข้มของแหล่งกำเนิดแสงเลเซอร์ การเพิ่มความเข้มของเลเซอร์อาจเสี่ยงต่อการฟอกสีมากเกินไปหรือความเสียหายอื่นๆ ต่อตัวอย่างที่สนใจ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการทดลองที่ต้องการเปรียบเทียบความสว่างของฟลูออเรสเซนซ์ เมื่อถ่ายภาพเนื้อเยื่อที่มีการหักเหของแสงแตกต่างกัน เช่น เนื้อเยื่อมีโซฟิลล์ที่เป็นรูพรุนของใบพืชหรือเนื้อเยื่ออื่นๆ ที่มีช่องว่างอากาศ ความคลาดเคลื่อนทรงกลมที่ลดคุณภาพของภาพคอนโฟคอลมักจะเด่นชัด อย่างไรก็ตาม ความคลาดเคลื่อนดังกล่าวสามารถลดลงได้อย่างมากโดยการติดตั้งตัวอย่างในสารเพอร์ฟลูออโรคาร์บอน ที่โปร่งใสและไม่เป็นพิษ เช่นเพอร์ฟลูออโรเดคาลินซึ่งแทรกซึมเข้าสู่เนื้อเยื่อได้ง่ายและมีดัชนีหักเหเกือบจะเหมือนกับน้ำ^{[ 8 ]}เมื่อทำการถ่ายภาพในเรขาคณิตแบบสะท้อน ยังสามารถตรวจจับการรบกวนของแสงสะท้อนและแสงกระเจิงของวัตถุ เช่น ออร์แกเนลล์ภายในเซลล์ได้อีกด้วย ลักษณะการรบกวนของสัญญาณทำให้สามารถลดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของรูเข็มลงเหลือ 0.2 หน่วย Airy และด้วยเหตุนี้จึงทำให้สามารถเพิ่มความละเอียดได้อย่างเหมาะสมถึง √2 โดยไม่ทำให้อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนลดลงเหมือนในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบคอนโฟคอล^{[ 9 ]}

CLSM ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายใน สาขา วิทยาศาสตร์ชีวภาพ ต่างๆ ตั้งแต่ชีววิทยาของเซลล์และพันธุศาสตร์ไปจนถึงจุลชีววิทยาและชีววิทยาการพัฒนา^{[ 10 ]}นอกจากนี้ยังใช้ในควอนตัมออปติกส์และการถ่ายภาพและสเปกโทรสโกปีของนาโนคริสตัลด้วย

ในทางคลินิก CLSM ใช้ในการประเมินโรคตาต่างๆ และมีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการถ่ายภาพ การวิเคราะห์เชิงคุณภาพ และการหาปริมาณของเซลล์เยื่อบุผิวของกระจกตา[ ^{11 ] ใช้}ในการระบุตำแหน่งและระบุการมีอยู่ขององค์ประกอบเชื้อราที่เป็นเส้นใยใน เนื้อเยื่อ กระจกตาในกรณีของโรคกระจกตาอักเสบจากเชื้อราทำให้สามารถวินิจฉัยได้อย่างรวดเร็วและเริ่มการรักษาที่แน่นอนได้ตั้งแต่เนิ่นๆ การวิจัยเกี่ยวกับเทคนิค CLSM สำหรับ ขั้นตอน การส่องกล้อง ( เอนโดไมโครสโคปี ) ก็มีแนวโน้มที่ดีเช่นกัน^{[ 12 ]}ในอุตสาหกรรมยา มีการแนะนำให้ติดตามกระบวนการผลิตยาในรูปแบบฟิล์มบาง เพื่อควบคุมคุณภาพและความสม่ำเสมอของการกระจายตัวของยา^{[ 13 ]}กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลยังใช้ในการศึกษาไบโอฟิล์มซึ่งเป็นโครงสร้างที่มีรูพรุนซับซ้อนที่เป็นที่อยู่อาศัยที่จุลินทรีย์ชื่นชอบ หน้าที่บางอย่างของไบโอฟิล์มทั้งในเชิงเวลาและพื้นที่สามารถเข้าใจได้โดยการศึกษาโครงสร้างของมันในระดับจุลภาคและระดับกลางเท่านั้น การศึกษาในระดับจุลภาคมีความจำเป็นในการตรวจจับกิจกรรมและการจัดระเบียบของจุลินทรีย์แต่ละตัว^{[ 14 ]}

CLSM ถูกใช้เป็นกลไกการดึงข้อมูลใน ระบบ จัดเก็บข้อมูลเชิงแสง 3 มิติ บางระบบ และช่วยในการกำหนดอายุของกระดาษปาปิรัสแมรี แม็กดาลีน

ระบบIRENEใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟกัลสำหรับการสแกนด้วยแสงและการกู้คืนเสียงประวัติศาสตร์ที่เสียหาย^{[ 15 ]}กระบอกเสียงขี้ผึ้งจะเสื่อมสภาพลงเนื่องจากการสัมผัสกับเข็มเมื่อเล่นซ้ำตามที่ตั้งใจไว้^{[ 16 ]}กล้องจุลทรรศน์เป็นแบบไม่สัมผัส และมักให้เสียงที่ดีกว่าการเล่นด้วยเข็ม^{[ 17 ]}

กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนนิ่งคอนโฟกัลถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ลักษณะพื้นผิวของวัสดุที่มีโครงสร้างระดับไมโคร เช่น แผ่นเวเฟอร์ ซิลิคอนที่ใช้ใน การผลิต เซลล์แสงอาทิตย์ในขั้นตอนการประมวลผลขั้นแรก แผ่นเวเฟอร์จะถูกกัดด้วยสารเคมีเปียกโดยใช้สารประกอบกรดหรือด่าง ทำให้เกิดพื้นผิวที่มีลักษณะเฉพาะ จากนั้นจึงใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟกัลในการสังเกตสภาพของพื้นผิวที่ได้ในระดับไมโครเมตร นอกจากนี้ กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟกัลยังสามารถใช้ในการวิเคราะห์ความหนาและความสูงของเส้นโลหะที่พิมพ์อยู่บนเซลล์แสงอาทิตย์ได้อีกด้วย

ฟังก์ชันการกระจายจุดของรูรับแสงขนาดเล็กเป็นรูปทรงรี ซึ่งมีความยาวเป็นหลายเท่าของความกว้าง สิ่งนี้จำกัดความละเอียดตามแนวแกนของกล้องจุลทรรศน์ เทคนิคหนึ่งในการเอาชนะข้อจำกัดนี้คือกล้องจุลทรรศน์แบบ 4Piซึ่งแสงตกกระทบและ/หรือแสงที่เปล่งออกมาจะเกิดการแทรกสอดกันจากทั้งด้านบนและด้านล่างของตัวอย่างเพื่อลดปริมาตรของรูปทรงรี อีกเทคนิคหนึ่งคือกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลเธต้าในเทคนิคนี้ กรวยของแสงส่องสว่างและแสงที่ตรวจจับได้จะทำมุมกัน (ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดเมื่อตั้งฉากกัน) จุดตัดของฟังก์ชันการกระจายจุดทั้งสองจะให้ปริมาตรตัวอย่างที่มีประสิทธิภาพเล็กลงมาก จากเทคนิคนี้จึงได้พัฒนากล้องจุลทรรศน์แบบส่องสว่างระนาบเดียวนอกจากนี้อาจใช้การลดการเบลอ โดยใช้ ฟังก์ชันการกระจายจุด ที่ได้จากการทดลอง เพื่อกำจัดแสงที่อยู่นอกโฟกัส ซึ่งจะช่วยปรับปรุงความคมชัดทั้งในระนาบตามแนวแกนและระนาบด้านข้าง

มีกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลหลายแบบที่ให้ความละเอียดต่ำกว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบน เช่นกล้องจุลทรรศน์แบบกระตุ้นการปล่อย แสง (STED) นอกจากเทคนิคนี้แล้วยังมีเทคนิคความละเอียดสูงพิเศษ อื่นๆ อีกมากมาย (ที่ไม่ใช่แบบคอนโฟคอล) เช่น PALM, (d)STORM , SIM และอื่นๆ แต่ละเทคนิคมีข้อดีของตัวเอง เช่น ใช้งานง่าย ความละเอียด และความต้องการอุปกรณ์ บัฟเฟอร์ หรือฟลูออโรฟอร์พิเศษ

ในการสร้างภาพตัวอย่างที่อุณหภูมิต่ำ มีการใช้แนวทางหลักสองวิธี โดยทั้งสองวิธีนั้นใช้ สถาปัตยกรรม ของกล้องจุลทรรศน์แบบเลเซอร์สแกนคอนโฟกัลวิธีหนึ่งคือการใช้ไครโอสแตทแบบไหลต่อเนื่อง : มีเพียงตัวอย่างเท่านั้นที่อยู่ในอุณหภูมิต่ำ และจะมองเห็นได้ด้วยแสงผ่านหน้าต่างโปร่งใส^{[ 18 ]}อีกวิธีหนึ่งที่เป็นไปได้คือการมีส่วนหนึ่งของระบบเลนส์ (โดยเฉพาะเลนส์วัตถุของกล้องจุลทรรศน์) อยู่ในถังเก็บความเย็นแบบไครโอเจนิก [ ^{19 ] แม้ว่า}วิธีที่สองนี้จะยุ่งยากกว่า แต่ก็รับประกันความเสถียรทางกลที่ดีกว่าและหลีกเลี่ยงการสูญเสียเนื่องจากหน้าต่าง

ในการศึกษาปฏิสัมพันธ์ระดับโมเลกุลโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนแบบคอนโฟคอล (CLSM) สามารถใช้ การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ของฟอร์สเตอร์ (FRET) เพื่อยืนยันว่าโปรตีนสองชนิดอยู่ห่างกันในระยะที่กำหนด

• 
  เบต้า-ทูบูลินในTetrahymena ( โปรโตซั วมีขน )
• 
  ภาพตัดขวางบางส่วนของพื้นผิวเหรียญ 1 ยูโร วัดด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบดิสก์นิปโคว์
• 
  ข้อมูลการสะท้อนแสงสำหรับเหรียญ 1 ยูโร
• 
  ภาพแสดง เส้นใย แอคตินในเซลล์มะเร็ง โดยใช้รหัสสี
• 
  สัญญาณสีเขียวจากแอนติบอดีต่อทูบูลินที่เชื่อมต่อกับ Alexa Fluor 488 และนิวเคลียส (สัญญาณสีน้ำเงินจาก DNA ที่ย้อมด้วย DAPI) ในเซลล์เมริสเต็มของรากของ Arabidopsis thaliana อายุ 4 วัน (Col-0) แถบมาตราส่วน: 5 ไมโครเมตร

ในปี พ.ศ. 2483 ฮันส์ โกลด์มันน์จักษุแพทย์ในเมืองเบิร์น ประเทศสวิ ตเซอร์แลนด์ ได้พัฒนา ระบบ สลิตแลมป์เพื่อบันทึกการตรวจตา^{[ 20 ]}ระบบนี้ได้รับการพิจารณาโดยผู้เขียนรุ่นหลังบางคนว่าเป็นระบบออปติคอลคอนโฟคอลระบบแรก^{[ 21 ] [ 22 ]}

ในปี พ.ศ. 2486 Zyun Koana ได้เผยแพร่ระบบคอนโฟคอล^{[ 23 ] [ 21 ]}

ในปี พ.ศ. 2494 ฮิโรโตะ นาโอระ เพื่อนร่วมงานของโคอานะ ได้อธิบายกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลในวารสารScienceสำหรับการตรวจวัดด้วยสเปกโตรโฟโตเมตรี^{[ 24 ]}

กล้องจุลทรรศน์ แบบสแกนคอนโฟคอลเครื่องแรกถูกสร้างขึ้นโดยMarvin Minskyในปี 1955 และมีการยื่นจดสิทธิบัตรในปี 1957 การสแกนจุดส่องสว่างในระนาบโฟกัสทำได้โดยการเคลื่อนแท่นวาง ไม่มีการส่งสิ่งพิมพ์ทางวิทยาศาสตร์ใดๆ และไม่มีการเก็บรักษาภาพใดๆ ที่สร้างด้วยกล้องจุลทรรศน์นี้^{[ 2 ] [ 25 ]}

ในช่วงทศวรรษ 1960 Mojmír Petráň ชาวเชโกสโลวาเกีย จากคณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยชาร์ลส์ในเมืองพลเซนได้พัฒนากล้องจุลทรรศน์แบบสแกนคู่ (Tandem-Scanning-Microscope) ซึ่งเป็นกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลเชิงพาณิชย์เครื่องแรก กล้องจุลทรรศน์นี้ถูกจำหน่ายโดยบริษัทขนาดเล็กในเชโกสโลวาเกีย และในสหรัฐอเมริกาโดยบริษัท Tracor-Northern (ต่อมาคือ Noran) โดยใช้แผ่นดิสก์ Nipkow แบบหมุน เพื่อสร้างรูเข็มกระตุ้นและปล่อยแสงหลายรู^{[ 22 ] [ 26 ]}

สิทธิบัตรของเชโกสโลวาเกียถูกยื่นในปี 1966 โดย Petráň และ Milan Hadravský ซึ่งเป็นเพื่อนร่วมงานชาวเชโกสโลวาเกีย สิ่งพิมพ์ทางวิทยาศาสตร์ฉบับแรกที่มีข้อมูลและภาพที่สร้างขึ้นด้วยกล้องจุลทรรศน์นี้ได้รับการตีพิมพ์ในวารสาร Science ในปี 1967 โดยมี M. David Egger จากมหาวิทยาลัยเยลและ Petráň เป็นผู้เขียน ^{[ 27 ]}ในเชิงอรรถของบทความนี้ระบุว่า Petráň เป็นผู้ออกแบบกล้องจุลทรรศน์และควบคุมการสร้าง และเขายังเป็น "นักวิจัยร่วม" ที่เยลด้วย สิ่งพิมพ์ฉบับที่สองจากปี 1968 อธิบายทฤษฎีและรายละเอียดทางเทคนิคของเครื่องมือนี้ โดยมี Hadravský และRobert Galambosหัวหน้ากลุ่มที่เยล เป็นผู้เขียนร่วมเพิ่มเติม^{[ 28 ]}ในปี 1970 สิทธิบัตรของสหรัฐอเมริกาได้รับการอนุมัติ โดยยื่นขอในปี 1967 ^{[ 29 ]}

ในปี พ.ศ. 2512 และ พ.ศ. 2514 M. David Egger และ Paul Davidovits จากมหาวิทยาลัยเยลได้ตีพิมพ์เอกสารสองฉบับที่อธิบายถึง กล้องจุลทรรศน์ เลเซอร์สแกน แบบคอนโฟกัลตัวแรก ^{[ 30 ] [ 31 ]}เป็นเครื่องสแกนแบบจุด หมายความว่ามีการสร้างจุดส่องสว่างเพียงจุดเดียว โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสะท้อนแสงแบบเอพิโฟกัลสำหรับการสังเกตเนื้อเยื่อประสาท เลเซอร์ฮีเลียม-นีออน 5 มิลลิวัตต์ที่มีแสง 633 นาโนเมตรถูกสะท้อนโดยกระจกโปร่งแสงไปยังเลนส์วัตถุ เลนส์วัตถุเป็นเลนส์ธรรมดาที่มีความยาวโฟกัส 8.5 มิลลิเมตร แตกต่างจากระบบก่อนหน้าและระบบส่วนใหญ่ในภายหลัง การสแกนตัวอย่างทำได้โดยการเคลื่อนที่ของเลนส์นี้ (การสแกนเลนส์วัตถุ) ซึ่งนำไปสู่การเคลื่อนที่ของจุดโฟกัส แสงสะท้อนกลับมายังกระจกโปร่งแสง ส่วนที่ส่งผ่านจะถูกโฟกัสโดยเลนส์อีกตัวหนึ่งบนรูตรวจจับซึ่งมีหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์อยู่ด้านหลัง สัญญาณจะถูกแสดงภาพโดยจอ CRTของออสซิลโลสโคป โดยลำแสงแคโทดจะเคลื่อนที่ไปพร้อมกับเลนส์วัตถุ อุปกรณ์พิเศษชิ้นหนึ่งช่วยให้สามารถถ่ายภาพแบบโพลารอยด์ ได้ ซึ่งภาพสามภาพนั้นได้ถูกนำมาแสดงไว้ในหนังสือที่ตีพิมพ์เมื่อปี 1971

ผู้เขียนคาดการณ์เกี่ยวกับสีย้อมเรืองแสงสำหรับ การตรวจสอบ ในร่างกายพวกเขาอ้างถึงสิทธิบัตรของ Minsky ขอบคุณ Steve Baer ซึ่งในขณะนั้นเป็นนักศึกษาปริญญาเอกที่Albert Einstein School of Medicineในนิวยอร์กซิตี้ซึ่งเขาได้พัฒนากล้องจุลทรรศน์แบบสแกนเส้นคอนโฟคอล^{[ 32 ]}สำหรับการแนะนำให้ใช้เลเซอร์กับ 'กล้องจุลทรรศน์ของ Minsky' และขอบคุณ Galambos, Hadravsky และ Petráň สำหรับการสนทนาที่นำไปสู่การพัฒนากล้องจุลทรรศน์ของพวกเขา แรงจูงใจในการพัฒนาของพวกเขาคือในกล้องจุลทรรศน์แบบสแกนคู่ มีเพียงเศษส่วนของแสงส่องสว่าง 10 ⁻⁷ เท่านั้น ที่มีส่วนร่วมในการสร้างภาพในช่องมองภาพ ดังนั้นคุณภาพของภาพจึงไม่เพียงพอสำหรับการตรวจสอบทางชีววิทยาเป็นส่วนใหญ่^{[ 21 ] [ 33 ]}

ในปี พ.ศ. 2520 Colin JR SheppardและAmarjyoti ChoudhuryจากOxfordสหราชอาณาจักร ได้ตีพิมพ์บทวิเคราะห์เชิงทฤษฎีของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลและแบบสแกนด้วยเลเซอร์^{[ 34 ]}ซึ่งน่าจะเป็นสิ่งพิมพ์แรกที่ใช้คำว่า "กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล" ^{[ 21 ] [ 33 ]}

ในปี พ.ศ. 2521 พี่น้องChristoph CremerและThomas Cremerได้ตีพิมพ์การออกแบบกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนแบบคอนโฟกัลโดยใช้การกระตุ้นด้วยฟลูออเรสเซนต์พร้อมระบบโฟกัสอัตโนมัติแบบอิเล็กทรอนิกส์ พวกเขายังแนะนำการส่องสว่างจุดเลเซอร์โดยใช้ " โฮโลแกรม 4π จุด " ^{[ 33 ] [ 35 ]}การออกแบบ CLSM นี้ได้รวมวิธีการสแกนเลเซอร์เข้ากับการตรวจจับวัตถุชีวภาพแบบ 3 มิติที่ติดฉลากด้วยเครื่องหมายฟลูออเรสเซนต์เป็นครั้งแรก

ในปี พ.ศ. 2521 และ พ.ศ. 2523 กลุ่มอ็อกซ์ฟอร์ดที่นำโดย Colin Sheppard และTony Wilsonได้อธิบายกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลที่มีการส่องสว่างด้วยเลเซอร์เอพิ การสแกนแท่นวาง และหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์เป็นตัวตรวจจับ แท่นวางสามารถเคลื่อนที่ไปตามแกนแสง (แกน z) ทำให้สามารถตัดส่วนอนุกรมแสงได้^{[ 33 ]}

ในปี พ.ศ. 2522 เฟรด เบรกเคนฮอฟและเพื่อนร่วมงานได้แสดงให้เห็นว่าข้อได้เปรียบทางทฤษฎีของการตัดภาพด้วยแสงและการปรับปรุงความละเอียดนั้นสามารถทำได้จริงในทางปฏิบัติ ในปี พ.ศ. 2528 กลุ่มนี้เป็นกลุ่มแรกที่ตีพิมพ์ภาพที่น่าเชื่อถือซึ่งถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลที่สามารถตอบคำถามทางชีววิทยาได้^{[ 36 ]}หลังจากนั้นไม่นาน กลุ่มอื่นๆ อีกมากมายก็เริ่มใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเพื่อตอบคำถามทางวิทยาศาสตร์ที่ก่อนหน้านี้ยังคงเป็นปริศนาเนื่องจากข้อจำกัดทางเทคโนโลยี

ในปี พ.ศ. 2526 IJ Cox และ C. Sheppard จาก Oxford ได้ตีพิมพ์ผลงานชิ้นแรกที่ควบคุมกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลด้วยคอมพิวเตอร์ กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนเชิงพาณิชย์เครื่องแรก รุ่น stage-scanner SOM-25 ได้รับการนำเสนอโดย Oxford Optoelectronics (หลังจากถูกซื้อกิจการโดย BioRad) เริ่มตั้งแต่ปี พ.ศ. 2525 โดยมีพื้นฐานมาจากการออกแบบของกลุ่ม Oxford ^{[ 22 ] [ 37 ]}

ในช่วงกลางทศวรรษ 1980 William Bradshaw AmosและJohn Graham Whiteและเพื่อนร่วมงานที่ทำงานในห้องปฏิบัติการชีววิทยาโมเลกุลในเคมบริดจ์ได้สร้างกล้องจุลทรรศน์แบบสแกนลำแสงคอนโฟคอลเครื่องแรก^{[ 38 ] [ 39 ]}แท่นวางตัวอย่างไม่ได้เคลื่อนที่ แต่จุดส่องสว่างต่างหากที่เคลื่อนที่ ทำให้สามารถบันทึกภาพได้เร็วขึ้น: สี่ภาพต่อวินาที โดยแต่ละภาพมี 512 เส้น ภาพกลางที่ขยายใหญ่ขึ้นอย่างมากเนื่องจากเส้นทางลำแสงยาว 1–2 เมตร ทำให้สามารถใช้ไดอะแฟรมแบบม่านตา แบบธรรมดา เป็น 'รูเข็ม' ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1 มม. ภาพจุลทรรศน์แรกๆ ถ่ายด้วยการเปิดรับแสงเป็นเวลานานบนฟิล์มก่อนที่จะมีการเพิ่มกล้องดิจิทัล การปรับปรุงเพิ่มเติมทำให้สามารถซูมเข้าไปในตัวอย่างได้เป็นครั้งแรกZeiss , LeitzและCambridge Instrumentsไม่สนใจที่จะผลิตในเชิงพาณิชย์^{[ 40 ]} ในที่สุด สภา วิจัยทางการแพทย์ (MRC) ก็ให้การสนับสนุนการพัฒนาต้นแบบ การออกแบบนี้ถูกซื้อโดยBio-Rad ปรับปรุงด้วยการควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์และวางจำหน่ายในเชิง พาณิชย์ในชื่อ 'MRC 500' MRC 600 ซึ่งเป็นรุ่นต่อมา ได้กลายเป็นพื้นฐานสำหรับการพัฒนากล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสองโฟตอน ตัวแรก ที่พัฒนาขึ้นในปี 1990 ที่มหาวิทยาลัยคอร์เนลล์^{[ 36 ]}

การพัฒนาที่สถาบันเทคโนโลยีหลวง KTHในสตอกโฮล์มในช่วงเวลาเดียวกันนำไปสู่ ​​CLSM เชิงพาณิชย์ที่จัดจำหน่ายโดยบริษัท Sarastro ของสวีเดน^{[ 41 ]}กิจการนี้ถูกซื้อกิจการโดย Molecular Dynamics ในปี 1990 ^{[ 42 ]}แต่ในที่สุด CLSM ก็ถูกยกเลิก ในเยอรมนีHeidelberg Instrumentsซึ่งก่อตั้งขึ้นในปี 1984 ได้พัฒนา CLSM ซึ่งในตอนแรกมีจุดประสงค์เพื่อการใช้งานในอุตสาหกรรมมากกว่าชีววิทยา เครื่องมือนี้ถูกซื้อกิจการโดยLeica Lasertechnik ในปี 1990 Zeiss มีกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนแบบจุดบินที่ไม่ใช่คอนโฟคอลวางจำหน่ายในตลาดอยู่แล้ว ซึ่งได้รับการอัพเกรดเป็นคอนโฟคอล รายงานจากปี 1990 ^{[ 43 ]}กล่าวถึงผู้ผลิตคอนโฟคอลบางราย ได้แก่ Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern และ Zeiss ^{[ 36 ]}

ในปี พ.ศ. 2532 Fritz Karl Preikschatร่วมกับ Ekhard Preikschat บุตรชาย ได้คิดค้น กล้องจุลทรรศน์ เลเซอร์ไดโอด แบบสแกน สำหรับการวิเคราะห์ขนาดอนุภาค^{[ 44 ] [ 45 ]}และร่วมก่อตั้ง Lasentec เพื่อทำการตลาด ในปี พ.ศ. 2544 Lasentec ถูกซื้อกิจการโดยMettler Toledo [ ^{46 ] โดย}ส่วนใหญ่ใช้ในอุตสาหกรรมยาเพื่อควบคุมกระบวนการตกผลึกในระบบการทำให้บริสุทธิ์ขนาดใหญ่แบบในสถานที่

ในเครื่องมือคอนโฟกัลมาตรฐาน รูรับแสงที่สองหรือ "รูรับแสงขาออก" จะถูกใช้เพื่อกรองแสงที่ปล่อยออกมาหรือแสงที่กระเจิง โดยทั่วไปแล้ว รูรับแสงนี้เป็นส่วนประกอบแบบพาสซีฟที่ปิดกั้นแสงเพื่อกรองแสงสว่างด้วยวิธีการทางแสง อย่างไรก็ตาม การออกแบบใหม่ๆ ได้พยายามทำการกรองนี้ด้วยวิธีการทางดิจิทัล

แนวทางล่าสุดได้แทนที่รูเข็มแบบพาสซีฟด้วยองค์ประกอบตรวจจับแบบผสม โดยทั่วไปแล้ว หลังจากการประมวลผลแบบดิจิทัล แนวทางนี้จะนำไปสู่ความละเอียดและงบประมาณโฟตอนที่ดีขึ้น เนื่องจากขีดจำกัดความละเอียดสามารถเข้าใกล้ความละเอียดของรูเข็มที่เล็กมากจนไม่มีที่สิ้นสุดได้^{[ 47 ]}

นักวิจัยคนอื่นๆ ได้พยายามปรับโฟกัสแสงจากแหล่งกำเนิดการกระตุ้นจุดโดยใช้เครือข่ายประสาทแบบคอนโวลูชันเชิงลึก^{[ 48 ]}

• กล้องจุลทรรศน์กระตุ้นด้วยโฟตอนสองตัว^{[ 49 ]}

วิกิมีเดียคอมมอนส์มีสื่อที่เกี่ยวข้องกับกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล

• CLSM เสมือน (แบบใช้ภาษา Java)
• ภาพเคลื่อนไหวและคำอธิบายเกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์ประเภทต่างๆ รวมถึงกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์และกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (มหาวิทยาลัยปารีสใต้)
• ชิ้นส่วนต่างๆจำเป็นต้องรู้