กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแช่แข็ง
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอเจนิก ( cryo-EM ) เป็น เทคนิค กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านที่ใช้กับตัวอย่างที่เย็นลงจนถึง อุณหภูมิ ไครโอเจนิกพัฒนาขึ้นในช่วงทศวรรษ 1970 ความก้าวหน้าในเทคโนโลยีตัวตรวจจับและซอฟต์แวร์ทำให้สามารถถ่ายภาพโครงสร้างชีวโมเลกุลได้ที่ความละเอียดใกล้เคียงระดับอะตอม[ 1 ]วิธีการนี้กลายเป็นทางเลือกยอดนิยมแทนการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์หรือสเปกโทรสโกปี NMRในชีววิทยาโครงสร้าง[ 2 ]
เมื่อทำการสแกนตัวอย่างทางชีวภาพ โครงสร้างของตัวอย่างจะถูกรักษาไว้โดยการฝังตัวอย่างลงในน้ำแข็งใส สารละลาย ตัวอย่าง ในน้ำจะถูกนำไปใช้กับตะแกรงตาข่ายและแช่แข็งอย่างรวดเร็วในอีเทน เหลว หรือส่วนผสมของอีเทนเหลวและโพรเพน[ 3 ]
รางวัลโนเบลสาขาเคมีประจำปี 2017 มอบให้แก่Jacques Dubochet , Joachim FrankและRichard Henderson "สำหรับการพัฒนากล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอเพื่อการกำหนดโครงสร้างความละเอียดสูงของโมเลกุลชีวภาพในสารละลาย" [ 4 ] Nature Methodsยังตั้งชื่อ cryo-EM ว่าเป็น "วิธีการแห่งปี" ในปี 2015 อีกด้วย[ 5 ]
ประวัติศาสตร์
พัฒนาการในระยะเริ่มต้น
ในช่วงทศวรรษ 1960 การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านในการตรวจสอบตัวอย่างทางชีวภาพมีข้อจำกัดเนื่องจากความเสียหายจากรังสีที่เกิดจากลำแสงอิเล็กตรอนพลังงานสูง นักวิทยาศาสตร์ตั้งสมมติฐานว่าการตรวจสอบตัวอย่างที่อุณหภูมิต่ำจะช่วยลดความเสียหายจากรังสีที่เกิดจากลำแสงได้[ 6 ]ทั้งฮีเลียมเหลว (−269 °Cหรือ 4 Kหรือ −452 °F ) และไนโตรเจนเหลว (−195.79 °C หรือ 77 K หรือ −320 °F) ถูกพิจารณาว่าเป็นสารทำความเย็น[ 7 ]อย่างไรก็ตาม ไม่เคยบรรลุความเสถียรสูงได้ ในปี 1980 Erwin KnapekและJacques Dubochetได้ตีพิมพ์ความคิดเห็นเกี่ยวกับความเสียหายจากลำแสงที่อุณหภูมิต่ำมาก โดยได้แบ่งปันข้อสังเกตว่า:
พบว่าผลึกบางที่ติดอยู่บนฟิล์มคาร์บอนมีความต้านทานต่อลำแสงมากกว่าที่อุณหภูมิ 4 K ถึง 300 เท่า เมื่อเทียบกับที่อุณหภูมิห้อง... ผลลัพธ์ส่วนใหญ่ของเราสามารถอธิบายได้โดยการสันนิษฐานว่าการป้องกันความเย็นในบริเวณ 4 K ขึ้นอยู่กับอุณหภูมิอย่างมาก[ 8 ]
อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์เหล่านี้ไม่ได้ถูกทำซ้ำ การแก้ไขได้รับการตีพิมพ์สองปีต่อมา[ 9 ]พร้อมกับบทวิจารณ์ในNature [ 10 ]ซึ่งระบุว่าความต้านทานของลำแสงมีความสำคัญน้อยกว่าที่คาดไว้ การป้องกันที่ได้รับที่ 4 K นั้น ใกล้เคียงกับ "สิบเท่าสำหรับตัวอย่างมาตรฐานของ L- valine " มากกว่าที่เคยระบุไว้ก่อนหน้านี้[ 10 ]ในขณะที่ตัวอย่าง cryo-EM จะถูกเก็บรวบรวมที่อุณหภูมิไนโตรเจนเหลวเป็นประจำ[ 11 ]งานวิจัยยังคงดำเนินต่อไปเพื่อทำความเข้าใจพฤติกรรมของตัวอย่างที่อุณหภูมิฮีเลียมเหลว[ 12 ] [ 13 ] [ 11 ]
ในปี 1981 นักวิทยาศาสตร์ที่ห้องปฏิบัติการชีววิทยาโมเลกุลแห่งยุโรปได้รายงานความสำเร็จครั้งแรกของ cryo-EM [ 14 ]นักวิจัยได้ฉีดน้ำบริสุทธิ์ลงบนฟิล์มคาร์บอนที่ชอบน้ำซึ่งถูกจุ่มลงในไครโอเจนอย่างรวดเร็ว (โพรเพนเหลวหรืออีเทนเหลวที่เย็นลงถึง 77 K) ชั้นน้ำแข็งอสัณฐาน บางๆ ที่เกิดขึ้นบนฟิล์มมี ความหนาน้อยกว่า 1 μm และ รูปแบบ การเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนยืนยันการมีอยู่ของน้ำแข็งอสัณฐาน/น้ำแข็งใส ในปี 1984 กลุ่มได้แสดงให้เห็นถึงศักยภาพของ cryo-EM ในชีววิทยาโครงสร้างโดยการวิเคราะห์อะดีโนไวรัสชนิดที่ 2 ที่ถูกทำให้เป็นแก้วแบคทีริโอเฟจ T4ไวรัสSemliki Forestแบคทีริโอเฟจ CbKและไวรัสVesicular-Stomatitis [ 15 ]บทความนี้ถือเป็นจุดเริ่มต้นของ Cryo-EM และเทคนิคนี้ได้กลายเป็นเรื่องปกติในห้องปฏิบัติการทั่วโลก
พลังงานของอิเล็กตรอนที่ใช้ในการสร้างภาพ (80–300 kV) สามารถทำลายพันธะโควาเลนต์ในตัวอย่างอินทรีย์และชีวภาพได้[ 16 ]การสร้างภาพตัวอย่างชีวภาพจำเป็นต้องลดการสัมผัสกับอิเล็กตรอนให้น้อยที่สุด การสัมผัสกับอิเล็กตรอนในปริมาณต่ำจำเป็นต้องเลือก จัดเรียง และหาค่าเฉลี่ยของภาพโมเลกุลแช่แข็งหลายพันหรือหลายล้านโมเลกุลเพื่อให้ได้แผนที่ที่มีความละเอียดสูง โดยใช้ซอฟต์แวร์เฉพาะทาง การเปิดตัวเครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรงและอัลกอริทึมการคำนวณที่ดีขึ้นในปี 2012 ได้ปรับปรุงคุณลักษณะโครงสร้างอย่างมีนัยสำคัญ[ 17 ]
ความก้าวหน้าล่าสุด
เครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรงและอัลกอริธึมการสร้างภาพที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นทำให้สามารถกำหนดโครงสร้างโมเลกุลขนาดใหญ่ได้ที่ความละเอียดใกล้เคียงระดับอะตอม[ 18 ]โมเลกุลขนาดใหญ่ที่ถ่ายภาพได้ ได้แก่ไวรัสไรโบ โซม ไม โตคอนเดรียช่องไอออนและเอนไซม์คอมเพล็กซ์ ตั้งแต่ปี 2018 Cryo-EM สามารถนำไปใช้กับโครงสร้างที่มีขนาดเล็กเท่าฮีโมโกลบิน (64 kDa ) [ 19 ] ด้วยความละเอียด สูงถึง 1.8 Å [ 20 ]ในปี 2019 โครงสร้าง Cryo-EM เพิ่มขึ้นเป็น 2.5% ของโครงสร้างที่ฝากไว้ในProtein Data Bank [ 21 ] [ 22 ] Cryo -EM สามารถใช้สำหรับCryo-electron tomography (cryo-ET) ซึ่งสร้างการสร้างภาพ 3 มิติของตัวอย่างจากภาพ 2 มิติที่เอียง
ทศวรรษ 2010 ได้เห็นความก้าวหน้าอย่างมากของกล้องอิเล็กตรอน รวมถึงตัวตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรง ทำให้เกิด "การปฏิวัติความละเอียด" [ 23 ]ผลักดันขีดจำกัดความละเอียดให้ต่ำกว่า ขีดจำกัดที่สำคัญ ~2-3 Å เพื่อแยกตำแหน่งและทิศทางของกรดอะมิโน[ 24 ]
Richard Henderson ( ห้องปฏิบัติการชีววิทยาโมเลกุล MRC , เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร) ได้จัดตั้งกลุ่มความร่วมมือกับวิศวกรที่ห้องปฏิบัติการ Rutherford Appletonและนักวิทยาศาสตร์ที่สมาคม Max Planckเพื่อระดมทุนและพัฒนาต้นแบบแรก จากนั้นกลุ่มความร่วมมือได้ร่วมมือกับผู้ผลิตกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนFEIเพื่อเปิดตัวและทำการตลาดการออกแบบใหม่ ในเวลาเดียวกันนั้น Gatan Inc. แห่ง Pleasanton รัฐแคลิฟอร์เนีย ได้ออกเครื่องตรวจจับที่คล้ายกันซึ่งออกแบบโดย Peter Denes ( ห้องปฏิบัติการแห่งชาติ Lawrence Berkeley ) และDavid Agard ( มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย ซานฟรานซิสโก ) กล้องประเภทที่สามได้รับการพัฒนาโดยNguyen-Huu Xuongที่บริษัท Direct Electron ( ซานดิเอโก รัฐแคลิฟอร์เนีย ) [ 23 ]
ความก้าวหน้าล่าสุดในโครงสร้างการสร้างภาพโดยใช้โปรตีนช่วยลดอคติในการวางแนวตัวอย่างและข้อจำกัดด้านขนาด แม้ว่าขนาดขั้นต่ำสำหรับ Cryo-EM ยังไม่ได้รับการกำหนด แต่ โดยทั่วไป โปรตีนที่มีขนาดเล็กกว่า ~50 kDa จะมี อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน (SNR) ต่ำเกินไปที่จะแยกแยะอนุภาคโปรตีน ทำให้การสร้างภาพ 3 มิติทำได้ยากหรือเป็นไปไม่ได้[ 25 ] [ 26 ]มีการรายงานเทคนิคหลายอย่างเพื่อปรับปรุง SNR เมื่อกำหนดโครงสร้างของโปรตีนขนาดเล็ก[ 27 ] [ 28 ]โดยอาศัยDARPinsที่ มีความสัมพันธ์สูง นาโนบอดีชิ้นส่วนแอนติบอดี[ 29 ]วิธีการเหล่านี้จะจับกับโปรตีนเป้าหมายอย่างแน่นหนา จึงเพิ่มขนาดอนุภาคที่มีประสิทธิภาพและนำความสมมาตรมาใช้เพื่อปรับปรุง SNR สำหรับการสร้างแผนที่ Cryo-EM ข้อดีของ Cryo-EM เหนือการตกผลึกคือต้องการวัสดุตัวอย่างน้อยกว่ามาก ทำให้ง่ายต่อการกำหนดโครงสร้างของโปรตีนที่ไม่สามารถแยกได้ด้วยผลผลิตสูง
รางวัลโนเบลสาขาเคมี ประจำปี 2017
เพื่อเป็นการยกย่องผลกระทบที่ cryo-EM มีต่อชีวเคมี นักวิทยาศาสตร์สามคน ได้แก่ Jacques Dubochet, Joachim Frank และ Richard Henderson ได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมี "สำหรับการพัฒนากล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอเพื่อการกำหนดโครงสร้างที่มีความละเอียดสูงของโมเลกุลชีวภาพในสารละลาย" [ 4 ]
เทคนิค
โหมดของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านความเย็นยิ่งยวด
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านความเย็นยิ่งยวด (Cryo-TEM) เป็นรูปแบบหนึ่งของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านซึ่งตัวอย่างจะถูกทำให้เย็นลงถึง -196 องศาเซลเซียส เพื่อรักษาสภาพโครงสร้างดั้งเดิมของสารประกอบ ทำให้สามารถวิเคราะห์โครงสร้างโปรตีนในระดับใกล้เคียงอะตอมได้[ 30 ]โดยทั่วไป คำว่า "กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอเจนิก" หรือคำย่อว่า "cryo-EM" หมายถึงกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านความเย็นยิ่งยวดโดยปริยาย เนื่องจาก cryo-EM ส่วนใหญ่ทำในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน มากกว่ากล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน[ 31 ]
ความสัมพันธ์ระหว่างแสงและไครโอ-TEM และไครโอ-ET
ในปี 2019 มีการใช้ cryo-TEM และ cryo-ET ร่วมกันเพื่อสังเกตท่อนาโนอุโมงค์ (TNTs) ในเซลล์ประสาท[ 32 ]
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนแช่แข็ง
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนแช่แข็ง (cryoSEM) เป็น เทคนิค กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนตัวอย่างจะถูกแช่แข็งโดยใช้ไนโตรเจนเหลวหรืออีเทนเหลว เพื่อลดความเสียหายต่อตัวอย่างที่เกิดจากการก่อตัวของผลึกน้ำแข็งและปรากฏการณ์ Leidenfrostและเพิ่มการกักเก็บน้ำให้สูงสุด ตัวอย่างจะถูกเก็บไว้ในสุญญากาศหรือก๊าซเฉื่อยเพื่อป้องกันการก่อตัวของผลึกอย่างรวดเร็วที่เกิดจากการสัมผัสกับบรรยากาศ ตัวอย่างสามารถแตกได้ในขั้นตอนนี้และระเหยกลายเป็นไอเพื่อให้สามารถสแกนโครงสร้างภายในได้ เนื่องจากตัวอย่างแช่แข็งไม่นำไฟฟ้า ตัวอย่างจึงมักถูกเคลือบด้วยชั้นโลหะนำไฟฟ้าบาง ๆ เพื่อลดความเสียหายจากลำแสงและปรับปรุงความละเอียดของภาพ จากนั้นตัวอย่างจะถูกวางไว้ภายในเครื่อง SEM เพื่อทำการสแกน[ 33 ]
เทคนิคการใช้งานและการวิเคราะห์ข้อมูล
การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง
ในการถ่ายภาพอิเล็กตรอนไครโอโทโมกราฟี (cryo-ET) จะมีการถ่ายภาพตัวอย่างหลายภาพจากมุมต่างๆ โดยใช้กลไกการเอียง ภาพเหล่านี้จะถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อสร้างแบบจำลอง 3 มิติ (แผนที่) ที่ มีความละเอียดประมาณ 1–4 นาโนเมตร[ 34 ]
การวิเคราะห์อนุภาคเดี่ยว
การวิเคราะห์อนุภาคเดี่ยว (SPA) เป็นวิธีการทั่วไปที่ใช้เพื่อให้ได้ แบบจำลองโมเลกุลชีวภาพที่มีความละเอียดใกล้ระดับอะตอม (<1 นาโนเมตร) ใน SPA จะมีการค้นหาสำเนาของโมเลกุลเป้าหมายจากภาพ cryo-EM จำนวนมาก สำเนาเหล่านี้จะถูกจัดเรียงเป็น "คลาส" ซึ่งเป็นการจัดกลุ่มตามทิศทางของอนุภาค จากนั้นแต่ละคลาสและอนุภาคในคลาสเหล่านั้นจะถูกกำหนดตำแหน่งสัมพัทธ์ต่อกันในโมเลกุลดั้งเดิม โปรแกรมที่ใช้ในกระบวนการนี้ได้แก่ RELION [ 35 ]หรือ CryoSPARC [ 36 ]นวัตกรรมหลักเมื่อเทียบกับ cryo-ET คือการรวมภาพจากวัตถุที่คล้ายกันเพื่อให้ได้ความละเอียดสูงขึ้น[ 37 ]
เมื่อรวมกับความรู้เกี่ยวกับความก้าวหน้าของเวลา ผลลัพธ์ที่ได้คือ cryo-TEM ที่สามารถบันทึกจลนศาสตร์ของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในโมเลกุลชีวภาพได้[ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]
การเปรียบเทียบกับผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์
ตามธรรมเนียมแล้ว การตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์เป็นเทคนิคที่ได้รับความนิยมมากที่สุดในการกำหนดโครงสร้างสามมิติของโมเลกุลทางชีวภาพ[ 41 ]อย่างไรก็ตาม การปรับปรุงดังกล่าวใน cryo-EM ได้เพิ่มความนิยมในฐานะเครื่องมือสำหรับการตรวจสอบรายละเอียดของโมเลกุลทางชีวภาพ ตั้งแต่ปี 2010 เป็นต้นมา การฝากโครงสร้าง cryo-EM รายปีได้แซงหน้าการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์[ 42 ]แม้ว่าการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์จะมีจำนวนการฝากรวมมากกว่าอย่างมากเนื่องจากมีประวัติยาวนานกว่าหลายทศวรรษ แต่คาดการณ์ว่าจำนวนการฝากรวมของทั้งสองวิธีจะแซงหน้ากันประมาณปี 2035 [ 42 ]
ความละเอียดของการวิเคราะห์ผลึกด้วยรังสีเอกซ์ถูกจำกัดด้วยความสม่ำเสมอของผลึก[ 43 ]และการชักนำโมเลกุลทางชีวภาพที่มีเงื่อนไขการตกผลึกที่เหมาะสมซึ่งไม่ทราบแน่ชัดให้เข้าสู่สถานะผลึกอาจใช้เวลานานมาก ในกรณีที่รุนแรงอาจใช้เวลาหลายเดือนหรือหลายปี[ 44 ]ในทางตรงกันข้าม การเตรียมตัวอย่างใน cryo-EM อาจต้องมีการคัดกรองและปรับให้เหมาะสมหลายรอบเพื่อเอาชนะปัญหาต่างๆ เช่น การรวมตัวของโปรตีนและการวางแนวที่ต้องการ[ 45 ] [ 46 ]แต่ไม่จำเป็นต้องให้ตัวอย่างเกิดเป็นผลึก แต่ตัวอย่างสำหรับ cryo-EM จะถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วและตรวจสอบในสถานะใกล้เคียงกับสภาพดั้งเดิม[ 47 ]
ตามข้อมูลจากProteopedia ความ ละเอียดเฉลี่ยที่ได้จากการวิเคราะห์โครงสร้างผลึกด้วยรังสีเอกซ์ (ณ วันที่ 19 พฤษภาคม 2019) บนProtein Data Bankคือ 2.05 Å [ 43 ]และความละเอียดสูงสุดที่บันทึกไว้ (ณ วันที่ 30 กันยายน 2022) คือ 0.48 Å [ 48 ]ณ ปี 2020 โครงสร้างโปรตีนส่วนใหญ่ที่กำหนดโดย cryo-EM ( การวิเคราะห์อนุภาคเดี่ยว ) มีความละเอียดต่ำกว่าที่ 3–4 Å [ 49 ] อย่างไรก็ตาม ณ ปี 2020 ความละเอียดที่ดีที่สุดของ cryo-EM ได้รับการบันทึกไว้ที่ 1.22 Å [ 46 ]ทำให้เป็นคู่แข่งในด้านความละเอียดในบางกรณี
ผลึกศาสตร์อิเล็กตรอน
เช่นเดียวกับการใช้รังสีเอกซ์ในการกำหนดโครงสร้างผลึกของโมเลกุลที่มีขนาดแตกต่างกัน (ตั้งแต่โมเลกุลขนาดเล็กไปจนถึงสารประกอบชีวโมเลกุลขนาดใหญ่) โดยใช้รูปแบบการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ อิเล็กตรอนก็สามารถสร้างรูป แบบ การเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนจากผลึกได้เช่นกัน งานในด้านนี้มีประวัติ ยาวนาน ย้อนกลับไปถึงงานในยุคแรกๆ เช่น การกำหนดตำแหน่งของอะตอมไฮโดรเจนในผลึก NH Cl โดย WE Laschkarew และ ID Usykin ในปี 1933 [ 50 ]
โดยทั่วไปแล้ว Cryo-EC จะใช้กับผลึกสามมิติ แต่ก็มีการนำไปใช้ในการวิเคราะห์ผลึกสองมิติ และการวิเคราะห์เส้นใยหรือท่อเกลียวด้วยเช่นกัน
การเลี้ยวเบนอิเล็กตรอนของไมโครคริสตัล (MicroED) เป็นวิธีการหนึ่งของผลึกศาสตร์อิเล็กตรอนที่ทำงานกับผลึกที่มีขนาดเล็กกว่าที่การเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์ต้องการถึงพันล้านเท่า มีการนำไปใช้เพื่อกำหนดโครงสร้างของโมเลกุลชีวภาพขนาดใหญ่ (โปรตีน กรดนิวคลีอิก และสารประกอบของพวกมัน) [ 51 ]นอกจากนี้ยังเป็นประโยชน์อย่างมากในการศึกษาโมเลกุลขนาดเล็ก ตั้งแต่เปปไทด์ไปจนถึงสารประกอบที่เรียบง่ายกว่า[ 52 ]
การจัดการตัวอย่างสำหรับการถ่ายภาพ
(ส่วนนี้ไม่เกี่ยวข้องกับผลึกศาสตร์อิเล็กตรอน)
ตัวอย่างทางชีววิทยา
ฟิล์มบาง
วัสดุชีวภาพจะถูกกระจายบนแผ่นกริดสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน และเก็บรักษาไว้ในสภาวะแช่แข็งแบบไฮเดรตโดยการแช่แข็งอย่างรวดเร็ว โดยปกติจะใช้เอทาน เหลวที่อุณหภูมิ ใกล้เคียงกับ อุณหภูมิ ของไนโตรเจนเหลวการรักษาสภาพของตัวอย่างที่อุณหภูมิของไนโตรเจนเหลวหรือต่ำกว่านั้น จะช่วยให้สามารถนำตัวอย่างเข้าสู่สุญญากาศ สูง ของ คอลัมน์ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนได้ ตัวอย่างชีวภาพส่วนใหญ่มีความไวต่อรังสี สูงมาก ดังนั้นจึงต้องใช้เทคนิคการถ่ายภาพด้วยปริมาณรังสีต่ำ (ซึ่งเป็นประโยชน์อย่างยิ่งที่อุณหภูมิต่ำของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านความเย็นจัด จะช่วยป้องกันความเสียหายจากรังสีได้อีกทางหนึ่ง)
ดังนั้น ภาพจึงมีสัญญาณรบกวน สูงมาก สำหรับระบบชีวภาพบางระบบ สามารถนำภาพมาเฉลี่ยเพื่อเพิ่มอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนและดึงข้อมูลความละเอียดสูงเกี่ยวกับตัวอย่างได้โดยใช้เทคนิคที่เรียกว่าการวิเคราะห์อนุภาคเดี่ยววิธีการนี้โดยทั่วไปต้องการให้สิ่งที่นำมาเฉลี่ยเหมือนกัน แม้ว่าในปัจจุบันจะสามารถศึกษาความแตกต่างทางโครงสร้างในระดับจำกัดได้แล้ว (เช่น ไรโบโซม ) การสร้างภาพสามมิติจากภาพ CryoTEM ของโปรตีนเชิงซ้อนและไวรัสได้รับการแก้ไขที่ความละเอียดระดับต่ำกว่านาโนเมตรหรือใกล้เคียงระดับอะตอม ทำให้เกิดข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับโครงสร้างและชีววิทยาของกลุ่มก้อนขนาดใหญ่เหล่านี้
การวิเคราะห์โครงสร้างโปรตีนที่เป็นระเบียบ เช่นผลึก สองมิติ ของโปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์หรือ โครงสร้าง เกลียวของโปรตีน ยังช่วยให้สามารถหาค่าเฉลี่ยซึ่งให้ข้อมูลที่มีความละเอียดสูงเกี่ยวกับตัวอย่างได้ เทคนิคนี้เรียกว่า ผลึก ศาสตร์อิเล็กตรอน
ส่วนแก้วตา
วิธีการใช้ฟิล์มบางมีข้อจำกัดในการใช้กับชิ้นงานบาง (โดยทั่วไป < 500 นาโนเมตร) เนื่องจากอิเล็กตรอนไม่สามารถทะลุผ่านชิ้นงานที่หนากว่าได้โดยไม่เกิดการกระเจิงหลายครั้ง ชิ้นงานที่หนากว่าสามารถทำให้เป็นแก้วได้โดยการแช่แข็งอย่างรวดเร็ว ( cryofixation ) ในอีเทน (ความหนาได้ถึงหลายสิบไมโครเมตร) หรือที่นิยมใช้กันมากกว่าคือการแช่แข็งด้วยแรงดันสูง (ความหนาได้ถึงหลายร้อยไมโครเมตร) จากนั้นสามารถตัดเป็นชิ้นบางๆ ( หนา 40 ถึง 200 นาโนเมตร) ด้วยมีดเพชรในเครื่องตัดไมโครทอมแบบแช่แข็งที่อุณหภูมิต่ำกว่า −135 °C (อุณหภูมิการเปลี่ยนสภาพเป็นแก้ว) ชิ้นเนื้อที่ตัดแล้วจะถูกรวบรวมบนตะแกรงกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนและถ่ายภาพในลักษณะเดียวกับชิ้นงานที่ทำให้เป็นแก้วในฟิล์มบาง เทคนิคนี้เรียกว่า การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านในสภาวะแช่แข็งของชิ้นเนื้อที่เป็นแก้ว (CEMOVIS) หรือ การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านในสภาวะแช่แข็งของชิ้นเนื้อที่แช่แข็งและมีน้ำอยู่
ตัวอย่างวัสดุ
นอกจากจะช่วยให้สามารถถ่ายภาพตัวอย่างทางชีวภาพที่เป็นแก้วได้แล้ว CryoTEM ยังสามารถใช้ถ่ายภาพตัวอย่างวัสดุที่ระเหยง่ายเกินไปในสุญญากาศจนไม่สามารถถ่ายภาพได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนมาตรฐานที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างเช่น สามารถสกัดส่วนตัดที่เป็นแก้วของส่วนต่อประสานของของเหลวและของแข็งเพื่อวิเคราะห์ด้วย CryoTEM ได้[ 53 ]และกำมะถันซึ่งมีแนวโน้มที่จะระเหิดในสุญญากาศของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน สามารถทำให้เสถียรและถ่ายภาพได้ใน CryoTEM [ 54 ]
การประมวลผลภาพในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-TEM)
แม้ว่าในวิธีการส่วนใหญ่ในการใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนนั้น จะพยายามให้ได้ภาพที่มีความละเอียดสูงสุดของวัสดุ แต่ก็ไม่ใช่เช่นนั้นเสมอไปใน cryo-TEM นอกจากข้อดีทั้งหมดของภาพที่มีความละเอียดสูงแล้ว อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนยังคงเป็นอุปสรรคสำคัญที่ขัดขวางการกำหนดทิศทางให้กับอนุภาคแต่ละตัว ตัวอย่างเช่น ในสารประกอบโมเลกุลขนาดใหญ่ มีโครงสร้างที่แตกต่างกันหลายแบบที่ถูกฉายจาก 3 มิติไปยัง 2 มิติในระหว่างการถ่ายภาพ และหากไม่สามารถแยกแยะได้ ผลลัพธ์ของการประมวลผลภาพจะเบลอ นั่นเป็นเหตุผลว่าทำไมวิธีการเชิงความน่าจะเป็นจึงมีประสิทธิภาพมากขึ้นในการวิจัยประเภทนี้[ 55 ]มีสองวิธีที่เป็นที่นิยมและใช้กันอย่างแพร่หลายในปัจจุบันในการประมวลผลภาพ cryo-EM ได้แก่ วิธีการความน่าจะเป็นสูงสุดที่ค้นพบในปี 1998 [ 56 ]และวิธีการแบบเบย์เซียนที่ปรับใช้เมื่อไม่นานมานี้[ 57 ]
วิธี การประมาณค่าความน่าจะเป็นสูงสุดมาจากสถิติ โดยจะนำทิศทางที่เป็นไปได้ทั้งหมดของอนุภาคมารวมกันเพื่อให้ได้การกระจายความน่าจะเป็น เราสามารถเปรียบเทียบวิธีการนี้กับ การประมาณค่า กำลังสองน้อยที่สุดแบบ ทั่วไป ซึ่งอนุภาคจะมีทิศทางที่แน่นอนต่อภาพ[ 58 ]ด้วยวิธีนี้ อนุภาคในตัวอย่างจะมีทิศทาง "คลุมเครือ" หลังจากการคำนวณ โดยถ่วงน้ำหนักด้วยความน่าจะเป็นที่สอดคล้องกัน กระบวนการทั้งหมดเป็นแบบวนซ้ำ และในแต่ละรอบการวนซ้ำ โมเดลจะดีขึ้นเรื่อยๆ เงื่อนไขที่ดีสำหรับการสร้างแบบจำลองที่แสดงถึงโครงสร้างจริงได้อย่างใกล้เคียงคือเมื่อข้อมูลไม่มีสัญญาณรบกวนมากเกินไป และอนุภาคไม่มีทิศทางที่ต้องการเป็นพิเศษ ข้อเสียหลักของวิธีการประมาณค่าความน่าจะเป็นสูงสุดคือผลลัพธ์ขึ้นอยู่กับการคาดเดาเริ่มต้น และการเพิ่มประสิทธิภาพของแบบจำลองบางครั้งอาจติดอยู่ที่ค่าต่ำสุดเฉพาะที่[ 59 ]
วิธีการแบบเบย์เซียนที่ใช้ใน cryo-TEM ในปัจจุบันนั้นมีลักษณะเชิงประจักษ์ ซึ่งหมายความว่าการกระจายตัวของอนุภาคจะขึ้นอยู่กับชุดข้อมูลดั้งเดิม ในทำนองเดียวกัน ในวิธีการแบบเบย์เซียน ทั่วไป จะมีความน่าจะเป็นล่วงหน้า คง ที่ซึ่งจะเปลี่ยนแปลงไปหลังจากสังเกตข้อมูลแล้ว ความแตกต่างหลักจากการประมาณค่าความน่าจะเป็นสูงสุดอยู่ที่เงื่อนไขการสร้างใหม่แบบพิเศษที่ช่วยในการปรับแผนที่ผลลัพธ์ให้เรียบขึ้นพร้อมทั้งลดสัญญาณรบกวนระหว่างการสร้างใหม่[ 58 ]การปรับแผนที่ให้เรียบขึ้นเกิดขึ้นจากการสมมติว่าความน่าจะเป็นล่วงหน้าเป็นการกระจายแบบเกาส์เซียนและวิเคราะห์ข้อมูลในพื้นที่ฟูริเยร์ เนื่องจากมีการสร้างความเชื่อมโยงระหว่างความรู้ล่วงหน้าและชุดข้อมูลแล้ว จึงมีโอกาสน้อยลงที่จะเกิดข้อผิดพลาดจากปัจจัยมนุษย์ ซึ่งอาจเพิ่มความเป็นกลางของการสร้างภาพ[ 57 ]
ด้วยวิธีการสร้างภาพและการสร้างภาพขึ้นใหม่ด้วย cryo-TEM แบบใหม่ที่เกิดขึ้น จึงมีซอฟต์แวร์โซลูชันใหม่ๆ ที่ช่วยทำให้กระบวนการเป็นไปโดยอัตโนมัติ หลังจากที่วิธีการแบบเบย์เซียนเชิงประจักษ์ได้รับการนำไปใช้ในโปรแกรมคอมพิวเตอร์โอเพนซอร์ส RELION (REgularized LIkelihood OptimizatioN) สำหรับการสร้างภาพ 3 มิติ[ 60 ] [ 61 ]โปรแกรมนี้จึงแพร่หลายในวงการ cryo-TEM โดยมีการแก้ไขหลายอย่างที่ช่วยปรับปรุงความละเอียดของภาพที่สร้างขึ้นใหม่ อนุญาตให้ใช้สคริปต์ที่หลากหลายโดยใช้ ภาษา Pythonและดำเนินการงานทั่วไปของการจำแนกประเภทโมเดล 2 มิติ/3 มิติ หรือการสร้างโมเดลใหม่[ 62 ] [ 63 ]
แกลเลอรี่
- โครงสร้างของแอลกอฮอล์ออกซิเดสจากPichia pastorisโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (Cryo-EM)
ภาพถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (Cryo-EM) ของเซลล์ ARMAN ที่สมบูรณ์จากไบโอฟิล์ม Iron Mountain ความกว้างของภาพคือ 576 นาโนเมตร
ดูเพิ่มเติม
