การตกผลึกโปรตีน
การตกผลึกของโปรตีนเป็นกระบวนการของการก่อตัวของโครงสร้างที่เป็นระเบียบของโมเลกุลโปรตีนแต่ละตัวซึ่งมีเสถียรภาพโดยการสัมผัสของผลึก หากผลึกมีระเบียบเพียงพอ จะสามารถเลี้ยวเบนได้โปรตีนบางชนิดก่อตัวเป็นโครงสร้างผลึกตามธรรมชาติ เช่นอะควาพอรินในเลนส์ตา[ 1 ] [ 2 ]
ในกระบวนการตกผลึกโปรตีน โปรตีนจะถูกละลายในสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำและสารละลายตัวอย่างจนกระทั่งถึงสภาวะอิ่มตัวยิ่งยวด [ 3 ] มีการใช้วิธีการต่างๆ เพื่อให้ได้สภาวะดังกล่าว เช่น การแพร่ของไอ ไมโครแบทช์ ไมโครไดอะไลซิส และการแพร่ของอินเตอร์เฟซอิสระ การพัฒนาผลึกโปรตีนเป็นกระบวนการที่ยากลำบากซึ่งได้รับอิทธิพลจากหลายปัจจัย รวมถึง pH อุณหภูมิความเข้มข้นของไอออนในสารละลายตกผลึก และแม้แต่แรงโน้มถ่วง[ 3 ]เมื่อเกิดขึ้นแล้ว ผลึกเหล่านี้สามารถนำไปใช้ในชีววิทยาโครงสร้างเพื่อศึกษาโครงสร้างโมเลกุลของโปรตีน โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับวัตถุประสงค์ทางอุตสาหกรรมหรือทางการแพทย์ต่างๆ[ 4 ] [ 5 ]
การพัฒนา
นักวิทยาศาสตร์จากทั่วโลกรู้จักการตกผลึกของโมเลกุลโปรตีนมานานกว่า 150 ปีแล้ว[ 6 ]
ในปี พ.ศ. 2383 ฟรีดริช ลุดวิก ฮือเนเฟลด์ ค้นพบการก่อตัวของวัสดุผลึกโดยบังเอิญในตัวอย่างเลือดไส้เดือนที่วางไว้ใต้แผ่นกระจกสองแผ่น และบางครั้งก็สังเกตเห็นผลึกรูปแผ่นเล็กๆ ในตัวอย่างเลือดหมูหรือเลือดมนุษย์ที่แห้ง ผลึกเหล่านี้ได้รับการตั้งชื่อว่า 'ฮีโมโกลบิน' โดยเฟลิกซ์ ฮอปเป-เซย์เลอร์ ในปี พ.ศ. 2307 การค้นพบที่สำคัญของฮือเนเฟลด์เป็นแรงบันดาลใจให้กับนักวิทยาศาสตร์หลายคนในอนาคต[ 7 ]
ในปี พ.ศ. 2494 Otto Funke ได้อธิบายกระบวนการผลิตผลึกฮีโมโกลบินของมนุษย์โดยการเจือจางเซลล์เม็ดเลือดแดงด้วยตัวทำละลาย เช่น น้ำบริสุทธิ์ แอลกอฮอล์ หรืออีเทอร์ จากนั้นจึงระเหยตัวทำละลายออกจากสารละลายโปรตีนอย่างช้าๆ ในปี พ.ศ. 2414 William T. Preyer ศาสตราจารย์แห่งมหาวิทยาลัยเยนาได้ตีพิมพ์หนังสือชื่อDie Blutkrystalle (ผลึกแห่งเลือด) ซึ่งทบทวนคุณสมบัติของผลึกฮีโมโกลบินจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม นก สัตว์เลื้อยคลาน และปลา ประมาณ 50 ชนิด [ 7 ]วิธีการในยุคแรกๆ เหล่านี้อาศัยเทคนิคการระเหยแบบง่ายๆ และส่วนใหญ่ใช้กับโปรตีนที่มีอยู่มากมายตามธรรมชาติ เช่นฮีโมโกลบิน[ 3 ]
ในปี พ.ศ. 2452 นักสรีรวิทยา Edward T. Reichert ร่วมกับนักแร่ธาตุวิทยา Amos P. Brown ได้ตีพิมพ์บทความเกี่ยวกับการเตรียม การศึกษาสรีรวิทยา และลักษณะทางเรขาคณิตของผลึกฮีโมโกลบินจากสัตว์หลายร้อยชนิด รวมถึงสัตว์ที่สูญพันธุ์ไปแล้ว เช่น หมาป่าแทสเมเนียน[ 7 ]พบผลึกโปรตีนเพิ่มขึ้น
ในปี พ.ศ. 2477 จอห์น เดสมอนด์ เบอร์นัลและโดโรธี ฮอดจ์ กิน นักศึกษาของเขา ค้นพบว่าผลึกโปรตีนที่ล้อมรอบด้วยสารละลายแม่ (สารละลายที่เหลือหลังจากโปรตีนตกผลึกจากสารละลายอิ่มตัวยิ่งยวด) ให้รูปแบบการเลี้ยวเบนที่ดีกว่าผลึกแห้ง โดยใช้เปปซินพวกเขาเป็นกลุ่มแรกที่สามารถแยกแยะรูปแบบการเลี้ยวเบนของโปรตีนทรงกลมที่เปียกได้ ก่อนหน้าเบอร์นัลและฮอดจ์กิน การศึกษาโครงสร้างผลึกของโปรตีนทำได้เฉพาะในสภาวะแห้งเท่านั้น ซึ่งให้ผลลัพธ์ที่ไม่สอดคล้องกันและไม่น่าเชื่อถือ นี่คือ รูปแบบ การเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ ครั้งแรก ของผลึกโปรตีน[ 8 ]
ในปี พ.ศ. 2491 โครงสร้างของไมโอโกลบิน (โปรตีนสีแดงที่มีฮีม ) ซึ่งกำหนดโดยการวิเคราะห์ผลึกด้วยรังสีเอกซ์ ได้รับการรายงานครั้งแรกโดยจอห์น เคนดรูว์ [ 9 ] เคนดรูว์ได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีร่วมกับแม็กซ์ เพรุตซ์ ในปี พ.ศ. 2505 จากการค้นพบนี้[ 4 ]
พื้นหลัง
ทฤษฎีการตกผลึกของโปรตีน
การตกผลึกของโปรตีนถูกควบคุมโดยหลักฟิสิกส์เดียวกันกับที่ควบคุมการก่อตัวของผลึกอนินทรีย์ สำหรับการตกผลึกที่จะเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ สถานะของผลึกจะต้องเป็นที่ต้องการทางอุณหพลศาสตร์ ซึ่งอธิบายได้ด้วยพลังงานอิสระของกิบส์ (∆G) ซึ่งกำหนดเป็น ∆G = ∆H - T∆S ซึ่งแสดงให้เห็นว่า การเปลี่ยนแปลง เอนทัลปีของกระบวนการ ∆H แลกเปลี่ยนกับการเปลี่ยนแปลงเอนโทรปี ที่สอดคล้องกัน ∆S อย่างไร [ 10 ]เอนโทรปีโดยคร่าวๆ อธิบายถึงความไม่เป็นระเบียบของระบบ สถานะที่มีระเบียบสูง เช่น ผลึกโปรตีน จะไม่เป็นที่ต้องการทางอุณหพลศาสตร์เมื่อเทียบกับสถานะที่ไม่เป็นระเบียบมากกว่า เช่น สารละลายของโปรตีนในตัวทำละลาย เนื่องจากการเปลี่ยนไปสู่สถานะที่มีระเบียบมากขึ้นจะลดเอนโทรปีรวมของระบบ (∆S ติดลบ) สำหรับการก่อตัวของผลึกโดยธรรมชาติ ∆G ของการก่อตัวของผลึกจะต้องเป็นลบ กล่าวอีกนัยหนึ่ง ค่าปรับเอนโทรปีจะต้องได้รับการชดเชยด้วยการลดลงของพลังงานรวมของระบบ (∆H) ที่สอดคล้องกัน ผลึกอนินทรีย์ที่คุ้นเคย เช่นโซเดียมคลอไรด์จะเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติภายใต้สภาวะแวดล้อม เนื่องจากสถานะผลึกจะลดพลังงานรวมของระบบ อย่างไรก็ตาม การตกผลึกของโปรตีนบางชนิดภายใต้สภาวะแวดล้อมจะทำให้เอนโทรปีลดลง (∆S ติดลบ) และพลังงานรวมเพิ่มขึ้น (∆H เป็นบวก) ของระบบ ดังนั้นจึงไม่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ เพื่อให้เกิดการตกผลึกของโปรตีนดังกล่าว จึงต้องปรับเปลี่ยนสภาวะเพื่อให้การก่อตัวของผลึกเป็นไปได้ในเชิงพลังงาน ซึ่งมักจะทำได้โดยการสร้าง สารละลาย อิ่มตัวยิ่งยวดของตัวอย่าง[ 3 ]
มุมมองระดับโมเลกุลที่เริ่มต้นจากสารละลายไปสู่ผลึก
การก่อตัวของผลึกต้องอาศัยสองขั้นตอน ได้แก่การเกิดนิวเคลียสและการเติบโต [ 3 ] การเกิดนิวเคลียสเป็นขั้นตอนเริ่มต้นของการตกผลึก[ 3 ]ในระยะการเกิดนิวเคลียส โมเลกุลของโปรตีนในสารละลายจะรวมตัวกันเป็นกลุ่มเพื่อสร้างนิวเคลียสของแข็งที่เสถียร[ 3 ]เมื่อนิวเคลียสก่อตัวขึ้น ผลึกจะเติบโตใหญ่ขึ้นเรื่อยๆ โดยโมเลกุลจะเกาะติดกับนิวเคลียสที่เสถียรนี้[ 3 ]ขั้นตอนการเกิดนิวเคลียสมีความสำคัญต่อการก่อตัวของผลึก เนื่องจากเป็นการเปลี่ยนสถานะอันดับแรก ของตัวอย่างที่เคลื่อนจาก สถานะที่มีอิสระสูงไปสู่สถานะที่เป็นระเบียบ (จากของเหลวเป็นของแข็ง) [ 3 ]เพื่อให้ขั้นตอนการเกิดนิวเคลียสประสบความสำเร็จ การควบคุมพารามิเตอร์การตกผลึกจึงเป็นสิ่งจำเป็น แนวทางในการทำให้โปรตีนตกผลึกคือการลดความสามารถในการละลายของโปรตีนเป้าหมายในสารละลาย[ 3 ]เมื่อเกินขีดจำกัดความสามารถในการละลายและมีผลึกเกิดขึ้น การตกผลึกก็สำเร็จ[ 3 ]
วิธีการ
การแพร่ไอ
การแพร่ไอเป็นวิธีการตกผลึกโปรตีนที่ใช้กันทั่วไปมากที่สุด ในวิธีนี้ หยดที่มีโปรตีนบริสุทธิ์บัฟเฟอร์และสารตกตะกอน จะถูกปล่อยให้สมดุลกับอ่างเก็บขนาดใหญ่ที่มีบัฟเฟอร์และสารตกตะกอนที่คล้ายกันในความเข้มข้นที่สูงกว่า ในตอนเริ่มต้น หยดของสารละลายโปรตีนจะมีสารตกตะกอนและความเข้มข้นของโปรตีนค่อนข้างต่ำ แต่เมื่อหยดและอ่างเก็บสมดุลกัน ความเข้มข้นของสารตกตะกอนและโปรตีนจะเพิ่มขึ้นในหยด หากใช้สารละลายตกผลึกที่เหมาะสมสำหรับโปรตีนที่กำหนด การเจริญเติบโตของผลึกจะเกิดขึ้นในหยด[ 11 ] [ 12 ]วิธีนี้ใช้เพราะช่วยให้เกิดการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของโปรตีนและสารตกตะกอนอย่างค่อยเป็นค่อยไปและนุ่มนวล ซึ่งช่วยในการเจริญเติบโตของผลึกขนาดใหญ่และมีระเบียบ
การแพร่ไอสามารถทำได้ทั้งในรูปแบบหยดแขวนหรือหยดวาง อุปกรณ์หยดแขวนเกี่ยวข้องกับการวางหยดสารละลายโปรตีนลงบนแผ่นกระจกปิดคว่ำ จากนั้นจึงแขวนไว้เหนืออ่างเก็บสารละลาย อุปกรณ์ตกผลึกแบบหยดวางจะวางหยดลงบนฐานที่แยกออกจากอ่างเก็บสารละลาย ทั้งสองวิธีนี้จำเป็นต้องปิดผนึกสภาพแวดล้อมเพื่อให้เกิดสมดุลระหว่างหยดและอ่างเก็บสารละลาย[ 11 ] [ 13 ]
ไมโครแบทช์
โดยทั่วไปแล้ว การทดลองแบบไมโครแบทช์เกี่ยวข้องกับการจุ่มหยดโปรตีนปริมาณน้อยมากในน้ำมัน (น้อยถึง 1 ไมโครลิตร) เหตุผลที่ต้องใช้น้ำมันก็เพราะใช้สารละลายโปรตีนปริมาณน้อยมาก ดังนั้นจึงต้องป้องกันการระเหยเพื่อให้การทดลองดำเนินไปในน้ำได้ แม้ว่าจะมีน้ำมันหลายชนิดที่สามารถใช้ได้ แต่สารปิดผนึกที่ใช้กันทั่วไปมากที่สุดสองชนิดคือน้ำมันพาราฟิน (อธิบายโดย Chayen et al.) และน้ำมันซิลิโคน (อธิบายโดย D'Arcy) นอกจากนี้ยังมีวิธีการอื่นๆ สำหรับการทำไมโครแบทช์ที่ไม่ใช้สารปิดผนึกที่เป็นของเหลว แต่ต้องให้นักวิทยาศาสตร์วางฟิล์มหรือเทปบางชนิดลงบนแผ่นเพลทที่มีหลุมหลังจากวางหยดลงในหลุมแล้ว
นอกจากจะใช้ตัวอย่างในปริมาณที่จำกัดมากแล้ว วิธีนี้ยังมีข้อดีอีกประการหนึ่งคือ ตัวอย่างจะได้รับการปกป้องจากการปนเปื้อนในอากาศ เนื่องจากตัวอย่างจะไม่สัมผัสกับอากาศในระหว่างการทดลองเลย
ไมโครไดอะลิซิส
กระบวนการไมโครไดอะไลซิสอาศัยหลักการของเยื่อกั้นกึ่งซึมผ่านได้ ซึ่งโมเลกุลขนาดเล็กและไอออนสามารถผ่านได้ ในขณะที่โปรตีนและพอลิเมอร์ขนาดใหญ่ไม่สามารถผ่านได้ โดยการสร้างความแตกต่างของความเข้มข้นของสารละลายข้ามเยื่อกั้น และปล่อยให้ระบบดำเนินไปสู่สมดุล ระบบจะค่อยๆ เคลื่อนไปสู่ภาวะอิ่มตัวยิ่งยวด ซึ่งในจุดนั้นอาจเกิดผลึกโปรตีนขึ้นได้
กระบวนการไมโครไดอะไลซิสสามารถสร้างผลึกได้โดยการแยก สารด้วย เกลือ โดยใช้เกลือที่มีความเข้มข้นสูงหรือสารประกอบขนาดเล็กอื่นๆ ที่สามารถซึมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ได้ ซึ่งจะลดความสามารถในการละลายของโปรตีน ในบางกรณีที่พบได้น้อยมาก โปรตีนบางชนิดสามารถตกผลึกได้โดยการรวมสารด้วยเกลือในกระบวนการไดอะไลซิส โดยการไดอะไลซิสกับน้ำบริสุทธิ์เพื่อกำจัดสารละลาย ทำให้เกิดการรวมตัวกันเองและการตกผลึก
การแพร่ผ่านอินเตอร์เฟซอิสระ
เทคนิคนี้รวมโปรตีนและสารละลายตกตะกอนเข้าด้วยกันโดยไม่ต้องผสมล่วงหน้า แต่ใช้วิธีฉีดผ่านด้านใดด้านหนึ่งของช่อง ทำให้เกิดสมดุลผ่านการแพร่ สารละลายทั้งสองจะสัมผัสกันในห้องรีเอเจนต์ โดยทั้งสองมีความเข้มข้นสูงสุด ทำให้เกิดการก่อตัวของนิวเคลียสขึ้นเอง เมื่อระบบเข้าสู่สมดุล ระดับความอิ่มตัวยิ่งยวดจะลดลง ส่งเสริมการเติบโตของผลึก[ 14 ]
ปัจจัยที่มีอิทธิพล
ค่า pH
แรงผลักดันพื้นฐานสำหรับการตกผลึกของโปรตีนคือการเพิ่มประสิทธิภาพจำนวนพันธะที่สามารถสร้างกับโปรตีนอื่นผ่านปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุล[ 3 ]ปฏิกิริยาเหล่านี้ขึ้นอยู่กับความหนาแน่นของอิเล็กตรอนของโมเลกุลและโซ่ข้างของโปรตีนที่เปลี่ยนแปลงไปตามค่าpH [ 10 ]โครงสร้างตติยภูมิและจตุรภูมิของโปรตีนถูกกำหนดโดยปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุลระหว่างหมู่ข้างของกรดอะมิโน ซึ่งหมู่ที่ชอบน้ำมักจะหันออกไปทางสารละลายเพื่อสร้างเปลือกไฮเดรชั่นให้กับตัวทำละลาย (น้ำ) [ 10 ]เมื่อค่า pH เปลี่ยนแปลง ประจุบนหมู่ข้างที่มีขั้วเหล่านี้ก็จะเปลี่ยนแปลงไปตามค่า pH ของสารละลายและค่า pKa ของโปรตีน ด้วย ดังนั้น การเลือกค่า pH จึงมีความสำคัญอย่างยิ่งในการส่งเสริมการก่อตัวของผลึกที่พันธะระหว่างโมเลกุลต่อกันนั้นเอื้ออำนวยมากกว่าพันธะกับโมเลกุลของน้ำ[ 10 ]ค่า pH เป็นหนึ่งในการควบคุมที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดที่สามารถนำมาใช้เพื่อกำหนดสภาวะการตกผลึกที่เหมาะสมที่สุด
อุณหภูมิ
อุณหภูมิเป็นพารามิเตอร์ที่น่าสนใจอีกประการหนึ่งที่ควรนำมาพิจารณา เนื่องจากความสามารถในการละลายของโปรตีนเป็นฟังก์ชันของอุณหภูมิ[ 15 ]ในการตกผลึกโปรตีน การปรับอุณหภูมิเพื่อให้ได้ผลึกที่ประสบความสำเร็จเป็นกลยุทธ์ทั่วไปอย่างหนึ่ง ซึ่งแตกต่างจากค่า pH อุณหภูมิของส่วนประกอบต่างๆ ในการทดลองการตกผลึกอาจส่งผลต่อผลลัพธ์สุดท้าย เช่น อุณหภูมิของการเตรียมบัฟเฟอร์[ 16 ]อุณหภูมิของการทดลองการตกผลึกจริง เป็นต้น
สารเติมแต่งทางเคมี
สารเติมแต่งทางเคมีคือสารประกอบเคมีขนาดเล็กที่ถูกเติมเข้าไปในกระบวนการตกผลึกเพื่อเพิ่มผลผลิตของผลึก[ 17 ]บทบาทของโมเลกุลขนาดเล็กในการตกผลึกโปรตีนนั้นยังไม่ได้รับการพิจารณาอย่างรอบคอบในช่วงแรก เนื่องจากส่วนใหญ่ถูกมองว่าเป็นสารปนเปื้อน[ 17 ]เชื่อกันว่าโมเลกุลขนาดเล็กจะช่วยได้หาก/เมื่อถูกรวมเข้าเป็น "สะพานเชื่อม" ในส่วนติดต่อของผลึก ปัจจุบัน (ณ ปี 2017) ยังไม่สามารถระบุได้อย่างมีเหตุผลว่าควรใช้โมเลกุลขนาดเล็กชนิดใดเพื่อเพิ่มโอกาสในการตกผลึก[ 18 ]
การดัดแปลงโปรตีน
วิธีการตกผลึกแบบดั้งเดิมคือการเติม เอนไซม์โปรตีเอสจำนวนเล็กน้อยลงในหยดสารละลาย เนื่องจากกระบวนการย่อยอาจทำให้ได้ชิ้นส่วนที่ตกผลึกได้ง่ายขึ้นโดยการกำจัดบริเวณที่ไม่มีโครงสร้าง
การดัดแปลงทางเคมีสามารถใช้เพื่อปรับปรุงการตกผลึกได้ วิธีที่ใช้กันมากที่สุดคือการเมทิลเลชันแบบรีดักชัน ซึ่งจะเปลี่ยนไลซีนบนพื้นผิวในลักษณะที่มักจะลดเอนโทรปี[ 18 ]
เทคโนโลยี
การคัดกรองการตกผลึกที่มีประสิทธิภาพสูง
มีวิธีการประมวลผลความเร็วสูงเพื่อช่วยปรับปรุงการทดลองจำนวนมากที่จำเป็นในการสำรวจเงื่อนไขต่างๆ ที่จำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตของผลึกที่ประสบความสำเร็จ มีชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์จำนวนมากที่สามารถสั่งซื้อได้ ซึ่งใช้ส่วนผสมที่ประกอบไว้ล่วงหน้าในระบบที่รับประกันว่าจะทำให้เกิดการตกผลึกที่ประสบความสำเร็จ การใช้ชุดอุปกรณ์ดังกล่าว นักวิทยาศาสตร์สามารถหลีกเลี่ยงความยุ่งยากในการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์และกำหนดเงื่อนไขการตกผลึกที่เหมาะสมได้[ 19 ]
หุ่นยนต์จัดการของเหลวสามารถใช้ในการตั้งค่าและทำให้การทดลองการตกผลึกจำนวนมากเป็นไปโดยอัตโนมัติพร้อมกัน สิ่งที่ปกติแล้วจะเป็นกระบวนการที่ช้าและอาจเกิดข้อผิดพลาดได้หากดำเนินการโดยมนุษย์ สามารถทำได้อย่างมีประสิทธิภาพและแม่นยำด้วยระบบอัตโนมัติ ระบบการตกผลึกด้วยหุ่นยนต์ใช้ส่วนประกอบเดียวกันกับที่อธิบายไว้ข้างต้น แต่ดำเนินการแต่ละขั้นตอนของกระบวนการอย่างรวดเร็วและทำซ้ำได้จำนวนมาก การทดลองแต่ละครั้งใช้สารละลายในปริมาณเล็กน้อย และข้อดีของขนาดที่เล็กกว่านั้นมีสองด้าน: ขนาดตัวอย่างที่เล็กกว่าไม่เพียงแต่ลดค่าใช้จ่ายของโปรตีนบริสุทธิ์เท่านั้น แต่ปริมาณสารละลายที่น้อยลงยังนำไปสู่การตกผลึกที่เร็วขึ้น การทดลองแต่ละครั้งจะถูกตรวจสอบโดยกล้องที่ตรวจจับการเติบโตของผลึก[ 12 ]
วิศวกรรมโปรตีน
โปรตีนสามารถถูกออกแบบเพื่อเพิ่มโอกาสในการตกผลึกโปรตีนที่ประสบความสำเร็จ วิธีทั่วไปคือการตัดแต่งโครงสร้างรีคอมบิแนนท์เพื่อกำจัดส่วนปลาย N และ C ซึ่งมักจะไม่มีระเบียบหรือมีโครงสร้างที่ไม่ดี ("เอนโทรปีสูง") [ 18 ]
การลดเอนโทรปีของพื้นผิวเกี่ยวข้องกับการแทนที่กลุ่มสารตกค้างบนพื้นผิวที่มีเอนโทรปีเชิงโครงสร้างสูง (โดยปกติคือไลซีน กลูตาเมต และกลูตามีน) ด้วยอะลานีน[ 20 ]ในทำนองเดียวกัน การแทนที่ไลซีนด้วยอาร์จินีนในปริมาณมากก็ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีประโยชน์[ 21 ]นอกจากนี้ยังสามารถสร้างการสัมผัสของผลึกได้โดยการกลายพันธุ์ของสารตกค้าง[ 22 ]
วิธีการที่ก้าวหน้ายิ่งกว่านั้นเกี่ยวข้องกับการใช้โปรตีน "ชาเปอโรน" ที่ทราบกันว่าสามารถตกผลึกได้ดีกว่า ซึ่งสามารถทำได้โดยการออกแบบโปรตีนลูกผสมที่ประกอบด้วยโปรตีนที่มีโครงสร้างที่ไม่ทราบแน่ชัดและโดเมนโปรตีนที่ทราบกันว่าตกผลึกได้ดี ปฏิสัมพันธ์ดังกล่าวอาจเป็นปฏิสัมพันธ์ ระหว่างโมเลกุล ตัวอย่างเช่น ระหว่างโปรตีนเป้าหมายและชิ้นส่วน Fab ของแอนติบอดีบางส่วน ที่ถูกเลือกให้จับกับโปรตีนอย่างแน่นหนา[ 18 ]หรือระหว่างโปรตีนลูกผสมที่จับกับมอลโทส (MBP) และโปรตีนที่ออกแบบมาโดยเฉพาะเพื่อจับกับ MBP [ 23 ]
วิธีการทางวิศวกรรมโปรตีนหลายวิธีต้องอาศัยความรู้เบื้องต้นเกี่ยวกับโครงสร้างโปรตีน ไม่ว่าจะเป็นการรู้ว่าสารตกค้างใดอยู่บนพื้นผิวหรือถูกฝังอยู่ หรือการรู้โครงสร้างตติยภูมิทั้งหมด เครื่องมือ ทำนายโครงสร้างโปรตีน สมัยใหม่ ส่วนใหญ่ก็เพียงพอแล้ว นอกจากนี้ยังสามารถทำนายผลลัพธ์ของการตกผลึกโดยใช้วิธีการเหล่านี้ได้อีกด้วย[ 24 ]
หมู่ซิสทีนบนพื้นผิวมักก่อให้เกิดปัญหาในการผลิตโปรตีนลูกผสมโดยทำให้เกิดการรวมตัวกัน สามารถแทนที่ด้วยอะลานีนได้ นี่ไม่ใช่ปัญหาในการตกผลึกโดยตรงแต่เป็นปัญหาที่พบได้ทั่วไปในการกำหนดโครงสร้าง
แอปพลิเคชัน
โครงสร้างของโมเลกุลขนาดใหญ่สามารถกำหนดได้จากผลึกโปรตีนโดยใช้วิธีการต่างๆ รวมถึงการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ / การวิเคราะห์โครงสร้างผลึก ด้วยรังสีเอกซ์กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (CryoEM) (รวมถึง การวิเคราะห์ โครงสร้างผลึกด้วยอิเล็กตรอนและการเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนในผลึกขนาดเล็ก (MicroED) ) การกระเจิงของรังสีเอกซ์มุมเล็กและการเลี้ยวเบนของนิวตรอนดูเพิ่มเติมที่ชีววิทยาโครงสร้าง
การตกผลึกของโปรตีนยังมีประโยชน์ในการเตรียมโปรตีนเพื่อวัตถุประสงค์ทางเภสัชกรรมอีกด้วย[ 25 ]การตกผลึกช่วยให้เกิดการสร้างและการทำให้บริสุทธิ์ของส่วนประกอบทางเภสัชกรรมที่ออกฤทธิ์หลายชนิด การสร้างอนุภาคของแข็งที่มีรูปแบบผลึกและความบริสุทธิ์ที่ต้องการมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการควบคุมคุณสมบัติทางกายภาพและเคมี (ลักษณะทางกายภาพและเคมีของสาร เช่น ความสามารถในการละลาย ความหนาแน่น ค่า pH และความเสถียร) ของโปรตีน[ 26 ]
ดูเพิ่มเติม
อ่านเพิ่มเติม
- Cudney R (1999). "การตกผลึกโปรตีนและโชคช่วย" (PDF)วารสารRigaku 16 ( 1): 1– 7. เก็บถาวรจากต้นฉบับ(PDF)เมื่อวันที่ 4 มีนาคม 2016
- Owens R. "ผลึกโปรตีน" . Backstage Science . Brady Haran .
ลิงก์ภายนอก
- หน้านี้ได้รับการคัดลอก (โดยมีการแก้ไขบางส่วน) โดยได้รับความยินยอมจาก ดร. เอ. มัลคอล์ม แคมป์เบลล์ ณ ปี 2010 สามารถดูหน้าต้นฉบับได้ที่Campbell AM (2003). "Protein Crystallization" . Davidson, NC: Department of Biology, Davidson College.