การโคลนนิ่งระดับโมเลกุลเป็นชุดของวิธีการทดลองในชีววิทยาระดับโมเลกุลที่ใช้ในการประกอบ โมเลกุล DNA ลูกผสมและควบคุมการจำลองแบบภายใน สิ่งมี ชีวิตเจ้าบ้าน^{[ 1 ]}การใช้คำว่าโคลนนิ่งหมายถึงข้อเท็จจริงที่ว่าวิธีการนี้เกี่ยวข้องกับการจำลองแบบของโมเลกุลหนึ่งเพื่อสร้างประชากรของเซลล์ที่มีโมเลกุล DNA ที่เหมือนกัน การโคลนนิ่งระดับโมเลกุลโดยทั่วไปใช้ลำดับ DNA จากสิ่งมีชีวิตสองชนิดที่แตกต่างกัน: ชนิดที่เป็นแหล่งของ DNA ที่จะถูกโคลนนิ่ง และชนิดที่จะทำหน้าที่เป็นเจ้าบ้าน ที่มีชีวิต สำหรับการจำลองแบบของ DNA ลูกผสม วิธีการโคลนนิ่งระดับโมเลกุลเป็นหัวใจสำคัญของหลายสาขาในปัจจุบันของชีววิทยาและการแพทย์สมัยใหม่^{[ 2 ]}

ในการทดลองโคลนนิ่งโมเลกุลแบบดั้งเดิม ดีเอ็นเอที่จะโคลนนิ่งจะได้รับจากสิ่งมีชีวิตที่สนใจ จากนั้นจึงนำไปบำบัดด้วยเอนไซม์ในหลอดทดลองเพื่อสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดเล็ก ต่อมา ชิ้นส่วนเหล่านี้จะถูกรวมเข้ากับดีเอ็นเอเวกเตอร์ เพื่อสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสม จากนั้นดีเอ็นเอลูกผสมจะถูกนำเข้าสู่สิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน (โดยทั่วไปคือแบคทีเรีย E. coliสายพันธุ์ที่เพาะเลี้ยงง่าย ไม่เป็นอันตราย และใช้ในห้องปฏิบัติการ) ซึ่งจะสร้างประชากรของสิ่งมีชีวิตที่มีโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมถูกจำลองขึ้นพร้อมกับดีเอ็นเอเจ้าบ้าน เนื่องจากมีชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากภายนอก สิ่งมีชีวิตเหล่านี้จึงเป็น จุลินทรีย์ ดัดแปลงพันธุกรรม ( GMOs ) ^{[ 3 ]}กระบวนการนี้ใช้ประโยชน์จากข้อเท็จจริงที่ว่าเซลล์แบคทีเรียเพียงเซลล์เดียวสามารถถูกชักนำให้รับและจำลองโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมเพียงโมเลกุลเดียวได้ จากนั้นเซลล์เดียวนี้สามารถขยายตัวอย่างทวีคูณเพื่อสร้างแบคทีเรียจำนวนมาก ซึ่งแต่ละตัวจะมีสำเนาของโมเลกุลลูกผสมดั้งเดิม ดังนั้น ทั้งประชากรแบคทีเรียที่เกิดขึ้นและโมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์จึงมักถูกเรียกว่า "โคลน" ตามหลักแล้วDNA รีคอมบิแนนท์หมายถึงโมเลกุล DNA ในขณะที่การโคลนนิ่งระดับโมเลกุลหมายถึงวิธีการทดลองที่ใช้ในการประกอบโมเลกุลเหล่านั้น แนวคิดนี้เกิดขึ้นจากการที่สามารถแทรกลำดับ DNA ที่แตกต่างกันเข้าไปในพลาสมิดและลำดับต่างชาติเหล่านี้จะถูกนำเข้าไปในแบคทีเรียและจำลองแบบเป็นส่วนหนึ่งของพลาสมิด กล่าวคือ พลาสมิดเหล่านี้สามารถทำหน้าที่เป็นเวกเตอร์โคลนนิ่งเพื่อนำยีน^{[ 4 ]}

ลำดับ DNA แทบทุกลำดับสามารถโคลนและขยายได้ แต่มีปัจจัยบางอย่างที่อาจจำกัดความสำเร็จของกระบวนการ ตัวอย่างของลำดับ DNA ที่ยากต่อการโคลน ได้แก่ ลำดับซ้ำแบบกลับด้าน จุดเริ่มต้นของการจำลองแบบ เซนโทรเมียร์ และเทโลเมียร์ นอกจากนี้ โอกาสความสำเร็จยังลดลงเมื่อแทรกลำดับ DNA ขนาดใหญ่ การแทรกที่มีขนาดใหญ่กว่า 10 kbp มีโอกาสประสบความสำเร็จน้อยมาก แต่แบคทีริโอเฟจ เช่นแบคทีริโอเฟจ λสามารถปรับเปลี่ยนให้แทรกลำดับที่มีขนาดถึง 40 kbp ได้สำเร็จ^{[ 5 ]}

ก่อนทศวรรษ 1970 ความเข้าใจเกี่ยวกับพันธุศาสตร์และชีววิทยาโมเลกุลถูกจำกัดอย่างมากเนื่องจากไม่สามารถแยกและศึกษาแต่ละยีนจากสิ่งมีชีวิตที่ซับซ้อนได้ สิ่งนี้เปลี่ยนแปลงไปอย่างมากด้วยการเกิดขึ้นของวิธีการโคลนนิ่งโมเลกุล นักจุลชีววิทยาที่พยายามทำความเข้าใจกลไกโมเลกุลที่แบคทีเรียจำกัดการเจริญเติบโตของแบคทีริโอเฟจ ได้แยก เอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction endonucleases ) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่สามารถตัดโมเลกุล DNA ได้เฉพาะเมื่อพบลำดับ DNA ที่เฉพาะเจาะจงเท่านั้น^{[ 6 ]}พวกเขาแสดงให้เห็นว่าเอนไซม์ตัดจำเพาะตัดโมเลกุล DNA ที่มีความยาวเท่ากับโครโมโซมในตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจง และส่วนที่เฉพาะเจาะจงของโมเลกุลขนาดใหญ่สามารถทำให้บริสุทธิ์ได้โดยการแยกตามขนาด โดยใช้เอนไซม์ตัวที่สองคือDNA ligaseชิ้นส่วนที่สร้างขึ้นโดยเอนไซม์ตัดจำเพาะสามารถเชื่อมต่อกันในรูปแบบใหม่ที่เรียกว่าDNA ลูกผสม (recombinant DNA ) โดยการรวมส่วนของ DNA ที่สนใจเข้ากับ DNA เวกเตอร์ เช่น แบคทีริโอเฟจหรือพลาสมิด ซึ่งจำลองตัวเองตามธรรมชาติภายในแบคทีเรีย ทำให้สามารถผลิตโมเลกุล DNA ลูกผสมบริสุทธิ์จำนวนมากในวัฒนธรรมแบคทีเรียได้ โมเลกุล DNA ลูกผสมตัวแรกถูกสร้างขึ้นและศึกษาในปี 1972 ^{[ 7 ] [ 8 ]}

การโคลนนิ่งระดับโมเลกุลใช้ประโยชน์จากข้อเท็จจริงที่ว่าโครงสร้างทางเคมีของดีเอ็นเอโดยพื้นฐานแล้วเหมือนกันในสิ่งมีชีวิตทุกชนิด ดังนั้น หากนำดีเอ็นเอส่วนใดส่วนหนึ่งจากสิ่งมีชีวิตใดๆ มาแทรกเข้าไปในส่วนของดีเอ็นเอที่มีลำดับโมเลกุลที่จำเป็นสำหรับการจำลองดีเอ็นเอและ นำ ดีเอ็นเอลูกผสม ที่ได้นั้น เข้าไปในสิ่งมีชีวิตที่ได้ลำดับการจำลองมา ดีเอ็นเอจากภายนอกก็จะถูกจำลองไปพร้อมกับดีเอ็นเอของเซลล์เจ้าบ้านในสิ่งมีชีวิต ดัดแปลงพันธุกรรม นั้น

การโคลนนิ่งระดับโมเลกุลคล้ายคลึงกับ PCR ตรงที่ช่วยให้สามารถจำลองลำดับดีเอ็นเอได้ ความแตกต่างพื้นฐานระหว่างสองวิธีนี้คือ การโคลนนิ่งระดับโมเลกุลเกี่ยวข้องกับการจำลองดีเอ็นเอในจุลินทรีย์ที่มีชีวิต ในขณะที่ PCR จำลองดีเอ็นเอใน สารละลาย ในหลอดทดลองโดยปราศจากเซลล์ที่มีชีวิต

ก่อนที่จะทำการทดลองโคลนนิ่งจริงในห้องปฏิบัติการ การทดลองโคลนนิ่งส่วนใหญ่จะวางแผนไว้ในคอมพิวเตอร์โดยใช้ซอฟต์แวร์เฉพาะทาง แม้ว่าการวางแผนรายละเอียดของการโคลนนิ่งสามารถทำได้ในโปรแกรมแก้ไขข้อความใดๆ ก็ได้ พร้อมกับยูทิลิตี้ออนไลน์ เช่น การออกแบบไพรเมอร์ PCR แต่ก็มีซอฟต์แวร์เฉพาะทางสำหรับจุดประสงค์นี้ ซอฟต์แวร์สำหรับจุดประสงค์นี้ ได้แก่ ApE [1] (โอเพนซอร์ส), DNAStrider [2] (โอเพนซอร์ส), Serial Cloner [3] (ฟรี), Collagene [4] (โอเพนซอร์ส) และSnapGene (เชิงพาณิชย์) โปรแกรมเหล่านี้อนุญาตให้จำลองปฏิกิริยาPCR การย่อย ด้วยเอนไซม์จำกัดการเชื่อมต่อฯลฯ ซึ่งก็คือขั้นตอนทั้งหมดที่อธิบายไว้ด้านล่าง

ในการทดลองการโคลนนิ่งโมเลกุลมาตรฐาน การโคลนนิ่งชิ้นส่วน DNA ใดๆ โดยพื้นฐานแล้วเกี่ยวข้องกับเจ็ดขั้นตอน: (1) การเลือกสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านและเวกเตอร์การโคลนนิ่ง (2) การเตรียม DNA เวกเตอร์ (3) การเตรียม DNA ที่จะถูกโคลนนิ่ง (4) การสร้าง DNA ลูกผสม (5) การนำ DNA ลูกผสมเข้าสู่สิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน (6) การคัดเลือกสิ่งมีชีวิตที่มี DNA ลูกผสม (7) การคัดกรองโคลนนิ่งที่มี DNA แทรกที่ต้องการและคุณสมบัติทางชีวภาพ

ที่น่าสังเกตคือ ความสามารถและความแม่นยำที่เพิ่มขึ้นของแพลตฟอร์มการสังเคราะห์ DNA ช่วยให้สามารถออกแบบที่ซับซ้อนมากขึ้นในวิศวกรรมโมเลกุล โครงการเหล่านี้อาจรวมถึงสาย DNA ลำดับใหม่ที่มีความยาวมากและ/หรือทดสอบไลบรารีทั้งหมดพร้อมกัน แทนที่จะทดสอบลำดับแต่ละรายการ การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ทำให้เกิดความซับซ้อนที่ต้องการให้การออกแบบเปลี่ยนจากการแสดงผลแบบนิวคลีโอไทด์แบบแบนไปสู่ระดับนามธรรมที่สูงขึ้น ตัวอย่างของเครื่องมือดังกล่าว ได้แก่GenoCAD , Teselagen [5] (ฟรีสำหรับสถาบันการศึกษา) หรือ GeneticConstructor [6] (ฟรีสำหรับนักวิชาการ)

แม้ว่าจะมีการใช้สิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านและเวกเตอร์โคลนนิ่งโมเลกุลจำนวนมาก แต่การทดลองโคลนนิ่งโมเลกุลส่วนใหญ่เริ่มต้นด้วยสายพันธุ์แบคทีเรียE. coli ( Escherichia coli ) ในห้องปฏิบัติการและเวกเตอร์โคลนนิ่งพลาสมิด E. coliและเวกเตอร์พลาสมิดเป็นที่นิยมใช้กันทั่วไปเนื่องจากมีความซับซ้อนทางเทคนิค อเนกประสงค์ หาได้ง่าย และช่วยให้สิ่งมีชีวิตลูกผสมเติบโตอย่างรวดเร็วโดยใช้อุปกรณ์น้อยที่สุด^{[ 3 ]}หาก DNA ที่จะโคลนนิ่งมีขนาดใหญ่มาก (หลายแสนถึงหลายล้านคู่เบส) มักจะเลือกใช้ โครโมโซมเทียมของแบคทีเรีย^{[ 10 ]}หรือ เวกเตอร์ โครโมโซมเทียมของยีสต์

การใช้งานเฉพาะทางอาจต้องการระบบโฮสต์-เวกเตอร์ที่เฉพาะเจาะจง ตัวอย่างเช่น หากนักทดลองต้องการเก็บเกี่ยวโปรตีนเฉพาะจากสิ่งมีชีวิตลูกผสม ก็ จะต้องเลือก เวกเตอร์แสดงออกที่มีสัญญาณที่เหมาะสมสำหรับการถอดรหัสและการแปลในสิ่งมีชีวิตโฮสต์ที่ต้องการ หรือหากต้องการจำลองดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิตต่างชนิดกัน (เช่น การถ่ายโอนดีเอ็นเอจากแบคทีเรียไปยังพืช) ก็อาจเลือกเวกเตอร์ที่มีช่วงโฮสต์หลายช่วง (เรียกอีกอย่างว่าเวกเตอร์ชัตเติล ) อย่างไรก็ตาม ในทางปฏิบัติ การทดลองโคลนนิ่งโมเลกุลเฉพาะทางมักเริ่มต้นด้วยการโคลนนิ่งลงในพลาสมิดของแบคทีเรีย ตามด้วยการโคลนนิ่งย่อยลงในเวกเตอร์เฉพาะทาง

ไม่ว่าจะใช้การผสมผสานระหว่างโฮสต์และเวกเตอร์แบบใด เวกเตอร์มักจะประกอบด้วยส่วนของ DNA สี่ส่วนที่มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการทำงานและประโยชน์ในการทดลอง: ^{[ 3 ]}

• จุดเริ่มต้นของการจำลองดีเอ็นเอมีความจำเป็นสำหรับเวกเตอร์ (และลำดับรีคอมบิแนนท์ที่เชื่อมโยงอยู่) ในการจำลองตัวเองภายในสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน
• มีตำแหน่งจดจำของเอนไซม์ตัดจำเพาะอย่างน้อยหนึ่งตำแหน่งเพื่อทำหน้าที่เป็นตำแหน่งที่สามารถนำดีเอ็นเอจากภายนอกเข้ามาได้
• ยีนเครื่องหมายทางพันธุกรรมที่สามารถเลือกได้ซึ่งสามารถนำมาใช้เพื่อให้เซลล์ที่รับเอาลำดับเวกเตอร์เข้าไปสามารถอยู่รอดได้
• ยีนบ่งชี้ที่สามารถใช้ในการคัดกรองเซลล์ที่มีดีเอ็นเอแปลกปลอม

เวกเตอร์โคลนนิ่งจะถูกบำบัดด้วยเอนโดนิวคลีเอสจำกัดเพื่อตัด DNA ที่ตำแหน่งที่จะแทรก DNA ต่างประเทศ เอนไซม์จำกัดจะถูกเลือกเพื่อให้เกิดโครงสร้างที่ตำแหน่งการตัดที่เข้ากันได้กับปลายของ DNA ต่างประเทศ (ดูปลาย DNA ) โดยทั่วไปแล้ว จะทำได้โดยการตัด DNA ของเวกเตอร์และ DNA ต่างประเทศด้วยเอนไซม์จำกัดหรือเอนโดนิวคลีเอสจำกัดตัวเดียวกัน เช่นEcoRIและเอนไซม์จำกัดนี้ถูกแยกได้จาก E.coli ^{[ 11 ]}เวกเตอร์สมัยใหม่ส่วนใหญ่มีตำแหน่งการตัดที่สะดวกหลากหลายตำแหน่งซึ่งเป็นเอกลักษณ์ภายในโมเลกุลของเวกเตอร์ (เพื่อให้เวกเตอร์สามารถถูกตัดได้เพียงตำแหน่งเดียวเท่านั้น) และตั้งอยู่ในยีน (มักจะเป็นเบตา-กาแลคโตซิเดส ) ซึ่งการทำให้ไม่ทำงานสามารถใช้เพื่อแยกแยะสิ่งมีชีวิตลูกผสมออกจากสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่ลูกผสมในขั้นตอนต่อมาของกระบวนการ เพื่อปรับปรุงอัตราส่วนของสิ่งมีชีวิตลูกผสมต่อสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่ลูกผสม เวกเตอร์ที่ถูกตัดอาจได้รับการบำบัดด้วยเอนไซม์ ( อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส ) ที่กำจัดฟอสเฟตออกจากปลายเวกเตอร์ โมเลกุลเวกเตอร์ที่มีปลายที่ถูกกำจัดฟอสเฟตจะไม่สามารถจำลองตัวเองได้ และการจำลองตัวเองจะกลับมาได้ก็ต่อเมื่อมีการรวม DNA ต่างประเทศเข้าไปในตำแหน่งที่ถูกตัด^{[ 12 ]}

สำหรับการโคลนนิ่งดีเอ็นเอจีโนมิก ดีเอ็นเอที่จะโคลนนิ่งจะถูกสกัดจากสิ่งมีชีวิตที่สนใจ แทบทุกแหล่งเนื้อเยื่อสามารถนำมาใช้ได้ (แม้แต่เนื้อเยื่อจากสัตว์ที่สูญพันธุ์ไปแล้ว ) ^{[ 13 ]}ตราบใดที่ดีเอ็นเอไม่เสื่อมสภาพอย่างมาก จากนั้นดีเอ็นเอจะถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้วิธีง่ายๆ เพื่อกำจัดโปรตีนที่ปนเปื้อน (การสกัดด้วยฟีนอล) อาร์เอ็นเอ (ไรโบเอนไซม์) และโมเลกุลขนาดเล็ก (การตกตะกอนและ/หรือโครมาโทกราฟี) มักใช้วิธี ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) สำหรับการขยายลำดับดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอเฉพาะ ( RT-PCR ) ก่อนการโคลนนิ่งระดับโมเลกุล

ดีเอ็นเอสำหรับการทดลองโคลนนิ่งอาจได้มาจากอาร์เอ็นเอโดยใช้รีเวิร์สทรานสคริปเทส ( การโคลนนิ่ง ดีเอ็นเอเสริมหรือซีดีเอ็นเอ) หรือในรูปแบบของดีเอ็นเอสังเคราะห์ ( การสังเคราะห์ยีนเทียม ) การโคลนนิ่งซีดีเอ็นเอมักใช้เพื่อให้ได้โคลนที่เป็นตัวแทนของประชากรเอ็มอาร์เอ็นเอของเซลล์ที่สนใจ ในขณะที่ดีเอ็นเอสังเคราะห์ใช้เพื่อให้ได้ลำดับที่แม่นยำตามที่ผู้ออกแบบกำหนด ลำดับที่ออกแบบดังกล่าวอาจจำเป็นเมื่อย้ายยีนข้ามรหัสพันธุกรรม (ตัวอย่างเช่น จากไมโทคอนเดรียไปยังนิวเคลียส) ^{[ 14 ]}หรือเพียงเพื่อเพิ่มการแสดงออกผ่านการปรับโคดอนให้เหมาะสม^{[ 15 ]}

จากนั้น DNA ที่บริสุทธิ์จะถูกบำบัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะเพื่อสร้างชิ้นส่วนที่มีปลายที่สามารถเชื่อมต่อกับปลายของเวกเตอร์ได้ หากจำเป็น อาจมีการเพิ่มส่วนของ DNA สองสายสั้นๆ ( ตัวเชื่อม ) ที่มีไซต์ตัดจำเพาะที่ต้องการเพื่อสร้างโครงสร้างปลายที่เข้ากันได้กับเวกเตอร์^{[ 3 ] [ 12 ]}

การสร้างดีเอ็นเอลูกผสมนั้น ในหลายๆ ด้านถือเป็นขั้นตอนที่ง่ายที่สุดในกระบวนการโคลนนิ่งระดับโมเลกุล โดยนำดีเอ็นเอที่เตรียมจากเวกเตอร์และแหล่งภายนอกมาผสมกันในความเข้มข้นที่เหมาะสม แล้วนำไปสัมผัสกับเอนไซม์ ( ดีเอ็นเอไลเกส ) ซึ่งจะเชื่อมปลายทั้งสองเข้าด้วยกันด้วยพันธะโควาเลนต์ ปฏิกิริยาการเชื่อมต่อนี้มักเรียกว่าไลเกชันส่วนผสมของดีเอ็นเอที่ได้ซึ่งมีปลายเชื่อมต่อกันแบบสุ่มนั้น พร้อมที่จะนำไปนำเข้าสู่สิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านแล้ว

DNA ligase จะจดจำและทำงานเฉพาะที่ปลายของโมเลกุล DNA เชิงเส้นเท่านั้น ซึ่งโดยปกติจะส่งผลให้เกิดส่วนผสมที่ซับซ้อนของโมเลกุล DNA ที่มีปลายเชื่อมต่อกันแบบสุ่ม ผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ (DNA เวกเตอร์ที่เชื่อมต่อกับ DNA ต่างประเทศด้วยพันธะโควาเลนต์) จะมีอยู่ แต่ลำดับอื่นๆ (เช่น DNA ต่างประเทศที่เชื่อมต่อกับตัวเอง DNA เวกเตอร์ที่เชื่อมต่อกับตัวเอง และการรวมกันในลำดับที่สูงกว่าของ DNA เวกเตอร์และ DNA ต่างประเทศ) ก็มักจะมีอยู่ด้วย ส่วนผสมที่ซับซ้อนนี้จะถูกคัดแยกในขั้นตอนต่อไปของกระบวนการโคลนนิ่ง หลังจากที่ส่วนผสม DNA ถูกนำเข้าสู่เซลล์^{[ 3 ] [ 12 ]}

ส่วนผสม DNA ซึ่งได้รับการจัดการในหลอดทดลองก่อนหน้านี้ จะถูกย้ายกลับเข้าไปในเซลล์ที่มีชีวิต ซึ่งเรียกว่าสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน วิธีการที่ใช้ในการนำ DNA เข้าสู่เซลล์นั้นมีหลากหลาย และชื่อที่ใช้กับขั้นตอนนี้ในกระบวนการโคลนนิ่งระดับโมเลกุลมักจะขึ้นอยู่กับวิธีการทดลองที่เลือก (เช่นการแปลง สภาพ การถ่ายทอด การถ่ายโอนการอิเล็กโทรโพเรชัน ) ^{[ 3 ] [ 12 ]}

เมื่อจุลินทรีย์สามารถรับและจำลอง DNA จากสภาพแวดล้อมในท้องถิ่นได้ กระบวนการนี้เรียกว่าการเปลี่ยนแปลง (transformation ) และเซลล์ที่อยู่ในสภาวะทางสรีรวิทยาที่สามารถรับ DNA ได้เรียกว่ามีความสามารถ (competent ) ^{[ 16 ]}ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม กระบวนการที่คล้ายคลึงกันของการนำ DNA เข้าสู่เซลล์มักเรียกว่าการถ่ายโอนยีน (transfection ) ทั้งการเปลี่ยนแปลงและการถ่ายโอนยีนมักต้องมีการเตรียมเซลล์ผ่านระบอบการเจริญเติบโตพิเศษและกระบวนการบำบัดทางเคมีซึ่งจะแตกต่างกันไปตามชนิดและประเภทของเซลล์ที่ใช้

อิเล็กโทรพอเรชันใช้พัลส์ไฟฟ้าแรงสูงเพื่อเคลื่อนย้าย DNA ข้ามเยื่อหุ้มเซลล์ (และผนังเซลล์ หากมี) ^{[ 17 ]}ในทางตรงกันข้ามทรานสดักชันเกี่ยวข้องกับการบรรจุ DNA ลงในอนุภาคที่ได้จากไวรัส และใช้อนุภาคคล้ายไวรัสเหล่านี้เพื่อนำ DNA ที่บรรจุอยู่ภายในเข้าสู่เซลล์ผ่านกระบวนการที่คล้ายกับการติดเชื้อไวรัส แม้ว่าอิเล็กโทรพอเรชันและทรานสดักชันจะเป็นวิธีการเฉพาะทางสูง แต่ก็อาจเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพที่สุดในการเคลื่อนย้าย DNA เข้าสู่เซลล์

ไม่ว่าจะใช้วิธีใด การนำดีเอ็นเอลูกผสมเข้าสู่สิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านที่เลือกมักจะเป็นกระบวนการที่มีประสิทธิภาพต่ำ กล่าวคือ มีเพียงเซลล์จำนวนเล็กน้อยเท่านั้นที่จะรับดีเอ็นเอเข้าไปได้ นักวิทยาศาสตร์ที่ทำการทดลองจัดการกับปัญหานี้โดยผ่านขั้นตอนการคัดเลือกทางพันธุกรรมเทียม ซึ่งเซลล์ที่ไม่รับดีเอ็นเอจะถูกฆ่าอย่างเลือกสรร และมีเพียงเซลล์ที่สามารถจำลองดีเอ็นเอที่มีเครื่องหมายยีนที่เลือกได้ซึ่งเข้ารหัสโดยเวกเตอร์เท่านั้นที่จะสามารถอยู่รอดได้^{[ 3 ] [ 12 ]}

เมื่อใช้เซลล์แบคทีเรียเป็นสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านตัวบ่งชี้การคัดเลือกมักจะเป็นยีนที่ให้ความต้านทานต่อยาปฏิชีวนะที่อาจฆ่าเซลล์เหล่านั้นได้ โดยทั่วไปคือแอมพิซิลลินเซลล์ที่มีพลาสมิดจะรอดชีวิตเมื่อสัมผัสกับยาปฏิชีวนะ ในขณะที่เซลล์ที่ไม่สามารถรับลำดับพลาสมิดได้จะตาย เมื่อใช้เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (เช่น เซลล์มนุษย์หรือเซลล์หนู) จะใช้กลยุทธ์ที่คล้ายกัน ยกเว้นว่ายีนตัวบ่งชี้ (ในกรณีนี้มักจะถูกเข้ารหัสเป็นส่วนหนึ่งของ คาสเซ็ต kanMX ) จะให้ความต้านทานต่อยาปฏิชีวนะเจเนติซิ น

เวกเตอร์สำหรับการโคลนนิ่งแบคทีเรียสมัยใหม่ (เช่นpUC19และอนุพันธ์ในภายหลัง รวมถึงเวกเตอร์ pGEM) ใช้ระบบการคัดกรองสีน้ำเงิน-ขาวเพื่อแยกแยะโคโลนี (โคลน) ของเซลล์ดัดแปลงพันธุกรรมออกจากโคโลนีที่ประกอบด้วยเวกเตอร์ดั้งเดิม (เช่น ดีเอ็นเอเวกเตอร์ที่ไม่มีลำดับรีคอมบิแนนท์แทรกอยู่) ในเวกเตอร์เหล่านี้ ดีเอ็นเอจากภายนอกจะถูกแทรกเข้าไปในลำดับที่เข้ารหัสส่วนสำคัญของเอนไซม์เบตา-กาแลคโตซิเดส ซึ่งกิจกรรมของเอนไซม์นี้ส่งผลให้เกิดโคโลนีสีน้ำเงินบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในการทดลองนี้ การแทรกดีเอ็นเอจากภายนอกเข้าไปในลำดับการเข้ารหัสของเบตา-กาแลคโตซิเดสจะทำให้เอนไซม์ไม่ทำงาน ดังนั้นโคโลนีที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอที่ถูกดัดแปลงพันธุกรรมจึงไม่มีสี (สีขาว) ด้วยเหตุนี้ นักทดลองจึงสามารถระบุและทำการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับโคลนแบคทีเรียดัดแปลงพันธุกรรมได้อย่างง่ายดาย ในขณะที่ละเลยโคลนที่ไม่มีดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์

ประชากรทั้งหมดของโคลนแต่ละตัวที่ได้จากการทดลองโคลนนิ่งระดับโมเลกุลมักเรียกว่าไลบรารี DNAไลบรารีอาจมีความซับซ้อนสูง (เช่น เมื่อโคลนนิ่ง DNA จีโนมทั้งหมดจากสิ่งมีชีวิต) หรือค่อนข้างเรียบง่าย (เช่น เมื่อย้ายชิ้นส่วน DNA ที่โคลนนิ่งไว้ก่อนหน้านี้ไปยังพลาสมิดอื่น) แต่เกือบทุกครั้งจำเป็นต้องตรวจสอบโคลนที่แตกต่างกันจำนวนมากเพื่อให้แน่ใจว่าได้โครงสร้าง DNA ที่ต้องการ ซึ่งสามารถทำได้โดยวิธีการทดลองที่หลากหลายมาก รวมถึงการใช้การผสมแบบไฮบริดของกรดนิวคลีอิกโพรบแอนติบอดีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเม อเร สการวิเคราะห์ชิ้นส่วนจำกัดและ/หรือการจัดลำดับ DNA ^{[ 3 ] [ 12 ]}

การโคลนนิ่งระดับโมเลกุลช่วยให้นักวิทยาศาสตร์สามารถเข้าถึงชิ้นส่วนดีเอ็นเอแต่ละชิ้นจากจีโนมใดๆ ก็ได้ในปริมาณที่แทบไม่จำกัด วัสดุนี้สามารถนำไปใช้ประโยชน์ได้หลากหลาย ทั้งในด้านวิทยาศาสตร์ชีวภาพพื้นฐานและประยุกต์ ตัวอย่างการใช้งานที่สำคัญบางส่วนได้สรุปไว้ในที่นี้

การโคลนนิ่งระดับโมเลกุลนำไปสู่การไขปริศนาลำดับดีเอ็นเอทั้งหมดของจีโนมของสิ่งมีชีวิตจำนวนมาก และการสำรวจความหลากหลายทางพันธุกรรมภายในแต่ละสายพันธุ์ ซึ่งส่วนใหญ่ทำได้โดยการกำหนดลำดับดีเอ็นเอของชิ้นส่วนจีโนมที่ถูกโคลนแบบสุ่มจำนวนมาก และนำลำดับที่ซ้อนทับกันมาประกอบเข้าด้วยกัน

ในระดับยีนแต่ละตัว โคลนโมเลกุลถูกนำมาใช้สร้างโพรบที่ใช้ในการตรวจสอบว่ายีนแสดงออก อย่างไร และการแสดงออกนั้นเกี่ยวข้องกับกระบวนการอื่นๆ ในทางชีววิทยาอย่างไร รวมถึงสภาพแวดล้อมทางเมตาบอลิซึม สัญญาณภายนอกเซลล์ การพัฒนา การเรียนรู้ ความชรา และการตายของเซลล์ ยีนที่ถูกโคลนยังสามารถเป็นเครื่องมือในการตรวจสอบหน้าที่ทางชีววิทยาและความสำคัญของยีนแต่ละตัวได้ โดยอนุญาตให้นักวิจัยปิด ใช้ งานยีน หรือทำการกลายพันธุ์ที่ละเอียดอ่อนยิ่งขึ้นโดยใช้การกลายพันธุ์เฉพาะบริเวณหรือการกลายพันธุ์แบบกำหนด ตำแหน่ง ยีนที่ถูกโคลนลงในเวกเตอร์สำหรับการแสดงออกเพื่อการโคลนเชิงหน้าที่นั้นเป็นวิธีการคัดกรองยีนโดยพิจารณาจากหน้าที่ของโปรตีนที่แสดงออก

การได้มาซึ่งโคลนโมเลกุลของยีนสามารถนำไปสู่การพัฒนาสิ่งมีชีวิตที่ผลิตโปรตีนซึ่งเป็นผลผลิตของยีนที่ถูกโคลน เรียกว่าโปรตีนลูกผสม ในทางปฏิบัติ การพัฒนาสิ่งมีชีวิตที่ผลิตโปรตีนลูกผสมในรูปแบบที่ออกฤทธิ์ได้ในปริมาณที่ต้องการนั้นมักจะยากกว่าการโคลนยีนเสียอีก เนื่องจากสัญญาณโมเลกุลสำหรับการแสดงออกของยีนนั้นซับซ้อนและแปรผันได้ และเนื่องจากการพับตัว ความเสถียร และการขนส่งของโปรตีนนั้นอาจเป็นเรื่องที่ท้าทายมาก

ปัจจุบันมีโปรตีนที่มีประโยชน์หลายชนิดในรูปแบบผลิตภัณฑ์รีคอมบิแนนท์ซึ่งรวมถึง (1) โปรตีนที่มีประโยชน์ทางการแพทย์ซึ่งการให้ยาสามารถแก้ไขยีนที่บกพร่องหรือแสดงออกได้ไม่ดี (เช่นปัจจัย VIII รีคอมบิแนนท์ ซึ่งเป็นปัจจัยการแข็งตัวของเลือดที่ขาดในโรคฮีโมฟีเลีย บางรูปแบบ [ ^{18 ]}และอินซูลิน รีคอมบิแนนท์ ซึ่งใช้ในการรักษา โรคเบาหวานบางรูปแบบ^{[ 19 ] ) ( 2} ) โปรตีนที่สามารถให้ยาเพื่อช่วยเหลือในกรณีฉุกเฉินที่คุกคามชีวิต (เช่นตัวกระตุ้นพลาสมิโนเจนในเนื้อเยื่อซึ่งใช้ในการรักษาโรคหลอดเลือดสมอง^{[ 20 ]} ) (3) วัคซีนย่อยรีคอมบิแนนท์ ซึ่งโปรตีนบริสุทธิ์สามารถใช้ในการสร้างภูมิคุ้มกันให้กับผู้ป่วยต่อโรคติดเชื้อ โดยไม่ต้องให้ผู้ป่วยสัมผัสกับเชื้อโรคโดยตรง (เช่นวัคซีนไวรัสตับอักเสบ B ^{[ 21 ]} ) และ (4) โปรตีนรีคอมบิแนนท์เป็นวัสดุมาตรฐานสำหรับการทดสอบทางห้องปฏิบัติการเพื่อการวินิจฉัย

เมื่อระบุลักษณะและจัดการเพื่อให้สัญญาณสำหรับการแสดงออกที่เหมาะสมแล้ว ยีนที่ถูกโคลนอาจถูกแทรกเข้าไปในสิ่งมีชีวิต ทำให้เกิดสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม หรือที่เรียกว่าสิ่งมีชีวิตที่ดัดแปลงพันธุกรรม (GMOs) แม้ว่า GMOs ส่วนใหญ่จะถูกสร้างขึ้นเพื่อวัตถุประสงค์ในการวิจัยทางชีววิทยาขั้นพื้นฐาน (ดูตัวอย่างเช่นหนูทรานส์เจนิก ) แต่ก็มีการพัฒนา GMOs จำนวนหนึ่งเพื่อใช้ในเชิงพาณิชย์ ตั้งแต่สัตว์และพืชที่ผลิตยาหรือสารประกอบอื่นๆ ( การผลิตยา ) พืชผลที่ต้านทานสารกำจัดวัชพืชและปลาเขตร้อนเรืองแสง ( GloFish ) สำหรับความบันเทิงในบ้าน^{[ 1 ]}

การบำบัดด้วยยีนเกี่ยวข้องกับการให้ยีนที่ทำงานได้กับเซลล์ที่ขาดการทำงานนั้น โดยมีเป้าหมายเพื่อแก้ไขความผิดปกติทางพันธุกรรมหรือโรคที่เกิดขึ้นภายหลัง การบำบัดด้วยยีนสามารถแบ่งออกได้เป็นสองประเภทใหญ่ๆ ประเภทแรกคือการเปลี่ยนแปลงเซลล์สืบพันธุ์ นั่นคืออสุจิหรือไข่ ซึ่งส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมอย่างถาวรสำหรับสิ่งมีชีวิตทั้งหมดและรุ่นต่อๆ ไป การบำบัดด้วยยีนในเซลล์สืบพันธุ์นี้ถือว่าไม่เหมาะสมในมนุษย์^{[ 22 ]}ประเภทที่สองของการบำบัดด้วยยีนคือ "การบำบัดด้วยยีนในเซลล์ร่างกาย" ซึ่งคล้ายกับการปลูกถ่ายอวัยวะ ในกรณีนี้ เนื้อเยื่อเฉพาะอย่างน้อยหนึ่งชนิดจะถูกกำหนดเป้าหมายโดยการรักษาโดยตรงหรือโดยการนำเนื้อเยื่อออก การเพิ่มยีนบำบัดในห้องปฏิบัติการ และการคืนเซลล์ที่ได้รับการรักษาให้กับผู้ป่วย การทดลองทางคลินิกของการบำบัดด้วยยีนในเซลล์ร่างกายเริ่มขึ้นในช่วงปลายทศวรรษ 1990 ส่วนใหญ่เพื่อรักษาโรคมะเร็งและโรคเกี่ยวกับเลือด ตับ และปอด^{[ 23 ]}

แม้จะมีการประชาสัมพันธ์และคำสัญญามากมาย แต่ประวัติศาสตร์ของการบำบัดด้วยยีนในมนุษย์กลับประสบความสำเร็จค่อนข้างจำกัด^{[ 23 ]}ผลของการนำยีนเข้าไปในเซลล์มักจะช่วยบรรเทาอาการของโรคที่กำลังรักษาได้เพียงบางส่วนและ/หรือชั่วคราวเท่านั้น ผู้ป่วยที่เข้าร่วมการทดลองบำบัดด้วยยีนบางรายประสบกับผลข้างเคียงจากการรักษาเอง รวมถึงการเสียชีวิต ในบางกรณี ผลข้างเคียงเกิดจากการรบกวนยีนที่จำเป็นภายในจีโนมของผู้ป่วยโดยการทำให้ไม่ทำงานโดยการแทรก ในกรณีอื่นๆ เวกเตอร์ไวรัสที่ใช้ในการบำบัดด้วยยีนปนเปื้อนด้วยไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อ อย่างไรก็ตาม การบำบัดด้วยยีนยังคงถือเป็นสาขาการแพทย์ที่มีอนาคตสดใส และเป็นสาขาที่มีกิจกรรมการวิจัยและพัฒนาในระดับสูง

• การโคลนนิ่งประตูทองคำ

• สื่อที่เกี่ยวข้องกับการโคลนนิ่งระดับโมเลกุลในวิกิมีเดียคอมมอนส์