เทคนิคทางวิศวกรรมพันธุกรรมช่วยให้สามารถดัดแปลงจีโนมของสัตว์และพืช ได้ มีการคิดค้นเทคนิคต่างๆ เพื่อแทรก ลบ และดัดแปลงดีเอ็นเอในหลายระดับ ตั้งแต่คู่เบส เฉพาะ ในยีน เฉพาะ ไปจนถึงยีนทั้งหมด มีขั้นตอนหลายขั้นตอนที่ต้องปฏิบัติตามก่อนที่จะสร้างสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (GMO) วิศวกรพันธุกรรมต้องเลือก ยีนที่ต้องการแทรก ดัดแปลง หรือลบก่อน จากนั้นต้องแยกยีนนั้นออกมาและนำไปรวมกับองค์ประกอบทางพันธุกรรมอื่นๆ ลงในเวกเตอร์ ที่เหมาะสม เวกเตอร์นี้จะถูกนำไปใช้ในการแทรกยีนเข้าไปในจีโนมของโฮสต์ ทำให้เกิดสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรมหรือสิ่งมีชีวิตที่ได้รับการแก้ไข

ความสามารถในการดัดแปลงพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตนั้นสร้างขึ้นจากงานวิจัยและการค้นพบเกี่ยวกับหน้าที่และการจัดการยีนมานานหลายปี ความก้าวหน้าที่สำคัญได้แก่ การค้นพบเอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzymes ) เอนไซม์เชื่อมดีเอ็นเอ ( DNA ligases)และการพัฒนาปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (polymerase chain reaction)และการจัดลำดับดีเอ็นเอ (sequencing )

ยีนที่ถูกเพิ่มเข้าไปมักมาพร้อมกับ บริเวณ โปรโมเตอร์และเทอร์มิเนเตอร์รวมถึง ยีน เครื่องหมายที่สามารถเลือกได้ยีนที่เพิ่มเข้าไปนั้นอาจได้รับการดัดแปลงเพื่อให้แสดงออกได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น จากนั้นเวกเตอร์นี้จะถูกแทรกเข้าไปในจีโนมของสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน สำหรับสัตว์ ยีนมักจะถูกแทรกเข้าไปในเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนในขณะที่ในพืช ยีนสามารถถูกแทรกเข้าไปในเนื้อเยื่อใดก็ได้ที่สามารถเพาะเลี้ยงจนเจริญเติบโตเป็นพืชที่สมบูรณ์ได้

มีการทดสอบกับสิ่งมีชีวิตที่ได้รับการดัดแปลงเพื่อให้แน่ใจว่ามีการบูรณาการ การถ่ายทอดและการแสดงออกที่เสถียร ลูกหลานรุ่นแรกจะเป็นเฮเทอโรไซกัสจึงจำเป็นต้องผสมพันธุ์กันเองเพื่อให้ได้รูปแบบโฮโมไซกัสที่จำเป็นสำหรับการถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่เสถียร ต้องยืนยันความเป็นโฮโมไซกัสในตัวอย่างรุ่นที่สอง

เทคนิคในยุคแรกๆ จะสุ่มแทรกยีนเข้าไปในจีโนม ความก้าวหน้าในปัจจุบันทำให้สามารถกำหนดเป้าหมายไปยังตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจงได้ ซึ่งช่วยลดผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ เทคนิคในยุคแรกๆ อาศัย เมกะนิวคลีเอ สและนิวคลีเอสแบบซิงค์ฟิงเกอร์ตั้งแต่ปี 2009 เป็นต้นมา ได้มีการพัฒนาระบบที่แม่นยำและใช้งานง่ายกว่านิวคลีเอสแบบทรานสคริปชันแอคติเวเตอร์ไลค์เอฟเฟคเตอร์ (TALENs) และระบบ Cas9-guideRNA (ดัดแปลงมาจากCRISPR ) เป็นสองระบบที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุด

การค้นพบและความก้าวหน้าต่างๆ มากมายนำไปสู่การพัฒนาด้านวิศวกรรมพันธุกรรมการดัดแปลงพันธุกรรมโดยมนุษย์เริ่มต้นจาก การนำ พืชและสัตว์ มา เลี้ยง โดย การคัดเลือกโดยมนุษย์เมื่อราว 12,000 ปีก่อนคริสตกาล^{[ 1 ] : 1} มีการพัฒนาเทคนิคต่างๆ เพื่อช่วยในการผสมพันธุ์และการคัดเลือกการผสมข้ามสายพันธุ์เป็นวิธีหนึ่งที่สามารถนำมาซึ่งการเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วในองค์ประกอบทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต การผสมข้ามสายพันธุ์ของพืชน่าจะเกิดขึ้นครั้งแรกเมื่อมนุษย์เริ่มปลูกสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะทางพันธุกรรมแตกต่างกันของสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องในบริเวณใกล้เคียงกัน^{[ 2 ] : 32} พืชบางชนิดสามารถขยายพันธุ์ได้โดยการโคลนนิ่งแบบไม่อาศัยเพศ [ ^{2 ] : 31}

การถ่ายทอดทางพันธุกรรมถูกค้นพบครั้งแรกโดยเกรเกอร์ เมนเดลในปี พ.ศ. 2408 หลังจากการทดลองผสมพันธุ์ถั่ว^{[ 3 ]}ในปี พ.ศ. 2461 เฟรเดอริก กริฟฟิธได้พิสูจน์การมีอยู่ของ "หลักการเปลี่ยนแปลง" ที่เกี่ยวข้องกับการถ่ายทอดทางพันธุกรรม ซึ่งต่อมาได้รับการระบุว่าเป็น DNA ในปี พ.ศ. 2487 โดยออสวาลด์ เอเวอรี, โคลิน แมคลีโอ และแมคลิน แมคคาร์ตีเฟรเดอริก แซงเกอร์ได้พัฒนาวิธีการจัดลำดับ DNA ในปี พ.ศ. 2520 ซึ่งช่วยเพิ่มข้อมูลทางพันธุกรรมที่มีให้แก่นักวิจัยอย่างมาก

หลังจากค้นพบการมีอยู่และคุณสมบัติของDNAแล้ว จำเป็นต้องมีการพัฒนาเครื่องมือที่ช่วยให้สามารถจัดการกับ DNA ได้ ในปี 1970 ห้องปฏิบัติการของ Hamilton Smith ได้ค้นพบ เอนไซม์ตัดจำเพาะซึ่งทำให้นักวิทยาศาสตร์สามารถแยกยีนออกจากจีโนมของสิ่งมีชีวิตได้^{[ 4 ]}เอนไซม์ DNA ligaseซึ่งเชื่อมต่อ DNA ที่ขาดเข้าด้วยกัน ถูกค้นพบก่อนหน้านั้นในปี 1967 ^{[ 5 ]}การรวมเอนไซม์ทั้งสองเข้าด้วยกันทำให้สามารถ "ตัดและวาง" ลำดับ DNA เพื่อสร้างDNA ลูกผสมได้พลาสมิดซึ่งถูกค้นพบในปี 1952 ^{[ 6 ]} กลายเป็น เครื่องมือสำคัญสำหรับการถ่ายทอดข้อมูลระหว่างเซลล์และการจำลองลำดับ DNA ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ซึ่งพัฒนาโดยKary Mullisในปี 1983 ทำให้สามารถขยาย (จำลอง) ส่วนเล็ก ๆ ของ DNA และช่วยในการระบุและแยกวัสดุทางพันธุกรรมได้

นอกจากการจัดการ DNA แล้ว ยังต้องมีการพัฒนาเทคนิคสำหรับการแทรก DNA เข้าไปในจีโนมของสิ่งมีชีวิต การทดลองของ Griffith ได้แสดงให้เห็นแล้วว่าแบคทีเรียบางชนิดมีความสามารถในการดูดซับและแสดงออก DNA จากภายนอกได้เองตามธรรมชาติความสามารถในการรับ DNA จากภายนอกถูกเหนี่ยวนำในEscherichia coliในปี 1970 โดยการบำบัดด้วยสารละลายแคลเซียมคลอไร_ด์( CaCl2 ) ^{[ 7 ]}การเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมโดยใช้อิเล็กโทรโพเรชันได้รับการพัฒนาในช่วงปลายทศวรรษ 1980 ซึ่งเพิ่มประสิทธิภาพและขอบเขตของแบคทีเรีย^{[ 8 ]}ในปี 1907 มีการค้นพบแบคทีเรียที่ทำให้เกิดเนื้องอกในพืช Agrobacterium tumefaciens ในช่วงต้นทศวรรษ 1970 พบว่าแบคทีเรียชนิดนี้แทรก DNA ของมันเข้าไปในพืชโดยใช้ พลาส มิดTi ^{[ 9 ]}โดยการกำจัดยีนในพลาสมิดที่ทำให้เกิดเนื้องอกและเพิ่มยีนใหม่เข้าไป นักวิจัยสามารถทำให้พืชติดเชื้อA. tumefaciensและปล่อยให้แบคทีเรียแทรก DNA ที่เลือกเข้าไปในจีโนมของพืชได้^{[ 10 ]}

ขั้นตอนแรกคือการระบุยีนเป้าหมายที่จะแทรกเข้าไปในสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน โดยมีเป้าหมายเพื่อสิ่งมีชีวิตที่จะได้ ในบางกรณีอาจมีเพียงหนึ่งหรือสองยีนเท่านั้นที่ได้รับผลกระทบ สำหรับเป้าหมายที่ซับซ้อนกว่านั้น อาจเกี่ยวข้องกับ วิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพ ทั้งหมด ซึ่งเกี่ยวข้องกับยีนหลายตัว เมื่อพบยีนและข้อมูลทางพันธุกรรมอื่นๆ จากสิ่งมีชีวิตหลากหลายชนิดแล้ว ก็สามารถแทรกเข้าไปในแบคทีเรียเพื่อเก็บรักษาและดัดแปลง ทำให้เกิดแบคทีเรียที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมขึ้นแบคทีเรียมีราคาถูก เพาะเลี้ยงง่ายขยายพันธุ์ได้เร็ว เปลี่ยนแปลงได้ค่อนข้างง่าย และสามารถเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ -80 °C ได้เกือบตลอดไป เมื่อแยกยีนออกมาได้แล้ว ก็สามารถเก็บไว้ภายในแบคทีเรียได้ ทำให้มีแหล่งยีนสำหรับการวิจัยอย่างไม่จำกัด^{[ 11 ]}

สามารถดำเนินการคัดกรองทางพันธุกรรม เพื่อกำหนดศักยภาพของยีน ตามด้วยการทดสอบอื่นๆ ที่ระบุผู้สมัครที่ดีที่สุด การคัดกรองแบบง่ายๆ เกี่ยวข้องกับ การกลายพันธุ์ของ DNA แบบสุ่มด้วยสารเคมีหรือรังสี แล้วเลือกตัวที่แสดงลักษณะที่ต้องการ สำหรับสิ่งมีชีวิตที่ไม่สามารถทำการกลายพันธุ์ได้ นักวิทยาศาสตร์จะมองหาบุคคลในประชากรที่แสดงลักษณะดังกล่าวผ่านการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ กระบวนการที่พิจารณาฟีโนไทป์แล้วพยายามระบุยีนที่รับผิดชอบเรียกว่าพันธุศาสตร์แบบไปข้างหน้าจากนั้นจำเป็นต้องทำแผนที่ ยีน โดยการเปรียบเทียบการถ่ายทอดลักษณะฟีโนไทป์กับเครื่องหมายทางพันธุกรรม ที่รู้จัก ยีนที่อยู่ใกล้กันมีแนวโน้มที่จะถูกถ่ายทอดไปด้วยกัน^{[ 12 ]}

อีกทางเลือกหนึ่งคือพันธุศาสตร์ย้อนกลับวิธีนี้เกี่ยวข้องกับการกำหนดเป้าหมายยีนเฉพาะด้วยการกลายพันธุ์แล้วสังเกตฟีโนไทป์ที่พัฒนาขึ้น^{[ 12 ]}การกลายพันธุ์สามารถออกแบบให้ยีนไม่ทำงานหรืออนุญาตให้ทำงานได้ภายใต้เงื่อนไขบางอย่างเท่านั้นการกลายพันธุ์แบบมีเงื่อนไขมีประโยชน์สำหรับการระบุยีนที่ปกติแล้วจะเป็นอันตรายถึงชีวิตหากไม่ทำงาน^{[ 13 ]}เนื่องจากยีนที่มีฟังก์ชันคล้ายกันมีลำดับที่คล้ายกัน ( โฮโมล็อกัส ) จึงเป็นไปได้ที่จะทำนายฟังก์ชันที่เป็นไปได้ของยีนโดยการเปรียบเทียบลำดับของยีนกับยีนที่ได้ รับการศึกษามาอย่างดีจากสิ่งมีชีวิตต้นแบบ^{[ 12 ]}การพัฒนาไมโครอาร์เรย์ทรานสคริปโตม และการจัดลำดับจีโนมทำให้การค้นหายีนที่ต้องการทำได้ง่ายขึ้นมาก^{[ 14 ]}

แบคทีเรียBacillus thuringiensisถูกค้นพบครั้งแรกในปี 1901 ในฐานะสาเหตุของการตายของหนอนไหมเนื่องจากคุณสมบัติในการฆ่าแมลง แบคทีเรียชนิดนี้จึงถูกนำมาใช้เป็นยาฆ่าแมลงชีวภาพและได้รับการพัฒนาในเชิงพาณิชย์ในปี 1938 โปรตีน cryถูกค้นพบว่ามีฤทธิ์ในการฆ่าแมลงในปี 1956 และในช่วงทศวรรษ 1980 นักวิทยาศาสตร์ได้โคลนยีนที่เข้ารหัสโปรตีนนี้และแสดงออกในพืชได้สำเร็จ^{[ 15 ]} ยีนที่ให้ความต้านทานต่อสารกำจัดวัชพืชไกลโฟเสตถูกค้นพบหลังจากค้นหาเป็นเวลาเจ็ดปีในแบคทีเรียที่อาศัยอยู่ในท่อระบายน้ำของโรงงานผลิตRoundUp ของ Monsanto ^{[ 16 ]}ในสัตว์ ยีนส่วนใหญ่ที่ใช้คือยีนฮอร์โมนการเจริญเติบโต^{[ 17 ]}

กระบวนการทางวิศวกรรมพันธุกรรมทั้งหมดเกี่ยวข้องกับการดัดแปลงดีเอ็นเอ ในอดีต ดีเอ็นเอถูกแยกออกมาจากเซลล์ของสิ่งมีชีวิต ต่อมา ยีนถูกโคลนจากส่วนของดีเอ็นเอหลังจากการสร้างคลังดีเอ็นเอหรือถูกสังเคราะห์ขึ้นเองเมื่อแยกยีนออกมาแล้ว จะมีการเพิ่มองค์ประกอบทางพันธุกรรมเพิ่มเติมเข้าไปในยีนเพื่อให้สามารถแสดงออกในสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านและเพื่อช่วยในการคัดเลือก

ขั้นแรก เซลล์จะต้องถูกเปิดออก อย่างเบามือ เพื่อให้ DNA ปรากฏออกมาโดยไม่ทำให้เสียหายมากเกินไป วิธีการที่ใช้จะแตกต่างกันไปตามชนิดของเซลล์ เมื่อเซลล์เปิดออกแล้ว DNA จะต้องถูกแยกออกจากส่วนประกอบอื่นๆ ของเซลล์ เซลล์ที่แตกจะมีโปรตีนและเศษเซลล์อื่นๆ อยู่ การผสมกับฟีนอลและ/หรือคลอโรฟอร์มตามด้วยการปั่นเหวี่ยง จะทำให้สามารถแยกกรดนิวคลีอิกออกจากเศษเหล่านี้ไปอยู่ใน เฟสของเหลวส่วนบนได้เฟสของเหลวนี้สามารถนำออกและทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมได้หากจำเป็น โดยการทำซ้ำขั้นตอนฟีนอล-คลอโรฟอร์ม จากนั้นกรดนิวคลีอิกสามารถตกตะกอนออกจากสารละลายในน้ำได้โดยใช้เอทานอลหรือไอโซโพรพานอลRNAใดๆสามารถกำจัดออกได้โดยการเติมไรโบเอนไซม์ที่จะย่อยสลายมัน ปัจจุบันมีหลายบริษัทจำหน่ายชุดอุปกรณ์ที่ทำให้กระบวนการนี้ง่ายขึ้น^{[ 18 ]}

ยีนที่นักวิจัยต้องการดัดแปลง (เรียกว่ายีนที่สนใจ) จะต้องถูกแยกออกจากดีเอ็นเอที่สกัดออกมา หากไม่ทราบลำดับของยีน วิธีทั่วไปคือการตัดแบ่งดีเอ็นเอด้วยวิธีการย่อยแบบสุ่ม ซึ่งโดยปกติจะทำโดยใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะ (เอนไซม์ที่ตัดดีเอ็นเอ) การย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ แบบบางส่วน จะตัดเฉพาะบางตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ ทำให้ได้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ซ้อนทับกัน ชิ้นส่วนดีเอ็นเอเหล่านี้จะถูกใส่ลงในเวกเตอร์พลาสมิด แต่ละตัว และนำไปเพาะเลี้ยงในแบคทีเรีย เมื่ออยู่ในแบคทีเรียแล้ว พลาสมิดจะถูกคัดลอกเมื่อแบคทีเรียแบ่งตัวเพื่อตรวจสอบว่ามียีนที่มีประโยชน์อยู่ในชิ้นส่วนใดชิ้นส่วนหนึ่งหรือไม่ จะทำการตรวจสอบไลบรารีดีเอ็นเอเพื่อหาลักษณะ ที่ต้องการ หากตรวจพบลักษณะดังกล่าว ก็เป็นไปได้ว่าแบคทีเรียนั้นมีเป้าหมายยีนอยู่

หากยีนไม่มีฟีโนไทป์ที่ตรวจจับได้ หรือไลบรารี DNA ไม่มียีนที่ถูกต้อง จะต้องใช้วิธีอื่นในการแยกยีนนั้น หากสามารถกำหนดตำแหน่งของยีนได้โดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลการเดินโครโมโซมก็เป็นวิธีหนึ่งในการแยกชิ้นส่วน DNA ที่ถูกต้อง หากยีนแสดงความเหมือนกัน อย่างใกล้ชิด กับยีนที่รู้จักในสปีชีส์อื่น ก็สามารถแยกยีนนั้นได้โดยการค้นหายีนในไลบรารีที่ตรงกับยีนที่รู้จักอย่างใกล้ชิด^{[ 19 ]}

สำหรับลำดับ DNA ที่ทราบแล้ว สามารถใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะที่ตัด DNA ทั้งสองด้านของยีนได้ จากนั้นเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสจะแยกชิ้นส่วนตามความยาว^{[ 20 ]}เจลบางชนิดสามารถแยกลำดับที่แตกต่างกันเพียงคู่เบส เดียว ได้ สามารถมองเห็น DNA ได้โดยการย้อมด้วยเอทิเดียมโบรไมด์และถ่ายภาพภายใต้แสง UV สามารถวางตัว บ่งชี้ที่มีชิ้นส่วนที่มีความยาวที่ทราบแล้วไว้ข้างๆ DNA เพื่อประมาณขนาดของแต่ละแถบ แถบ DNA ที่มีขนาดที่ถูกต้องควรมียีนอยู่ ซึ่งสามารถตัดออกจากเจลได้^{[ 18 ] : 40–41} เทคนิคอีกอย่างหนึ่งในการแยกยีนที่มีลำดับที่ทราบแล้วเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ^{[ 21 ]} PCR เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพที่สามารถขยายลำดับที่กำหนด ซึ่งสามารถแยกได้โดยผ่านเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส ประสิทธิภาพของมันลดลงเมื่อยีนมีขนาดใหญ่ขึ้น และมีศักยภาพที่จะทำให้เกิดข้อผิดพลาดในลำดับได้

เป็นไปได้ที่จะสังเคราะห์ยีนเทียม^{[ 22 ]}ลำดับสังเคราะห์บางส่วนมีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ โดยไม่ต้องผ่านขั้นตอนเบื้องต้นเหล่านี้^{[ 23 ]}

ยีนที่จะแทรกต้องรวมเข้ากับองค์ประกอบทางพันธุกรรมอื่นๆ เพื่อให้ทำงานได้อย่างถูกต้อง ยีนสามารถถูกดัดแปลงได้ในขั้นตอนนี้เพื่อให้แสดงออกได้ดีขึ้นหรือมีประสิทธิภาพมากขึ้น นอกจากยีนที่จะแทรกแล้วโครงสร้าง ส่วนใหญ่ ยังประกอบด้วย บริเวณ โปรโมเตอร์และเทอร์มิเนเตอร์รวมถึง ยีน เครื่องหมายที่เลือกได้บริเวณโปรโมเตอร์จะเริ่มต้นการถอดรหัสของยีนและสามารถใช้ควบคุมตำแหน่งและระดับการแสดงออกของยีน ในขณะที่บริเวณเทอร์มิเนเตอร์จะยุติการถอดรหัส เครื่องหมายที่เลือกได้ ซึ่งในกรณีส่วนใหญ่จะทำให้ สิ่งมีชีวิตที่แสดงออก มีความต้านทานต่อยาปฏิชีวนะจะถูกใช้เพื่อกำหนดว่าเซลล์ใดจะถูกแปลงสภาพด้วยยีนใหม่ โครงสร้างเหล่านี้สร้างขึ้นโดยใช้ เทคนิค ดีเอ็นเอลูกผสมเช่นการย่อยด้วยเอนไซม์จำกัดการเชื่อมต่อและ การ โคลนนิ่งระดับโมเลกุล^{[ 24 ]}

เมื่อสร้างยีนแล้ว จะต้องรวมยีนนั้นเข้ากับจีโนมของสิ่งมีชีวิตเป้าหมายอย่างเสถียร หรือมีอยู่เป็นดีเอ็นเอนอกโครโมโซมมีเทคนิคหลายอย่างที่ใช้ในการแทรกยีนเข้าไปในจีโนมของโฮสต์ และเทคนิคเหล่านี้จะแตกต่างกันไปตามชนิดของสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย ในยูคาริโอต หลายเซลล์ หากทรานส์ยีน ถูกรวมเข้ากับเซลล์ สืบพันธุ์ของโฮสต์ เซลล์โฮสต์ที่ได้จะสามารถส่งต่อทรานส์ยีนไปยังลูกหลานได้ หากทรานส์ยีนถูกรวมเข้ากับ เซลล์ ร่างกายทรานส์ยีนนั้นจะไม่สามารถถ่ายทอดทางพันธุกรรมได้^{[ 25 ]}

การเปลี่ยนแปลงคือการเปลี่ยนแปลงโดยตรงของส่วนประกอบทางพันธุกรรมของเซลล์โดยการส่งผ่านสารพันธุกรรมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรียประมาณ 1% สามารถรับ DNA จากภายนอกได้ ตามธรรมชาติ แต่ความสามารถนี้สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดขึ้นในแบคทีเรียอื่นๆ ได้^{[ 26 ]}การทำให้แบคทีเรียเกิดความเครียดด้วยความร้อนช็อกหรืออิเล็กโทรโพเรชันสามารถทำให้เยื่อหุ้มเซลล์ซึมผ่าน DNA ได้ ซึ่งอาจถูกรวมเข้ากับจีโนมหรือมีอยู่เป็น DNA นอกโครโมโซม โดยทั่วไปเซลล์จะถูกบ่มในสารละลายที่มีไอออนบวกสองวาเลนซ์ (มักเป็นแคลเซียมคลอไรด์ ) ภายใต้สภาวะเย็น ก่อนที่จะสัมผัสกับความร้อน (ความร้อนช็อก) แคลเซียมคลอไรด์จะทำลายเยื่อหุ้มเซลล์บางส่วน ซึ่งทำให้ DNA รีคอมบิแนนท์สามารถเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านได้ มีข้อเสนอแนะว่าการทำให้เซลล์สัมผัสกับไอออนบวกสองวาเลนซ์ในสภาวะเย็นอาจเปลี่ยนแปลงหรือทำให้โครงสร้างพื้นผิวเซลล์อ่อนแอลง ทำให้ซึมผ่าน DNA ได้มากขึ้น ความร้อนช็อกนั้นเชื่อว่าจะสร้างความไม่สมดุลทางความร้อนทั่วเยื่อหุ้มเซลล์ ซึ่งบังคับให้ DNA เข้าสู่เซลล์ผ่านรูพรุนของเซลล์หรือผนังเซลล์ที่เสียหาย การใช้กระแสไฟฟ้า กระตุ้น (Electroporation)เป็นอีกวิธีหนึ่งในการส่งเสริมความสามารถในการรับดีเอ็นเอของแบคทีเรีย วิธีนี้ใช้กระแสไฟฟ้ากระตุ้นเซลล์เป็นเวลาสั้นๆ ด้วยสนามไฟฟ้าขนาด 10-20 kV /cm ซึ่งเชื่อว่าจะสร้างรูในเยื่อหุ้มเซลล์ ทำให้ดีเอ็นเอพลาสมิดสามารถเข้าไปได้ หลังจากการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า รูเหล่านั้นจะถูกปิดอย่างรวดเร็วโดยกลไกการซ่อมแซมเยื่อหุ้มเซลล์ ดีเอ็นเอที่ถูกรับเข้าไปอาจรวมเข้ากับจีโนมของแบคทีเรีย หรือที่พบได้บ่อยกว่าคือ อยู่ในรูปของดีเอ็นเอภายนอกโครโมโซม

ในพืช ดีเอ็นเอมักจะถูกแทรกโดยใช้การรวมตัวใหม่โดยอาศัยAgrobacterium [ ^{27 ]}โดยใช้ประโยชน์จาก ลำดับ T-DNAของAgrobacteriumที่ช่วยให้สามารถแทรกสารพันธุกรรมเข้าไปในเซลล์พืชได้ตามธรรมชาติ^{[ 28 ] เนื้อเยื่อ}พืชจะถูกตัดเป็นชิ้นเล็กๆ และแช่ในของเหลวที่มีAgrobacterium แขวนลอยอยู่ แบคทีเรียจะเกาะติดกับเซลล์พืชจำนวนมากที่ถูกเปิดออกโดยรอยตัด แบคทีเรียใช้การถ่ายทอดยีนเพื่อถ่ายโอนส่วนของดีเอ็นเอที่เรียกว่าT-DNAจากพลาสมิดของมันเข้าไปในพืช ดีเอ็นเอที่ถ่ายโอนจะถูกนำไปยังนิวเคลียสของเซลล์พืชและรวมเข้ากับดีเอ็นเอจีโนมของพืชเจ้าบ้าน T-DNA ของพลาสมิดจะถูกรวมเข้ากับจีโนมของเซลล์เจ้าบ้าน แบบกึ่งสุ่ม ^{[ 29 ]}

โดยการดัดแปลงพลาสมิดเพื่อแสดงยีนที่สนใจ นักวิจัยสามารถแทรกยีนที่เลือกไว้ลงในจีโนมของพืชได้อย่างเสถียร ส่วนที่จำเป็นเพียงอย่างเดียวของ T-DNA คือส่วนที่ซ้ำกันสองส่วนเล็กๆ (25 คู่เบส) ซึ่งอย่างน้อยหนึ่งส่วนจำเป็นสำหรับการเปลี่ยนแปลงพืช^{[ 30 ] [ 31 ]}ยีนที่จะนำเข้าสู่พืชจะถูกโคลนลงในเวกเตอร์การเปลี่ยนแปลงพืชที่มีบริเวณ T-DNA ของพลาสมิดวิธีการอื่นคือการแทรกซึมด้วยอะโกรแบคทีเรีย^{[ 32 ] [ 33 ]}

อีกวิธีหนึ่งที่ใช้ในการเปลี่ยนเซลล์พืชคือไบโอลิสติกส์ซึ่งอนุภาคของทองคำหรือทังสเตนจะถูกเคลือบด้วย DNA แล้วยิงเข้าไปในเซลล์พืชอ่อนหรือเอ็มบริโอของพืช^{[ 34 ]}สารพันธุกรรมบางส่วนจะเข้าไปในเซลล์และเปลี่ยนเซลล์เหล่านั้น วิธีนี้สามารถใช้กับพืชที่ไม่ไวต่อ การติดเชื้อ Agrobacteriumและยังช่วยให้สามารถเปลี่ยนพลาสติด ของพืช ได้ด้วย เซลล์พืชยังสามารถเปลี่ยนได้โดยใช้อิเล็กโทรโพเรชัน ซึ่งใช้กระแสไฟฟ้าเพื่อทำให้เยื่อหุ้มเซลล์ซึมผ่าน DNA ของพลาสมิดได้ เนื่องจากความเสียหายที่เกิดขึ้นกับเซลล์และ DNA ประสิทธิภาพการเปลี่ยนของไบโอลิสติกส์และอิเล็กโทรโพเรชันจึงต่ำกว่าการเปลี่ยนของแบคทีเรีย Agrobacterium

การเปลี่ยนแปลงมีความหมายที่แตกต่างกันในสัตว์ โดยบ่งชี้ถึงความก้าวหน้าไปสู่สภาวะมะเร็ง ดังนั้นกระบวนการที่ใช้ในการแทรก DNA จากภายนอกเข้าไปในเซลล์สัตว์จึงมักเรียกว่าการถ่ายทอด (transfection) ^{[ 35 ]}มีหลายวิธีในการนำ DNA เข้าสู่เซลล์สัตว์โดยตรงในหลอดทดลองบ่อยครั้งที่เซลล์เหล่านี้เป็นเซลล์ต้นกำเนิดที่ใช้สำหรับการบำบัดด้วยยีนวิธีการทางเคมีใช้สารประกอบจากธรรมชาติหรือสังเคราะห์เพื่อสร้างอนุภาคที่อำนวยความสะดวกในการถ่ายโอนยีนเข้าสู่เซลล์^{[ 36 ]}เวกเตอร์สังเคราะห์เหล่านี้มีความสามารถในการจับกับ DNA และรองรับการถ่ายโอนยีนขนาดใหญ่^{[ 37 ]}หนึ่งในวิธีที่ง่ายที่สุดคือการใช้แคลเซียมฟอสเฟต เพื่อจับกับ DNA แล้วนำไปสัมผัสกับเซลล์ที่เพาะเลี้ยง สารละลายพร้อมกับ DNA จะถูกห่อหุ้มโดยเซลล์^{[ 38 ]}ไลโปโซมและพอลิเมอร์สามารถใช้เป็นเวกเตอร์ในการส่ง DNA เข้าสู่เซลล์สัตว์ที่เพาะเลี้ยง ไลโปโซมที่มีประจุบวกจะจับกับ DNA ในขณะที่พอลิเมอร์สามารถออกแบบให้มีปฏิสัมพันธ์กับ DNA ได้^{[ 36 ]}พวกมันก่อตัวเป็นไลโปเพล็กซ์และโพลีเพล็กซ์ตามลำดับ ซึ่งจากนั้นจะถูกดูดซึมโดยเซลล์ เทคนิคอื่นๆ ได้แก่ การใช้อิเล็กโทรโพเรชันและไบโอลิสติกส์^{[ 39 ]}ในบางกรณี เซลล์ที่ได้รับการถ่ายยีนอาจรวม DNA ภายนอกเข้ากับจีโนมของตัวเองได้อย่างเสถียร กระบวนการนี้เรียกว่าการถ่ายยีนแบบเสถียร^{[ 40 ]}

ในการสร้างสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรมจำเป็นต้องใส่ดีเอ็นเอเข้าไปในตัวอ่อนหรือไข่ที่มีชีวิต ซึ่งโดยปกติจะทำได้โดยใช้การฉีดไมโคร โดยฉีดดีเอ็นเอผ่าน เยื่อหุ้มนิวเคลียสของเซลล์ เข้าไปใน นิวเคลียสโดยตรง^{[ 26 ]} ไข่ที่ได้รับการปฏิสนธิและกระตุ้นการตกไข่ มากเกินไปจะถูกเก็บรวบรวมในระยะเซลล์เดียวและเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองเมื่อนิวเคลียสจากหัวสเปิร์มและไข่ปรากฏให้เห็นผ่านโปรโตพลาสซึมสารพันธุกรรมจะถูกฉีดเข้าไปในหนึ่งในนั้น จากนั้น โอโอไซต์จะถูกฝังในท่อรังไข่ของสัตว์ที่ตั้งครรภ์เทียม^{[ 41 ]}อีกวิธีหนึ่งคือการถ่ายทอดยีนโดยใช้เซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อน ยีนจะถูกถ่ายโอนเข้าไปในเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนจากนั้นเซลล์เหล่านั้นจะถูกใส่เข้าไปในบลาสโตซิสต์ ของหนู ซึ่งจะถูกฝังเข้าไปในแม่บุญธรรม ลูกหลานที่ได้จะเป็นไคเมอริกและการผสมพันธุ์ต่อไปสามารถผลิตหนูที่ดัดแปลงพันธุกรรมได้อย่างสมบูรณ์ด้วยยีนที่สนใจ^{[ 42 ]}

การถ่ายทอดยีนเป็นกระบวนการที่DNA ต่างประเทศ ถูกนำเข้าสู่เซลล์โดยไวรัสหรือ เวก เตอร์ไวรัส^{[ 43 ]}ไวรัสที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมสามารถใช้เป็นเวกเตอร์ไวรัสเพื่อถ่ายโอนยีนเป้าหมายไปยังสิ่งมีชีวิตอื่นในการบำบัดด้วยยีน [ ^{44 ] ขั้น}แรก ยีนที่ก่อให้เกิดโรคจะถูกนำออกจากไวรัสและยีนเป้าหมายจะถูกแทรกเข้าไปแทน ลำดับที่ทำให้ไวรัสสามารถแทรกยีนเข้าไปในสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านจะต้องคงสภาพเดิม เวกเตอร์ไวรัสที่นิยมใช้ได้รับการพัฒนามาจากเรโทรไวรัสหรืออะเดโนไวรัสไวรัสอื่นๆ ที่ใช้เป็นเวกเตอร์ ได้แก่ เลนติไวรัสไวรัสไข้ทรพิษและไวรัสเริมชนิดของไวรัสที่ใช้จะขึ้นอยู่กับเซลล์เป้าหมายและว่า DNA จะถูกเปลี่ยนแปลงอย่างถาวรหรือชั่วคราว

เนื่องจากมักจะมีการเปลี่ยนแปลงสารพันธุกรรมในเซลล์เพียงเซลล์เดียวเท่านั้น สิ่งมีชีวิตจึงต้องได้รับการสร้างใหม่จากเซลล์เดียวนั้น ในพืช วิธีนี้ทำได้โดยการใช้ การเพาะ เลี้ยงเนื้อเยื่อ^{[ 45 ] [ 46 ]}พืชแต่ละชนิดมีความต้องการที่แตกต่างกันสำหรับการสร้างใหม่ที่ประสบความสำเร็จ หากประสบความสำเร็จ เทคนิคนี้จะสร้างพืชที่โตเต็มวัยซึ่งมีทรานส์ยีนอยู่ในทุกเซลล์^{[ 47 ]}ในสัตว์ จำเป็นต้องแน่ใจว่าดีเอ็นเอที่แทรกเข้าไปนั้นมีอยู่ในเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อน [ ^{27 ] ลูก}หลานสามารถถูกคัดกรองหายีนได้ ลูกหลานทั้งหมดจากรุ่นแรกจะเป็นเฮเทอโรไซกัสสำหรับยีนที่แทรกเข้าไป และต้องผสมพันธุ์กันเองเพื่อให้ได้ ตัวอย่าง ที่เป็นโฮโมไซกัสแบคทีเรียประกอบด้วยเซลล์เดียวและสืบพันธุ์แบบโคลน ดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องสร้างใหม่ มีการใช้ เครื่องหมายที่เลือกได้เพื่อแยกแยะเซลล์ที่เปลี่ยนแปลงไปจากเซลล์ที่ไม่ได้รับการเปลี่ยนแปลงได้อย่างง่ายดาย

เซลล์ที่ได้รับการเปลี่ยนแปลงด้วย DNA สำเร็จจะมีเครื่องหมายยีน ในขณะที่เซลล์ที่ไม่ได้รับการเปลี่ยนแปลงจะไม่มีเครื่องหมายยีน โดยการเพาะเลี้ยงเซลล์ในที่ที่มียาปฏิชีวนะหรือสารเคมีที่เลือกหรือทำเครื่องหมายเซลล์ที่แสดงออกถึงยีนนั้น จะสามารถแยกเซลล์ที่ได้รับการดัดแปลงออกจากเซลล์ที่ไม่ได้รับการดัดแปลงได้ วิธีการคัดกรองอีกวิธีหนึ่งเกี่ยวข้องกับโพรบ DNAที่ยึดติดเฉพาะกับยีนที่แทรกเข้าไปเท่านั้น เครื่องหมายเหล่านี้มักมีอยู่ในสิ่งมีชีวิตที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรม แม้ว่าจะมีการพัฒนากลยุทธ์หลายอย่างที่สามารถกำจัดเครื่องหมายที่เลือกได้จากพืชที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมที่โตเต็มที่แล้วก็ตาม^{[ 48 ]}

การค้นพบว่าสิ่งมีชีวิตลูกผสมมีจีนที่แทรกเข้าไปนั้นมักไม่เพียงพอที่จะรับประกันได้ว่าจีนเหล่านั้นจะถูกแสดงออกอย่างเหมาะสมในเนื้อเยื่อที่ต้องการ จึงต้องดำเนินการทดสอบเพิ่มเติมโดยใช้ PCR, Southern hybridizationและการจัดลำดับดีเอ็นเอเพื่อยืนยันว่าสิ่งมีชีวิตนั้นมีจีนใหม่^{[ 49 ]}การทดสอบเหล่านี้ยังสามารถยืนยันตำแหน่งโครโมโซมและจำนวนสำเนาของจีนที่แทรกเข้าไปได้อีกด้วย เมื่อยืนยันแล้ว วิธีการที่ค้นหาและวัดผลิตภัณฑ์ของจีน (RNA และโปรตีน) จะถูกนำมาใช้เพื่อประเมินการแสดงออกของจีน การถอดรหัส รูปแบบการประมวลผล RNA และการแสดงออกและตำแหน่งของผลิตภัณฑ์โปรตีน ซึ่งรวมถึงnorthern hybridisation , quantitative RT-PCR , Western blot , immunofluorescence , ELISAและการวิเคราะห์ฟีโนไทป์^{[ 50 ]}เมื่อเหมาะสมแล้ว จะมีการศึกษาลูกหลานของสิ่งมีชีวิตนั้นเพื่อยืนยันว่าทรานส์ยีนและฟีโนไทป์ ที่เกี่ยวข้อง ได้รับการถ่ายทอดอย่างเสถียร

วิธีการทางวิศวกรรมพันธุกรรมแบบดั้งเดิมโดยทั่วไปจะแทรกวัสดุพันธุกรรมใหม่แบบสุ่มเข้าไปในจีโนมของโฮสต์ ซึ่งอาจทำให้ยีนอื่นๆ ภายในสิ่งมีชีวิตเสียหายหรือเปลี่ยนแปลงไปได้ จึงมีการพัฒนาวิธีการที่แทรกวัสดุพันธุกรรมใหม่เข้าไปในตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจงภายในจีโนมของสิ่งมีชีวิต วิธีการในยุคแรกๆ ที่กำหนดเป้าหมายยีนในตำแหน่งที่แน่นอนภายในจีโนมนั้นอาศัย การรวมตัวกัน แบบโฮโมโลจัส (HR) ^{[ 51 ]}โดยการสร้างโครงสร้าง DNA ที่มีแม่แบบที่ตรงกับลำดับจีโนมเป้าหมาย ทำให้กระบวนการ HR ภายในเซลล์สามารถแทรกโครงสร้างเข้าไปในตำแหน่งที่ต้องการได้ การใช้วิธีนี้กับเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนนำไปสู่การพัฒนาหนูทรานส์เจนิกที่ มี การกำจัดยีนเป้าหมายนอกจากนี้ยังสามารถแทรกยีนหรือเปลี่ยนแปลงรูปแบบการแสดงออกของยีน ได้อีกด้วย ^{[ 52 ]}

หากยีนที่สำคัญถูกน็อคเอาท์ อาจเป็นอันตรายถึงชีวิตต่อสิ่งมีชีวิตได้ เพื่อศึกษาหน้าที่ของยีนเหล่านี้ จึง มีการใช้ รีคอมบิเนสเฉพาะตำแหน่ง (SSR) ซึ่งสองประเภทที่พบได้บ่อยที่สุดคือระบบCre-LoxPและFlp-FRT รีคอมบิเนส Creเป็นเอนไซม์ที่กำจัด DNA โดยการรีคอมบิเนชันแบบโฮโมโลจัสระหว่างลำดับการจับที่เรียกว่าไซต์ Lox-P ระบบ Flip-FRT ทำงานในลักษณะเดียวกัน โดยรีคอมบิเนส Flip จะจดจำลำดับ FRT โดยการผสมพันธุ์สิ่งมีชีวิตที่มีไซต์รีคอมบิเนสที่อยู่รอบยีนที่สนใจกับสิ่งมีชีวิตที่แสดง SSR ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์เฉพาะเนื้อเยื่อทำให้สามารถน็อคเอาท์หรือเปิดยีนได้เฉพาะในเซลล์บางเซลล์เท่านั้น วิธีนี้ยังใช้ในการกำจัดยีนเครื่องหมายออกจากสัตว์ทรานส์เจนิก การดัดแปลงระบบเหล่านี้เพิ่มเติมทำให้นักวิจัยสามารถกระตุ้นการรีคอมบิเนชันได้เฉพาะภายใต้เงื่อนไขบางอย่าง ทำให้สามารถน็อคเอาท์หรือแสดงยีนได้ในเวลาหรือขั้นตอนการพัฒนาที่ ต้องการ ^{[ 52 ]}

การแก้ไขจีโนมใช้เอนไซม์นิวคลีเอส ที่ถูกสร้างขึ้นโดยวิธีการทางวิศวกรรม เพื่อสร้างรอยแตกสองสายจำเพาะ ในตำแหน่งที่ต้องการในจีโนม รอยแตกเหล่านี้สามารถถูกซ่อมแซมได้ด้วย กระบวนการ ซ่อมแซมดีเอ็นเอ ของเซลล์ ซึ่งสามารถนำมาใช้ประโยชน์ในการกำจัด แก้ไข หรือแทรกยีนเป้าหมายได้ในความถี่สูง หากมีดีเอ็นเอผู้ให้ที่มีลำดับที่เหมาะสม (ความเหมือนกัน) อยู่แล้ว สารพันธุกรรมใหม่ที่มีทรานส์ยีนจะถูกรวมเข้ากับตำแหน่งเป้าหมายได้อย่างมีประสิทธิภาพสูงโดยกระบวนการรีคอมบิเนชันแบบโฮโมโลจัส^{[ 53 ]}มีนิวคลีเอสที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมอยู่ 4 ตระกูล ได้แก่^{เมกะนิวคลีเอส [ 54 ] [ 55 ] ZFNs [} 56 ^] [ ^{57 ] นิวคลี}เอส^{แบบตัวกระตุ้นการถอดรหัส}คล้ายเอฟเฟกต์ (TALEN) ^{[ 58 ] [ 59 ]}และCRISPR/Cas (คลัสเตอร์ที่มีพาลินโดรมสั้นที่เว้นระยะห่างอย่างสม่ำเสมอ/โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ CRISPR (เช่น CRISPR/Cas9)) [ ^{60 ] [ 61 ] ใน}บรรดาสี่ประเภทนี้ TALEN และ CRISPR/Cas เป็นสองประเภทที่ใช้กันมากที่สุด^{[ 62 ]}ความก้าวหน้าล่าสุดได้พิจารณาการรวมระบบหลายระบบเข้าด้วยกันเพื่อใช้ประโยชน์จากคุณสมบัติที่ดีที่สุดของทั้งสองระบบ (เช่น megaTAL ซึ่งเป็นการรวมกันของโดเมนการจับ DNA ของ TALE และเมกะนิวคลีเอส) ^{[ 63 ]}งานวิจัยล่าสุดยังมุ่งเน้นไปที่การพัฒนากลยุทธ์เพื่อสร้างการกำจัดยีนหรือการแก้ไขยีนโดยไม่สร้างการแตกของสายคู่ (ตัวแก้ไขเบส) ^{[ 62 ]}

เมกะนิวคลีเอสถูกนำมาใช้ครั้งแรกในปี 1988 ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม^{[ 64 ]}เมกะนิวคลีเอสเป็นเอนโดดีออกซีไรโบ นิวคลีเอ สที่ทำหน้าที่เป็นเอนไซม์จำกัดที่มีไซต์การจดจำยาว ทำให้มีความจำเพาะต่อไซต์เป้าหมายมากกว่าเอนไซม์จำกัด อื่นๆ ซึ่งจะเพิ่มความจำเพาะและลดความเป็นพิษ เนื่องจากจะไม่กำหนดเป้าหมายไปยังไซต์จำนวนมากภายในจีโนม เมกะนิวคลีเอสที่ได้รับการศึกษามากที่สุดคือตระกูล LAGLIDADGแม้ว่าเมกะนิวคลีเอสจะยังคงไวต่อการจับกับเป้าหมายที่ไม่ถูกต้อง ซึ่งทำให้มีความน่าสนใจน้อยกว่าเครื่องมือแก้ไขยีนอื่นๆ แต่ขนาดที่เล็กกว่ายังคงทำให้มีความน่าสนใจ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในมุมมองของการใช้ไวรัสเป็นพาหะ^{[ 65 ] [ 53 ]}

นิวคลีเอสแบบซิงค์ฟิงเกอร์ (ZFNs) ซึ่งใช้ครั้งแรกในปี 1996 มักถูกสร้างขึ้นโดยการรวมโดเมนซิงค์ฟิงเกอร์และ โดเมนนิวคลี เอส Fok I เข้าด้วยกัน ดังนั้น ZFNs จึงมีความสามารถในการตัด DNA ที่ตำแหน่งเป้าหมาย^{[ 53 ]}โดยการออกแบบโดเมนซิงค์ฟิงเกอร์ให้กำหนดเป้าหมายไปยังตำแหน่งเฉพาะภายในจีโนม ทำให้สามารถแก้ไขลำดับจีโนมในตำแหน่ง ที่ต้องการ ได้^{[ 65 ] [ 66 ] [ 53 ]} ZFNs มีความจำเพาะสูงกว่า แต่ก็ยังมีศักยภาพที่จะจับกับลำดับที่ไม่จำเพาะได้ แม้ว่าการตัดนอกเป้าหมายในระดับหนึ่งจะยอมรับได้สำหรับการสร้างสิ่งมีชีวิตจำลองแบบทรานส์เจนิก แต่ก็อาจไม่เหมาะสมที่สุดสำหรับการรักษาด้วยยีนบำบัดในมนุษย์ทุกกรณี^{[ 65 ]}

การเข้าถึงรหัสที่ควบคุมการจดจำ DNA โดยตัวกระตุ้นการถอดรหัสคล้ายเอฟเฟกต์ (TALE) ในปี 2552 ได้เปิดทางไปสู่การพัฒนาเครื่องมือแก้ไขยีนแบบ TAL ที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น TALE ซึ่งเป็นโปรตีนที่หลั่งโดยเชื้อก่อโรคพืช Xanthomonas จะจับกับยีนภายในพืชเจ้าบ้านด้วยความจำเพาะสูง และเริ่มต้นการถอดรหัส ของยีนที่ช่วยในการติดเชื้อ การดัดแปลง TALE โดยการเชื่อมแกนการจับ DNA เข้ากับ โดเมนเร่งปฏิกิริยาของนิวคลีเอส Fok Iทำให้เกิดเครื่องมือใหม่ของนิวคลีเอสที่ออกแบบได้ นั่นคือ นิวคลีเอส TALE (TALEN) ^{[ 67 ]}พวกมันมีความจำเพาะสูงที่สุดตัวหนึ่งในบรรดานิวคลีเอสที่ได้รับการออกแบบในปัจจุบันทั้งหมด เนื่องจากมีลำดับซ้ำ จึงยากที่จะสร้างพวกมันผ่านกระบวนการทางชีววิทยาโมเลกุลมาตรฐาน และต้องอาศัยวิธีการที่ซับซ้อนกว่า เช่น การโคลนนิ่ง แบบGolden gate ^{[ 62 ]}

ในปี 2011 เทคโนโลยีที่ก้าวล้ำอีกอย่างหนึ่งได้รับการพัฒนาขึ้นโดยอิงจากระบบ CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeat / CRISPR associated protein) ซึ่งทำหน้าที่เป็นระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวได้ในแบคทีเรียและอาร์เคียระบบ CRISPR/Cas ช่วยให้แบคทีเรียและอาร์เคียต่อสู้กับไวรัสที่รุกรานได้โดยการตัด DNA ของไวรัสและแทรกชิ้นส่วนของ DNA นั้นเข้าไปในจีโนมของพวกมันเอง จากนั้นสิ่งมีชีวิตจะถอดรหัส DNA นี้เป็นRNAและรวม RNA นี้กับ โปรตีน Cas9เพื่อสร้างการแตกหักแบบสองสายใน DNA ของไวรัสที่รุกราน RNA ทำหน้าที่เป็น RNA นำทางเพื่อนำเอนไซม์ Cas9 ไปยังตำแหน่งที่ถูกต้องใน DNA ของไวรัส โดยการจับคู่โปรตีน Cas กับ RNA นำทางที่ออกแบบไว้ CRISPR/Cas9 สามารถใช้เพื่อเหนี่ยวนำให้เกิดการแตกหักแบบสองสาย ณ จุดเฉพาะภายในลำดับ DNA การแตกหักจะได้รับการซ่อมแซมโดยเอนไซม์ซ่อมแซม DNA ของเซลล์ ทำให้เกิดการกลายพันธุ์แบบแทรก/ลบขนาดเล็กในกรณีส่วนใหญ่ การซ่อมแซม DNA แบบกำหนดเป้าหมายสามารถทำได้โดยการให้แม่แบบ DNA ผู้บริจาคที่แสดงถึงการเปลี่ยนแปลงที่ต้องการและ (บางครั้ง) ใช้สำหรับการซ่อมแซมการแตกของสายคู่โดยการรวมตัวกันแบบโฮโมโลจัส ต่อมาได้มีการแสดงให้เห็นว่า CRISPR/Cas9 สามารถแก้ไขเซลล์มนุษย์ในจานเพาะเลี้ยงได้ แม้ว่ารุ่นแรกๆ จะขาดความจำเพาะของ TALEN แต่ข้อได้เปรียบที่สำคัญของเทคโนโลยีนี้คือความเรียบง่ายของการออกแบบ นอกจากนี้ยังช่วยให้สามารถกำหนดเป้าหมายหลายตำแหน่งพร้อมกันได้ ทำให้สามารถแก้ไขยีนหลายตัวพร้อมกันได้CRISPR/Cpf1เป็นระบบที่เพิ่งค้นพบเมื่อไม่นานมานี้ ซึ่งต้องใช้ RNA นำทางที่แตกต่างกันเพื่อสร้างการแตกของสายคู่ที่เฉพาะเจาะจง (เหลือส่วนที่ยื่นออกมาเมื่อตัด DNA) เมื่อเทียบกับ CRISPR/Cas9 ^{[ 62 ]}

CRISPR/Cas9 มีประสิทธิภาพในการทำลายยีน การสร้างทารกที่ต้านทานเชื้อ HIV โดยนักวิจัยชาวจีน เหอ เจียนควิ อาจเป็นตัวอย่างที่มีชื่อเสียงที่สุดของการทำลายยีนโดยใช้วิธีนี้^{[ 68 ]}แต่มีประสิทธิภาพน้อยกว่ามากในการแก้ไขยีน วิธีการแก้ไขเบสกำลังอยู่ระหว่างการพัฒนา โดยใช้เอนโดนิวคลีเอส Cas 9 ที่ "ไม่มีฤทธิ์นิวคลีเอส" หรือเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องสำหรับการกำหนดเป้าหมายยีน ในขณะที่เอนไซม์ดีอะมิเนสที่เชื่อมโยงกันจะทำการเปลี่ยนแปลงเบสเป้าหมายใน DNA ^{[ 69 ]}การปรับปรุงล่าสุดของ CRISPR-Cas9 เรียกว่า Prime Editing วิธีนี้เชื่อมโยงรีเวิร์สทรานสคริปเทสกับนิวคลีเอสที่ได้รับการออกแบบโดย RNA ซึ่งจะทำการตัดสายเดี่ยวเท่านั้น แต่ไม่ทำให้เกิดการแตกของสายคู่ มันจะแทนที่ส่วนของ DNA ที่อยู่ถัดจากการตัดด้วยการทำงานต่อเนื่องของนิวคลีเอสและรีเวิร์สทรานสคริปเทส โดยนำการเปลี่ยนแปลงที่ต้องการจากแม่แบบ RNA เข้ามา^{[ 70 ]}

• รายชื่อซอฟต์แวร์ด้านวิศวกรรมพันธุกรรม : ซอฟต์แวร์สำหรับเขียนโค้ดเพื่อดัดแปลงพันธุกรรม
• การกลายพันธุ์ (เทคนิคทางชีววิทยาระดับโมเลกุล)