การแยกเชื้อ (จุลชีววิทยา)

ในจุลชีววิทยาการแยกเชื้อเป็นเทคนิคการแยกเชื้อสายพันธุ์ หนึ่ง ออกจากประชากรจุลินทรีย์ ที่มีชีวิต แบบ ผสม ^{[ 1 ]}วิธีนี้ช่วยให้สามารถระบุจุลินทรีย์ในตัวอย่างที่เก็บมาจากสิ่งแวดล้อม เช่น น้ำหรือดินหรือจากคนหรือสัตว์ได้^{[ 2 ]}เทคนิคในห้องปฏิบัติการสำหรับการแยกแบคทีเรียและปรสิตได้รับการพัฒนาในช่วงศตวรรษที่ 19 และสำหรับไวรัสในช่วงศตวรรษที่ 20

เทคนิคทางห้องปฏิบัติการในการแยกจุลินทรีย์ได้รับการพัฒนาขึ้นครั้งแรกในช่วงศตวรรษที่ 19 ในสาขาแบคทีริโอวิทยาและปรสิตวิทยาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง ในปี 1860 หลุยส์ ปาสเตอร์ได้นำอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวมาใช้ได้สำเร็จอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่ปาสเตอร์พัฒนาขึ้นช่วยให้สามารถมองเห็นการส่งเสริมหรือยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียชนิดต่างๆ ได้ เทคนิคเดียวกันนี้ยังคงใช้กันอยู่ในปัจจุบันผ่านอาหารเลี้ยงเชื้อหลายชนิด เช่นวุ้นเกลือแมนนิทอล ซึ่งเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ง อาหารเลี้ยงเชื้อแข็งได้รับการพัฒนาขึ้นในปี 1881 เมื่อโรเบิร์ต โคคทำให้อาหารเลี้ยงเชื้อเหลวแข็งตัวโดยการเติมวุ้น^{[ 3 ]}

เทคนิคการแยกเชื้อไวรัส ที่ถูกต้องตามหลักการ นั้นไม่เคยมีมาก่อนศตวรรษที่ 20 วิธีการแยกเชื้อจุลินทรีย์ได้เปลี่ยนแปลงไปอย่างมากในช่วง 50 ปีที่ผ่านมา ทั้งในแง่ของแรงงานที่เพิ่มมากขึ้นจากการใช้เครื่องจักร และในแง่ของเทคโนโลยีที่เกี่ยวข้อง ซึ่งส่งผลให้ความเร็วและความแม่นยำเพิ่มขึ้นด้วย

ในการแยกจุลินทรีย์ออกจากประชากรจุลินทรีย์ ที่ผสม ปนเปกันตามธรรมชาติ เช่นจุลินทรีย์ในน้ำหรือดินหรือจากสิ่งมีชีวิตที่มีจุลินทรีย์บนผิวหนังในช่องปากหรือในลำไส้จำเป็นต้องแยกจุลินทรีย์นั้นออกจากส่วนผสม

ตามธรรมเนียมแล้ว การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์มี จุดประสงค์ เพื่อระบุจุลินทรีย์ที่สนใจโดยพิจารณาจากลักษณะการเจริญเติบโต ขึ้นอยู่กับความหนาแน่นและความมีชีวิตของจุลินทรีย์ที่คาดว่าจะพบในตัวอย่างของเหลว อาจเลือกใช้วิธีทางกายภาพเพื่อเพิ่มความเข้มข้น เช่นการเจือจางแบบต่อเนื่องหรือการปั่นเหวี่ยงเพื่อแยกจุลินทรีย์ในวัสดุที่มีปริมาณจุลินทรีย์สูง เช่น น้ำเสีย ดิน หรืออุจจาระ การเจือจางแบบต่อเนื่องจะช่วยเพิ่มโอกาสในการแยกส่วนผสมได้

ในตัวกลางที่เป็นของเหลวที่มีจุลินทรีย์น้อยหรือไม่มีเลย จากบริเวณที่ปกติแล้วปลอดเชื้อ (เช่นน้ำไขสันหลังเลือดภายในระบบไหลเวียนโลหิต) การปั่นเหวี่ยง การแยกส่วนที่เป็นของเหลวใสออก และการใช้เฉพาะส่วนที่เป็นตะกอน จะเพิ่มโอกาสในการเจริญเติบโตและแยกแบคทีเรียหรือไวรัสที่มักเกาะอยู่กับเซลล์ได้

หากต้องการเพาะเลี้ยงหรือแยกจุลินทรีย์ ที่มีความต้องการเฉพาะ เจาะจง เป็นพิเศษ เทคนิค การเพาะเลี้ยงและการแยกจุลินทรีย์จะต้องปรับให้เหมาะสมกับจุลินทรีย์นั้น ตัวอย่างเช่น แบคทีเรียที่ตายเมื่อสัมผัสกับอากาศ จะสามารถแยกได้ก็ต่อเมื่อตัวอย่างถูกขนส่งและประมวลผลภายใต้สภาวะที่ปราศจากอากาศหรือสภาวะไร้ออกซิเจนเท่านั้น แบคทีเรียที่ตายเมื่อสัมผัสกับอุณหภูมิห้อง (เทอร์โมฟิลิก) จำเป็นต้องใช้ภาชนะบรรจุที่อุ่นไว้ก่อน และจุลินทรีย์ที่แห้งและตายเมื่ออยู่บนสำลี จะต้องใช้ตัวกลางในการขนส่งไวรัสก่อนจึงจะสามารถเพาะเลี้ยงได้สำเร็จ

เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการจะนำตัวอย่างไปเพาะเลี้ยงบนจานวุ้น แข็งชนิดต่างๆ โดยใช้วิธีการขีดเส้นบนจานเพาะเชื้อหรือในอาหารเลี้ยง เชื้อเหลว ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ของการแยกเชื้อ:

• หากต้องการแยกเฉพาะ แบคทีเรียกลุ่ม ใด กลุ่มหนึ่ง เช่นสเตรปโตค็อกคัสกลุ่ม Aจากตัวอย่างสารคัดหลั่งในลำคอ สามารถใช้สื่อเพาะเลี้ยงแบบคัดเลือกที่จะยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียร่วมที่คาดว่าจะอยู่ในส่วนผสม (โดยใช้ยาปฏิชีวนะที่มีอยู่ในวุ้น) เพื่อให้เฉพาะสเตรปโตค็อกคัสเท่านั้นที่ถูก "คัดเลือก" กล่าวคือ สามารถมองเห็นได้ชัดเจน^{[ 4 ]}ในการแยกเชื้อราสามารถใช้วุ้นซาบูโรด์ได้ หรืออีกทางเลือกหนึ่ง สภาวะที่เป็นอันตรายต่อสเตรปโตค็อกคัสและแบคทีเรียแกรมลบ เช่น ความเข้มข้นของเกลือ สูงใน วุ้นแมนนิทอลซอลต์ จะช่วยให้ สแตฟิโลค็อกคัสที่อยู่ในตัวอย่างแบคทีเรียในลำไส้มีชีวิตรอดได้ และ ฟีนอลเรดในวุ้นทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ค่า pHที่แสดงว่าแบคทีเรียสามารถหมักแมนนิทอลโดยการขับกรดลงในสื่อเพาะเลี้ยง ได้หรือไม่ ในอาหารเลี้ยงเชื้ออะการ์ชนิดอื่นๆ จะมีการเติมสารต่างๆ เพื่อใช้ประโยชน์จากความสามารถของจุลินทรีย์ในการสร้างเม็ดสีที่มองเห็นได้ (เช่นอาหารเลี้ยงเชื้อกรานาดาสำหรับแบคทีเรียกลุ่ม B Streptococcus ) ซึ่งจะเปลี่ยน สีของ โคโลนีแบคทีเรียหรือเพื่อละลายอะการ์เลือดโดยกระบวนการฮีโมไลซิสเพื่อให้สามารถมองเห็นแบคทีเรียได้ง่ายขึ้น แบคทีเรียบางชนิด เช่นแบคทีเรียสกุล Legionellaต้องการสารอาหารเฉพาะหรือสารที่จับกับสารพิษ เช่นถ่านกัมมันต์ เพื่อการเจริญเติบโต ดังนั้นจึง ต้องใช้อาหารเลี้ยงเชื้อเช่นอะการ์สกัดจากยีสต์ผสมถ่านกัมมันต์ที่มีบัฟเฟอร์
• หากต้องการแยก สายพันธุ์ให้ได้ มากที่สุดหรือทั้งหมดเท่าที่จะเป็นไปได้ จำเป็นต้องใช้สารอาหารที่แตกต่างกัน รวมถึงสารอาหารเสริม เช่นเลือดอะการ์และช็อกโกแลตอะการ์และสารอาหารเพาะเลี้ยงแบบไม่ใช้ออกซิเจน เช่นไทโอไกลโคเลตโบรธในการนับจำนวนแบคทีเรียที่เจริญเติบโต สามารถนำแบคทีเรียมาแขวนลอยในอะการ์ที่หลอมเหลวก่อนที่มันจะแข็งตัว แล้วเทลงในจานเพาะเชื้อซึ่งเรียกว่า "วิธีเทลงจาน" ซึ่งใช้ในจุลชีววิทยาทางสิ่งแวดล้อมและจุลชีววิทยาทางอาหาร (เช่น การทดสอบผลิตภัณฑ์นม) เพื่อหาจำนวนแบคทีเรียแบบใช้ออกซิเจน

หลังจากนำตัวอย่างไปเพาะเลี้ยงในหรือบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เลือกแล้ว จะนำไปบ่มภายใต้สภาวะบรรยากาศที่เหมาะสม เช่น สภาวะที่มีออกซิเจน สภาวะที่ไม่มีออกซิเจน หรือ สภาวะ ที่มีออกซิเจนน้อยหรือเติมคาร์บอนไดออกไซด์ (5%) ที่อุณหภูมิต่างๆ เช่น 37 °C ในตู้อบหรือในตู้เย็นสำหรับการเพิ่มปริมาณเชื้อในสภาวะเย็น ภายใต้แสงที่เหมาะสม เช่น มืดสนิทโดยห่อด้วยกระดาษหรือในขวดทึบแสงสำหรับ ไมโคแบคทีเรียชนิด สโคโตโครโมเจนและเป็นระยะเวลาที่แตกต่างกัน เนื่องจากแบคทีเรียแต่ละชนิดเจริญเติบโตในอัตราที่แตกต่างกัน ตั้งแต่ไม่กี่ชั่วโมง ( เช่น Escherichia coli ) จนถึงหลายสัปดาห์ (เช่นไมโคแบคทีเรีย )

เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการและนักจุลชีววิทยา จะตรวจสอบอาหารเลี้ยงเชื้อ เป็นระยะๆเพื่อหาสัญญาณการเจริญเติบโตที่มองเห็นได้ และบันทึกผล การตรวจสอบจะต้องดำเนินการภายใต้สภาวะที่เอื้อต่อการอยู่รอดของเชื้อ เช่น ใน "ห้องไร้ออกซิเจน" สำหรับแบคทีเรียที่ไม่ต้องการออกซิเจน และภายใต้สภาวะที่ไม่เป็นอันตรายต่อผู้ที่ตรวจสอบจานเพาะเชื้อจากการติดเชื้อจุลินทรีย์ที่ติดต่อได้ง่าย เช่น ภายใต้ตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพสำหรับเชื้อ Yersinia pestis (กาฬโรค) หรือBacillus anthracis (แอนแทร็กซ์) เป็นต้น

เมื่อแบคทีเรียเจริญเติบโตอย่างเห็นได้ชัด มักจะยังคงปะปนกันอยู่ การระบุชนิดของจุลินทรีย์ขึ้นอยู่กับการแยกโคโลนี แต่ละตัวออกมา เนื่องจากการทดสอบทางชีวเคมีของจุลินทรีย์เพื่อกำหนดลักษณะทางสรีรวิทยาต่างๆ นั้นขึ้นอยู่กับการ เพาะ เลี้ยงบริสุทธิ์ในการทำ ซับคัลเจอร์ นั้น ต้องใช้เทคนิคปลอดเชื้อในทางจุลชีววิทยา อีกครั้ง โดยใช้ลูปตักโคโลนีเดี่ยวๆ ออกจากพื้นผิววุ้น และขีดวัสดุนั้นลงในช่องสี่เหลี่ยม 4 ช่องของจานวุ้น หรือขีดให้ทั่วทั้งจานหากโคโลนีนั้นเป็นเพียงโคโลนีเดียวและดูไม่ปะปนกัน

การย้อมสีแกรมช่วยให้มองเห็นองค์ประกอบของผนังเซลล์ของแบคทีเรียโดยอาศัยสีที่แบคทีเรียย้อมติดหลังจากขั้นตอนการย้อมสีและการล้างสีหลายขั้นตอน^{[ 5 ]}กระบวนการย้อมสีนี้ช่วยให้สามารถระบุ แบคทีเรีย แกรมลบและแกรมบวกได้แบคทีเรียแกรมลบจะย้อมติดสีชมพูเนื่องจากมีชั้นเพปติโดไกลแคนบาง หากแบคทีเรียย้อมติดสีม่วงเนื่องจากมีชั้นเพปติโดไกลแคนหนา แบคทีเรียนั้นจะเป็นแบคทีเรียแกรมบวก^{[ 5 ]}

ในจุลชีววิทยาคลินิก มีเทคนิคการย้อมสีอื่นๆ อีกมากมายที่ใช้สำหรับจุลินทรีย์เฉพาะ (เช่น การย้อมสีแบคทีเรียทนกรดสำหรับไมโคแบคทีเรีย) เทคนิคการย้อมสีทางภูมิคุ้มกัน เช่นการตรวจภูมิคุ้มกันโดยตรงด้วย ฟลูออเรสเซนซ์ ได้รับการพัฒนาขึ้นสำหรับเชื้อก่อโรค ที่สำคัญทางการแพทย์ ซึ่งเจริญเติบโตช้า ( เช่น การย้อมสีออรามีน-โรดามีนสำหรับไมโคแบคทีเรีย ) หรือเพาะเลี้ยงได้ยาก (เช่น เชื้อ Legionella pneumophila ) และในกรณี ที่ ผลการทดสอบจะเปลี่ยนแปลงการจัดการมาตรฐานและการรักษาตามประสบการณ์

การทดสอบทางชีวเคมีของแบคทีเรียเกี่ยวข้องกับการใช้ชุดวุ้นในหลอดทดลองเพื่อแยกแบคทีเรียที่เคลื่อนที่ได้ออกจากแบคทีเรียที่เคลื่อนที่ไม่ได้ในปี 1970 ได้มีการพัฒนาเวอร์ชันย่อส่วนขึ้นมา ซึ่งเรียกว่าดัชนีโปรไฟล์การวิเคราะห์ (Analytical Profile Index )

การระบุชนิดที่ประสบความสำเร็จ เช่น ผ่านการลำดับจีโนมและจีโนมิกส์ขึ้นอยู่กับการเพาะเลี้ยงเชื้อบริสุทธิ์

วิธีการที่รวดเร็วที่สุดในการระบุแบคทีเรียคือการหา ลำดับยีน 16S rRNAหลังจากการเพิ่มจำนวนโดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ซึ่งวิธีนี้ไม่จำเป็นต้องแยกแบคทีเรียออกมา เนื่องจากแบคทีเรียส่วนใหญ่ไม่สามารถเพาะเลี้ยงได้ด้วยวิธีการทั่วไป (โดยเฉพาะแบคทีเรียในสิ่งแวดล้อมหรือในดิน) จึงมีการใช้เมตาจีโนมิกส์หรือเมตาทรานสคริปโตมิก ส์ เช่น การหาลำดับแบบช็อตกัน หรือการหาลำดับจีโนม โดยใช้ PCR การหาลำดับด้วยแมสสเปกโทรเม ตรี เช่น การหาลำดับแบบ MALDI-TOF MS ( Matrix-assisted laser desorption/ionization ) ใช้ในการวิเคราะห์ตัวอย่างทางคลินิกเพื่อค้นหาเชื้อก่อโรคการหาลำดับจีโนมทั้งหมด เป็นอีกทางเลือกหนึ่งสำหรับสิ่งมีชีวิตชนิดเดียวที่ไม่สามารถระบุลักษณะได้อย่างเพียงพอ นอกจากนี้ยังสามารถใช้ ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอขนาดเล็ก ในการระบุแบคทีเรียได้เช่นกัน