การหาปริมาณไวรัสคือการนับหรือคำนวณจำนวน อนุภาค ไวรัส (ไวริออน) ในตัวอย่างเพื่อหาความเข้มข้นของไวรัส วิธีการนี้ใช้ในงานวิจัยและพัฒนา (R&D) ทั้งในห้องปฏิบัติการทางวิชาการและเชิงพาณิชย์ รวมถึงในกระบวนการผลิตที่ปริมาณไวรัสในขั้นตอนต่างๆ เป็นตัวแปรสำคัญที่ต้องตรวจสอบอย่างสม่ำเสมอ ตัวอย่างเช่น การผลิตวัคซีนที่ใช้ไวรัสเป็นส่วนประกอบโปรตีนลูกผสมโดยใช้ไวรัสเป็นพาหะ และแอนติเจน ของไวรัส ล้วนต้องใช้การหาปริมาณไวรัสเพื่อตรวจสอบและ/หรือปรับเปลี่ยนกระบวนการอย่างต่อเนื่อง เพื่อเพิ่มคุณภาพของผลิตภัณฑ์และผลผลิต และเพื่อตอบสนองต่อความต้องการและการใช้งานที่เปลี่ยนแปลงอยู่เสมอ ตัวอย่างอื่นๆ ของกรณีเฉพาะที่จำเป็นต้องหาปริมาณไวรัส ได้แก่การคัดกรองโคลน การเพิ่ม ประสิทธิภาพอัตราการติดเชื้อ (MOI) และการปรับวิธีการให้เข้ากับ การ เพาะ เลี้ยงเซลล์

มีหลายวิธีในการจัดหมวดหมู่ของวิธีการวัดปริมาณไวรัส โดยในที่นี้ วิธีการต่างๆ จะถูกจัดกลุ่มตามสิ่งที่วัดและในบริบททางชีววิทยา ตัวอย่างเช่น การทดสอบแบบใช้เซลล์มักจะวัดหน่วยการติดเชื้อ (ไวรัสที่ออกฤทธิ์) วิธีการอื่นๆ อาจวัดความเข้มข้นของโปรตีนไวรัส ดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอ หรืออนุภาคโมเลกุล แต่ไม่จำเป็นต้องวัดความสามารถในการติดเชื้อ แต่ละวิธีมีข้อดีและข้อเสียของตนเอง ซึ่งมักจะเป็นตัวกำหนดว่าควรใช้วิธีใดสำหรับการใช้งานเฉพาะ^{[ 1 ]}

การทดสอบแบบใช้ คราบจุลินทรีย์เป็นวิธีการที่ใช้กันทั่วไปในการกำหนดความเข้มข้นของไวรัสในแง่ของปริมาณการติดเชื้อการทดสอบแบบใช้คราบจุลินทรีย์จะกำหนดจำนวนหน่วยสร้างคราบจุลินทรีย์ (PFU) ในตัวอย่างไวรัส ซึ่งเป็นการวัดปริมาณไวรัสอย่างหนึ่ง การทดสอบนี้ใช้หลักการทางจุลชีววิทยาที่ดำเนินการในจานเพาะเชื้อ หรือจาน เพาะเลี้ยงเซลล์แบบหลายหลุมโดยเฉพาะอย่างยิ่ง เซลล์โฮสต์ที่เรียงตัวเป็นชั้นเดียวจะถูกติดเชื้อโดยการใช้ตัวอย่างที่มีไวรัสในความเข้มข้นต่างๆ กัน จากนั้นจึงคลุมด้วยตัวกลาง กึ่งแข็ง เช่นอะการ์หรือคาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลสเพื่อป้องกันการแพร่กระจายของการติดเชื้อไวรัสอย่างไม่เลือกปฏิบัติ เช่นเดียวกับที่เกิดขึ้นในตัวกลางที่เป็นของเหลว คราบไวรัสจะเกิดขึ้นหลังจากที่ไวรัสติดเชื้อเซลล์ภายในชั้นเซลล์ที่ตรึงไว้^{[ 2 ]} เซลล์ที่ติดเชื้อไวรัสจะแตกตัวและแพร่กระจายการติดเชื้อไปยังเซลล์ข้างเคียง ซึ่งวงจรการติดเชื้อไปสู่การแตกตัวจะเกิดขึ้นซ้ำๆ ทำให้เกิดบริเวณของเซลล์ที่ติดเชื้อและแตกตัว (คราบไวรัส) ล้อมรอบด้วยเซลล์ที่ไม่ติดเชื้อและยังคงสภาพสมบูรณ์ สามารถมองเห็นคราบพลัคได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง หรือมองเห็นได้ด้วยตาเปล่าโดยใช้ เทคนิค การย้อมสีเซลล์ (เช่น การย้อมด้วย สารละลาย คริสตัลไวโอเลตเพื่อดูเซลล์ที่สมบูรณ์เทียบกับเซลล์ที่แตกตัว) ^{[ 3 ]} การก่อตัวของคราบพลัคอาจใช้เวลา 3–14 วัน ขึ้นอยู่กับไวรัสที่กำลังวิเคราะห์ โดยทั่วไปจะนับคราบพลัคด้วยตนเอง และจำนวนคราบพลัคที่นับได้ ร่วมกับปัจจัยการเจือจางของสารละลายการติดเชื้อ (ตัวอย่างที่ใช้กับเซลล์ในตอนแรก) จะใช้ในการคำนวณจำนวนหน่วยการก่อตัวของคราบพลัคต่อปริมาตรตัวอย่าง (PFU/mL) ตัวเลข PFU/mL แสดงถึงความเข้มข้นของอนุภาคไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อภายในตัวอย่าง และขึ้นอยู่กับสมมติฐานที่ว่าคราบพลัคแต่ละอันที่เกิดขึ้นนั้นเป็นตัวแทนของการติดเชื้อเริ่มต้นโดยอนุภาคไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อหนึ่งอนุภาค^{[ 4 ] [ 5 ]}

การทดสอบการสร้างกลุ่มเซลล์ (Focus Forming Assay หรือ FFA) เป็นรูปแบบหนึ่งของการทดสอบการเกิดคราบ (Plaque Assay) แต่แทนที่จะอาศัยการแตกตัวของเซลล์เพื่อตรวจจับการเกิดคราบ FFA ใช้เทคนิคการย้อมสีภูมิคุ้มกัน โดยใช้ แอนติบอดีที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง ซึ่งจำเพาะต่อ แอนติเจนของไวรัสเพื่อตรวจจับเซลล์เจ้าบ้านที่ติดเชื้อและอนุภาคไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อก่อนที่จะเกิดคราบจริง FFA มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการหาปริมาณไวรัสประเภทที่ไม่ทำให้เยื่อหุ้มเซลล์แตกตัว เนื่องจากไวรัสเหล่านี้จะไม่สามารถใช้การทดสอบการเกิดคราบได้ เช่นเดียวกับการทดสอบการเกิดคราบ เซลล์เจ้าบ้านจะถูกติดเชื้อด้วยตัวอย่างไวรัสที่เจือจางในระดับต่างๆ และปล่อยให้บ่มเป็นระยะเวลาสั้นๆ (เช่น 24–72 ชั่วโมง) ภายใต้ตัวกลางกึ่งแข็งที่จำกัดการแพร่กระจายของไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อ ทำให้เกิดกลุ่มเซลล์ที่ติดเชื้อเฉพาะที่ (foci) จากนั้นจะนำแผ่นเพาะเลี้ยงไปตรวจสอบด้วยแอนติบอดีที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสงที่จำเพาะต่อแอนติเจนของไวรัส และ ใช้ กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ในการนับและหาปริมาณจำนวนกลุ่มเซลล์ โดยทั่วไป วิธี FFA จะให้ผลลัพธ์ในเวลาที่น้อยกว่าการทดสอบคราบจุลินทรีย์หรือการทดสอบปริมาณการติดเชื้อในเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง 50 เปอร์เซ็นต์ (TCID ₅₀ ) (ดูด้านล่าง) แต่ก็อาจมีราคาแพงกว่าในแง่ของสารเคมีและอุปกรณ์ที่จำเป็น เวลาที่ใช้ในการทดสอบยังขึ้นอยู่กับขนาดของพื้นที่ที่ผู้ใช้กำลังนับด้วย พื้นที่ขนาดใหญ่จะใช้เวลานานขึ้น แต่สามารถให้ผลลัพธ์ที่แม่นยำกว่าของตัวอย่าง ผลลัพธ์ของ FFA จะแสดงเป็นหน่วยการก่อตัวของจุดโฟกัสต่อมิลลิลิตร หรือ FFU/mL ^{[ 6 ]}

การทดสอบ TCID ₅₀ (50% tissue culture infectious dose) เป็นการวัดความเข้มข้น ของไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อ การทดสอบการเจือจางแบบจุดสิ้นสุดนี้จะวัดปริมาณไวรัสที่จำเป็นในการติดเชื้อโฮสต์ที่ติดเชื้อ 50% หรือทำให้เกิดผลกระทบต่อเซลล์ในตัวอย่างเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ฉีดเชื้อ 50% การทดสอบนี้อาจพบได้บ่อยในงานวิจัยทางคลินิกที่ต้องกำหนดปริมาณไวรัสที่ทำให้ถึงแก่ชีวิต หรือหากไวรัสไม่ก่อตัวเป็นคราบ เมื่อใช้ในบริบทของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เซลล์โฮสต์จะถูกเพาะเลี้ยงและเติมไวรัสที่เจือจางเป็นลำดับ หลังจากบ่มแล้ว เปอร์เซ็นต์การตายของเซลล์ (เช่น เซลล์ที่ติดเชื้อ) จะถูกสังเกตและบันทึกด้วยตนเองสำหรับไวรัสที่เจือจางแต่ละระดับ และผลลัพธ์จะถูกนำมาใช้ในการคำนวณทางคณิตศาสตร์เพื่อหาค่า TCID ₅₀ ^{[ 6 ] [ 7 ]}เนื่องจากความแตกต่างที่ชัดเจนในวิธีการและหลักการของการทดสอบ TCID ₅₀และ pfu/mL หรือผลการทดสอบการติดเชื้ออื่นๆ จึงไม่เท่ากัน วิธีนี้อาจใช้เวลานานถึงหนึ่งสัปดาห์เนื่องจากเวลาในการติดเชื้อของเซลล์^{[ 8 ]}

สองวิธีที่นิยมใช้ในการคำนวณ TCID ₅₀ (ซึ่งสามารถใช้ในการคำนวณค่าจุดสิ้นสุด 50% ประเภทอื่นๆ เช่นEC ₅₀ , IC ₅₀และLD ₅₀ ได้เช่นกัน ) ได้แก่:

• Spearman–Kärber ^{[ 9 ]}
• วิธีรีด-มุนช์

ความ สัมพันธ์ เชิงทฤษฎีระหว่าง TCID ₅₀และ PFU โดยประมาณคือ 0.69 PFU = 1 TCID ₅₀โดยอิงตามการแจกแจงแบบปัวซง [ ^{10 ] ซึ่ง}เป็นการแจกแจงความน่าจะเป็นที่อธิบายว่าเหตุการณ์สุ่ม (อนุภาคไวรัส) ที่เกิดขึ้นในอัตราเฉลี่ยที่ทราบ (ความเข้มข้นของไวรัส) มีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นในพื้นที่คงที่ (ปริมาณของตัวกลางไวรัสในหลุม) มากน้อยเพียงใด อย่างไรก็ตาม ต้องเน้นย้ำว่าในทางปฏิบัติ ความสัมพันธ์นี้อาจไม่เป็นจริงแม้แต่กับไวรัส + เซลล์ชนิดเดียวกัน เนื่องจากวิธีการทดสอบทั้งสองแบบถูกตั้งค่าแตกต่างกัน และการติดเชื้อของไวรัสมีความไวต่อปัจจัยต่างๆ มากมาย เช่น อายุของเซลล์ ตัวกลางที่ใช้เคลือบ ฯลฯ แต่เอกสารอ้างอิงต่อไปนี้กำหนดความสัมพันธ์ที่แตกต่างออกไป:

จากATCC : "สมมติว่าใช้ระบบเซลล์เดียวกัน ไวรัสสร้างคราบจุลินทรีย์บนเซลล์เหล่านั้น และไม่มีขั้นตอนใด ๆ ที่จะยับยั้งการสร้างคราบจุลินทรีย์ ไวรัสเข้มข้น 1 มิลลิลิตร น่าจะมีจำนวนหน่วยสร้างคราบจุลินทรีย์ (PFU) ประมาณครึ่งหนึ่งของค่า TCID50 นี่เป็นเพียงการประมาณการ แต่เป็นไปตามหลักการที่ว่า การเจือจางที่จำกัดซึ่งจะทำให้เซลล์ ₅₀ % ติดเชื้อ มักจะคาดว่าจะสร้างคราบจุลินทรีย์เพียงหนึ่งคราบในเซลล์ที่ติดเชื้อในตอนแรก ในบางกรณี อาจเกิดคราบจุลินทรีย์สองคราบขึ้นไปโดยบังเอิญ ดังนั้นจำนวน PFU ที่แท้จริงควรได้รับการตรวจสอบโดยการทดลอง"

"ในทางคณิตศาสตร์ ค่า PFU ที่คาดหวังจะมากกว่าครึ่งหนึ่งของ TCID ₅₀ เล็กน้อย เนื่องจากหลอดทดลองที่เป็นลบใน TCID ₅₀แทนหน่วยก่อคราบจุลินทรีย์เป็นศูนย์ และหลอดทดลองที่เป็นบวกแต่ละหลอดแทนหน่วยก่อคราบจุลินทรีย์หนึ่งหน่วยขึ้นไป การประมาณค่าที่แม่นยำยิ่งขึ้นได้จากการใช้การแจกแจงแบบปัวซง โดยที่⁠ ⁠${\displaystyle P(o)}$คือสัดส่วนของหลอดทดลองที่เป็นลบ และ m คือจำนวนหน่วยติดเชื้อเฉลี่ยต่อปริมาตร (PFU/ml) ⁠ ⁠${\displaystyle P(o)=\exp(-m)}$สำหรับค่าไทเตอร์ใดๆ ที่แสดงเป็น TCID ₅₀ ⁠ ⁠${\displaystyle P(o)=0.5}$ดังนั้น⁠ ⁠${\displaystyle \exp(-m)=0.5}$และ⁠ ⁠${\displaystyle m=-\ln 0.5}$ซึ่งมีค่าประมาณ 0.7 "

"ดังนั้น เราจึงสามารถคูณค่า TCID ₅₀ (ต่อมิลลิลิตร) ด้วย 0.7 เพื่อทำนายค่าเฉลี่ยของจำนวน PFU/มิลลิลิตรได้ เมื่อนำการคำนวณดังกล่าวไปใช้จริง โปรดจำไว้ว่าค่าเฉลี่ยที่คำนวณได้จะใช้ได้ก็ต่อเมื่อการเปลี่ยนแปลงในโปรโตคอลที่จำเป็นสำหรับการมองเห็นคราบจุลินทรีย์ไม่เปลี่ยนแปลงการแสดงออกของไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อ เมื่อเปรียบเทียบกับการแสดงออกภายใต้เงื่อนไขที่ใช้สำหรับ TCID ₅₀ "

"ดังนั้น โดยประมาณการทำงาน เราสามารถสันนิษฐานได้ว่าวัสดุที่มี TCID ₅₀เท่ากับ 1 × 10 ⁵ TCID ₅₀ /mL จะสร้าง 0.7 × 10 ⁵ PFUs/mL" ^{[ 11 ]}

มีวิธีการตรวจวัดปริมาณไวรัสโดยใช้โปรตีนและแอนติบอดีหลายแบบ โดยทั่วไปแล้ว วิธีเหล่านี้จะวัดปริมาณโปรตีนทั้งหมดหรือปริมาณโปรตีนไวรัสเฉพาะในตัวอย่าง มากกว่าที่จะวัดจำนวนเซลล์ที่ติดเชื้อหรืออนุภาคไวรัส การวัดปริมาณมักอาศัย การตรวจ จับสีหรือ การเรือง แสง วิธีการตรวจวัดบางแบบวัดโปรตีนโดยตรงในตัวอย่าง ในขณะที่วิธีการอื่นๆ ต้องมีการติดเชื้อในเซลล์เจ้าบ้านและการบ่มเพาะเพื่อให้ไวรัสเจริญเติบโตก่อนการวัดปริมาณ วิธีการที่ใช้ขึ้นอยู่กับปริมาณโปรตีน (เช่นโปรตีนไวรัส ) ในตัวอย่างเริ่มต้นและความไวของวิธีการตรวจวัดนั้นเอง หากจำเป็นต้องมีการบ่มเพาะและการเจริญเติบโตของไวรัส มักจะต้องทำการสลาย/ย่อยเซลล์และ/หรือไวรัสก่อนการวิเคราะห์ วิธีการตรวจวัดโดยใช้โปรตีนส่วนใหญ่ค่อนข้างรวดเร็วและมีความไวสูง แต่ต้องใช้มาตรฐานคุณภาพสำหรับการสอบเทียบที่แม่นยำ และวัดปริมาณโปรตีน ไม่ใช่ความเข้มข้นของอนุภาคไวรัสที่แท้จริง ด้านล่างนี้เป็นตัวอย่างเฉพาะของวิธีการตรวจวัดโดยใช้โปรตีนที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย

การทดสอบการจับกลุ่มของเม็ดเลือดแดง (HA) เป็นการทดสอบการหาปริมาณโปรตีนแบบไม่ใช้ฟลูออเรสเซนต์ที่ใช้กันทั่วไปสำหรับไวรัสไข้หวัดใหญ่โดยอาศัยข้อเท็จจริงที่ว่าเฮมากลูตินินซึ่งเป็นโปรตีนบนพื้นผิวของไวรัสไข้หวัดใหญ่ จะทำให้เม็ดเลือดแดงจับกลุ่มกัน (กล่าวคือ ทำให้เม็ดเลือดแดงจับตัวเป็นก้อน) ในการทดสอบนี้ ตัวอย่างไวรัสไข้หวัดใหญ่ที่เจือจางแล้วจะถูกนำไปบ่มกับ สารละลาย เม็ดเลือดแดง 1% เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง และจะตรวจสอบความเจือจางของไวรัสที่ทำให้เกิดการจับกลุ่มเป็นครั้งแรกด้วยสายตา การทดสอบจะให้ผลลัพธ์เป็นหน่วยการจับกลุ่มของเม็ดเลือดแดง (HAU) โดยอัตราส่วน PFU ต่อ HAU ทั่วไปจะอยู่ในช่วง^{10⁶ [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]} การทดสอบนี้ใช้เวลาประมาณ 1-2 ชั่วโมงในการดำเนินการให้เสร็จสิ้น

การทดสอบการยับยั้งการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง (Hemagglutination Inhibition Assay) เป็นรูปแบบทั่วไปของการทดสอบ HA ที่ใช้ในการวัดระดับแอนติบอดีเฉพาะไข้หวัดใหญ่ในซีรั่มเลือด ในรูปแบบนี้ แอนติบอดีในซีรั่มต่อไวรัสไข้หวัดใหญ่จะขัดขวางการเกาะติดของไวรัสกับเม็ดเลือดแดง ดังนั้น การเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดงจะถูกยับยั้งเมื่อมีแอนติบอดีอยู่ในความเข้มข้นที่เพียงพอ^{[ 15 ]}

การ ทดสอบ กรดไบซินโคนินิก (BCA; หรือที่รู้จักกันในชื่อการทดสอบสมิธ) อาศัย การวัด สีแบบ ง่ายๆ และเป็นวิธีการหาปริมาณโปรตีนที่ใช้กันทั่วไป^{[ 16 ]}

BCA คล้ายกับ การทดสอบโปรตีนของ LowryหรือBradford น้ำยา ทดสอบ BCA ได้รับการพัฒนาและผลิตเชิงพาณิชย์ครั้งแรกโดยบริษัท Pierce Chemical Company (ปัจจุบันเป็นของThermo Fisher Scientific ) ซึ่งถือสิทธิบัตรจนถึงปี 2549 ^{[ 17 ] [ 18 ]}

ในการทดสอบ BCA พันธะเปปไทด์ของโปรตีนจะลด Cu ²⁺ให้เป็น Cu ¹⁺ ในเชิงปริมาณ ซึ่งทำให้เกิดสีฟ้าอ่อน BCA จะคีเลต Cu ¹⁺ในอัตราส่วน 2:1 ส่งผลให้เกิดสารที่มีสีเข้มขึ้นซึ่งดูดกลืนแสงที่ 562 นาโนเมตรการดูดกลืนแสงของตัวอย่างที่ 562 นาโนเมตรจะใช้ในการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนโดยรวมในตัวอย่าง ผลการทดสอบจะถูกเปรียบเทียบกับเส้นโค้งมาตรฐานที่ทราบหลังจากวิเคราะห์ด้วยสเปกโทรโฟโตมิเตอร์หรือเครื่องอ่านเพลท^{[ 19 ]} เวลาในการทดสอบทั้งหมดคือ 30 นาทีถึงหนึ่งชั่วโมง แม้ว่าการทดสอบนี้จะแพร่หลายและรวดเร็ว แต่ก็ขาดความจำเพาะต่อโปรตีนของไวรัส เนื่องจากนับโปรตีนทั้งหมดในตัวอย่าง ดังนั้นการเตรียมไวรัสที่จะวัดปริมาณจะต้องบริสุทธิ์สูงและปราศจากโฮสต์ เซรั่ม ตัวพา หรือโปรตีนอื่นๆ

การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนต์แบบเชื่อมโยงเอนไซม์ ( ELISA ) เป็นการ ทดสอบที่ใช้ แอนติบอดีโดยใช้ แอนติบอดีจำเพาะต่อ แอนติเจนที่เชื่อมโยงทางเคมีกับเอนไซม์ (หรือจับกับแอนติบอดีตัวที่สองที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์) เพื่อตรวจจับปริมาณแอนติเจนที่ไม่ทราบค่า (เช่น โปรตีนไวรัส) ในตัวอย่าง เหตุการณ์การจับกันระหว่างแอนติบอดีและแอนติเจนจะถูกตรวจจับและ/หรือหาปริมาณผ่านความสามารถของเอนไซม์ในการเปลี่ยน รีเอเจนต์ซับ สเตรตให้กลายเป็นสัญญาณที่ตรวจจับได้ ซึ่งสามารถนำมาใช้คำนวณความเข้มข้นของแอนติเจนเป้าหมายในตัวอย่างได้^{[ 20 ]}ฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP) เป็นเอนไซม์ที่ใช้กันทั่วไปในแผนการ ELISA เนื่องจากความสามารถในการขยายสัญญาณและเพิ่มความไวของการทดสอบ

การทดสอบ ELISA มีหลายรูปแบบหรือหลายประเภท แต่โดยทั่วไปสามารถจำแนกได้เป็นแบบทางอ้อมแบบแข่งขัน แบบแซนด์วิชหรือแบบย้อนกลับ[ ^{21 ] ที่}สำคัญคือ ELISA ไม่สามารถแยกแยะระหว่างไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อหรือไวรัสที่ไม่ทำงาน ดังนั้น ELISA จึงสามารถวัดปริมาณอนุภาค/โปรตีนของไวรัสได้ แต่ไม่สามารถวัดศักยภาพหรือความสามารถในการติดเชื้อของไวรัสได้

การทดสอบ การแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบรัศมีเดี่ยว(SRID) หรือที่รู้จักกันในชื่อวิธี Mancini เป็นการทดสอบโปรตีนที่ตรวจจับปริมาณแอนติเจนไวรัสจำเพาะโดยการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันในตัวกลางกึ่งแข็ง (เช่น วุ้น) ตัวกลางประกอบด้วยแอนติเซรัมที่จำเพาะต่อแอนติเจนที่สนใจ และแอนติเจนจะถูกวางไว้ตรงกลางของแผ่นดิสก์ เมื่อแอนติเจนแพร่กระจายเข้าไปในตัวกลาง มันจะสร้างวงแหวนตกตะกอนที่เติบโตจนกว่าจะถึงสมดุล เวลาในการทดสอบอาจแตกต่างกันไปตั้งแต่ 10 ชั่วโมงถึงหลายวัน ขึ้นอยู่กับเวลาในการปรับสมดุลของแอนติเจนและแอนติบอดี เส้นผ่านศูนย์กลางของโซนจากวงแหวนมีความสัมพันธ์เชิงเส้นกับลอการิทึมของความเข้มข้นของโปรตีน และจะถูกนำไปเปรียบเทียบกับเส้นผ่านศูนย์กลางของโซนสำหรับมาตรฐานโปรตีนที่ทราบเพื่อการหาปริมาณ^{[ 22 ]}การทดสอบ ELISA ซึ่งต้องการวัสดุน้อยกว่าและง่ายต่อการดำเนินการ/ตีความ ได้เข้ามาแทนที่การทดสอบการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันเป็นเครื่องมือวินิจฉัยเป็นส่วนใหญ่

การตรวจวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณใช้ เคมี ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสเพื่อขยายDNAหรือRNA ของไวรัส ให้มีความเข้มข้นสูงพอสำหรับการตรวจจับและการหาปริมาณด้วยฟลูออเรสเซนซ์ โดยทั่วไป การหาปริมาณด้วย qPCR อาศัยการเจือจางแบบอนุกรมของสารมาตรฐานที่มีความเข้มข้นที่ทราบแล้ว ซึ่งจะถูกวิเคราะห์ควบคู่ไปกับตัวอย่างที่ไม่ทราบค่าสำหรับการสอบเทียบและการอ้างอิง การตรวจจับเชิงปริมาณสามารถทำได้โดยใช้กลยุทธ์การตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์ที่หลากหลาย รวมถึงโพรบ เฉพาะลำดับหรือสีย้อมฟลูออเรสเซนซ์ ที่ไม่จำเพาะ เช่นSYBR Green ^{[ 23 ]} โพรบเฉพาะลำดับ เช่นTaqMan Molecular Beacons หรือ Scorpion จะจับกับ DNA ที่มีลำดับที่เหมาะสมที่ผลิตขึ้นระหว่างปฏิกิริยาเท่านั้น สีย้อม SYBR Green จะจับกับ DNA สองสายทั้งหมด^{[ 24 ]}ที่ผลิตขึ้นระหว่างปฏิกิริยา

แม้ว่า SYBR Green จะใช้งานง่าย แต่เนื่องจากขาดความจำเพาะและมีความไว ต่ำ ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่จึงใช้แผนการตรวจจับ qPCR แบบใช้โพรบแทน มี qPCR หลายรูปแบบ รวมถึงวิธีการเปรียบเทียบเกณฑ์ ซึ่งช่วยให้สามารถหาปริมาณสัมพัทธ์ได้โดยการเปรียบเทียบค่า Ct (รอบ PCR ที่แสดงการเพิ่มขึ้นของผลิตภัณฑ์อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ) จากตัวอย่างหลายตัวอย่างที่รวมถึงมาตรฐานภายใน^{[ 25 ]}

PCR ขยายกรดนิวคลีอิก เป้าหมายทั้งหมด รวมถึงกรดนิวคลีอิกที่มาจากอนุภาคไวรัสที่ติดเชื้อได้อย่างสมบูรณ์ อนุภาคไวรัสที่บกพร่อง และกรดนิวคลีอิกอิสระในสารละลาย ด้วยเหตุนี้ ผลลัพธ์ของ qPCR (แสดงในรูปของจำนวนสำเนาจีโนม/มิลลิลิตร) จึงมีแนวโน้มที่จะมีปริมาณสูงกว่าผลลัพธ์ของ TEM สำหรับการหาปริมาณไวรัส อัตราส่วนของไวรัสทั้งหมดต่อจำนวนสำเนาของกรดนิวคลีอิกนั้นไม่ค่อยเป็น 1 ต่อ 1 เนื่องจากในระหว่างการจำลองแบบของไวรัส กรดนิวคลีอิกและโปรตีนของไวรัสไม่ได้ถูกผลิตในอัตราส่วน 1:1 เสมอไป และกระบวนการประกอบไวรัสส่งผลให้เกิดไวรัสที่สมบูรณ์ รวมถึงแคปซิดที่ว่างเปล่า และ/หรือจีโนมไวรัสอิสระส่วนเกิน ในตัวอย่างของ ไวรัสโรค ปากและเท้าเปื่อยอัตราส่วนของไวรัสทั้งหมดต่อจำนวนสำเนา RNA ภายในเซลล์โฮสต์ที่กำลังจำลองแบบอย่างแข็งขันนั้นอยู่ที่ประมาณ 1:1000 ^{[ 26 ]}ข้อดีของการไทเทรตด้วย qPCR ได้แก่ ระยะเวลาดำเนินการที่รวดเร็ว (1–4 ชั่วโมง) และความไว (สามารถตรวจจับความเข้มข้นของไวรัสที่ต่ำกว่าวิธีอื่นได้มาก)

การตรวจจับพัลส์ความต้านทานที่ปรับได้ (TRPS) เป็นวิธีการที่ช่วยให้สามารถ วัดอนุภาคเดี่ยวของอนุภาคไวรัสแต่ละตัว ได้อย่างรวดเร็ว เนื่องจากอนุภาคไวรัสจะถูกขับเคลื่อนผ่าน รูพรุนนาโนที่ปรับขนาดได้ทีละตัว^{[ 27 ]}เทคนิคนี้มีข้อดีคือสามารถกำหนดขนาดและความเข้มข้นของอนุภาคไวรัสในสารละลายได้พร้อมกันด้วยความละเอียดสูง ซึ่งสามารถนำไปใช้ในการประเมินความเสถียรของตัวอย่างและการมีส่วนร่วมของสารรวมกลุ่ม ตลอดจนความเข้มข้นของอนุภาคไวรัสทั้งหมด (vp/mL) ^{[ 28 ]}

การวัดด้วยวิธี TRPS เกิดขึ้นในบัฟเฟอร์ไอออนิก และไม่จำเป็นต้องย้อมสีตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์ ดังนั้นเทคนิคนี้จึงรวดเร็วกว่าวิธีที่ต้องมีการเตรียมตัวอย่างด้วยสีย้อมเรืองแสง โดยใช้เวลารวมในการเตรียมและวัดผลน้อยกว่า 10 นาทีต่อตัวอย่าง การวิเคราะห์ไวรัสด้วยวิธี TRPS มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ผ่านระบบ qViro-Xซึ่งสามารถฆ่าเชื้อด้วยสารเคมีโดยการนึ่งฆ่าเชื้อหลังจากการวัดเสร็จสิ้นแล้ว

เทคนิคนี้คล้ายกับ Single Particle Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy (SP ICP-MS ) ที่ค้นพบโดย Degueldre และ Favarger (2003) ^{[ 29 ]}และต่อมาได้ปรับใช้กับอนุภาคนาโนอื่นๆ (เช่น คอลลอยด์ทองคำ ดู Degueldre et al. (2006)) ^{[ 30 ]} SP ICP-MS ได้รับการปรับใช้สำหรับการวิเคราะห์ Single Virus Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy (SV ICPMS) ในการศึกษาที่ครอบคลุม เช่น Degueldre (2021) ^{[ 31 ]}การศึกษานี้แนะนำให้ปรับวิธีการนี้สำหรับการระบุและการนับไวรัสเดี่ยว (SV) ด้วยบันทึก ICP-MS แบบ multi-channel sector field (MC SF) ความละเอียดสูงในโหมดการตรวจจับ SV การนับไอออนหลักและไอออนสำคัญจะช่วยให้สามารถวิเคราะห์และระบุไวรัสเดี่ยวได้ การนับหน่วยไวรัส 2-500 หน่วยสามารถทำได้ภายใน 20 วินาที มีการเสนอให้ทำการวิเคราะห์ในหัวเผาอาร์กอนสำหรับไอออน หลัก ได้แก่ 12C+, 13C+, 14N+, 15N+ และไอออนสำคัญ 31P+, 32S+, 33S+ และ 34S+ มีการอธิบายรายละเอียดเกี่ยวกับสิ่งรบกวนทั้งหมด แนะนำให้ใช้ MC ICP-MS ที่มีความละเอียดสูง ในขณะที่กำลังสำรวจตัวเลือกต่างๆ เกี่ยวกับบรรยากาศแบบไร้ออกซิเจน/มีออกซิเจน เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการวิเคราะห์เมื่อใช้ quadrupole ICP-MS มีการศึกษาการประยุกต์ใช้กับไวรัสสองชนิด (SARS-COV2 และแบคทีริโอเฟจ T5) โดยใช้การวิเคราะห์แบบสแกนเวลาและมวลคงที่สำหรับไอออนไวรัสที่เลือกไว้ ซึ่งช่วยให้สามารถระบุชนิดของไวรัสได้โดยใช้สัดส่วนโมลาร์ N/C, P/C และ S/C และการหาปริมาณความเข้มข้นของจำนวนไอออนเหล่านั้น

แม้ว่าเครื่องตรวจวัดเซลล์ไหลส่วนใหญ่จะไม่มีความไวเพียงพอ แต่ก็มีเครื่องตรวจวัดเซลล์ไหลเชิงพาณิชย์บางรุ่นที่สามารถใช้สำหรับการหาปริมาณไวรัสได้ เครื่องนับไวรัสจะหาปริมาณอนุภาคไวรัสที่สมบูรณ์ในตัวอย่างโดยใช้การเรืองแสงเพื่อตรวจจับโปรตีนและกรดนิวคลีอิกที่อยู่ร่วมกัน ตัวอย่างจะถูกย้อมด้วยสีย้อมสองชนิด ชนิดหนึ่งจำเพาะสำหรับโปรตีนและอีกชนิดหนึ่งจำเพาะสำหรับกรดนิวคลีอิก และวิเคราะห์ขณะที่ไหลผ่านลำแสงเลเซอร์ ปริมาณอนุภาคที่สร้างเหตุการณ์พร้อมกันในแต่ละช่องสัญญาณเรืองแสงสองช่องที่แตกต่างกันจะถูกกำหนด พร้อมกับอัตราการไหลของตัวอย่างที่วัดได้ เพื่อคำนวณความเข้มข้นของอนุภาคไวรัส (vp/mL) ^{[ 32 ]} ผลลัพธ์โดยทั่วไปจะมีปริมาณสัมบูรณ์ใกล้เคียงกับผลลัพธ์จาก TEM การทดสอบมีช่วงการทำงานเชิงเส้นที่ 10 ⁵ –10 ⁹ vp/mL และเวลาในการวิเคราะห์ประมาณ 10 นาที โดยมีเวลาในการเตรียมตัวอย่างสั้น

ภาพถ่าย TEM ของไวรัสโปลิโอด้วยวิธีย้อมสีลบ แถบมาตราส่วน = 50 นาโนเมตร

ส่วนตัดเนื้อเยื่อฝังตัวของไวรัส H1N1 สายพันธุ์ใหม่

TEM is a specialized type of microscopy that utilizes a beam of electrons focused with a magnetic field to image a sample. TEM provides imaging with 1000x greater spatial resolution than a light microscope (resolution down to 0.2 nm).^[33] An ultrathin, negatively stained sample is required. Sample preparations involve depositing specimens onto a coated TEM grid and negative staining with an electron-opaque liquid.^[34] Tissue embedded samples can also be examined if thinly sectioned. Sample preparations vary depending on protocol and user but generally require hours to complete. TEM images can show individual virus particles and quantitative image analysis can be used to determine virus concentrations. These high resolution images also provide particle morphology information that most other methods cannot. Quantitative TEM results will often be greater than results from other assays as all particles, regardless of infectivity, are quantified in the reported virus-like particles per mL (vlp/mL) result. Quantitative TEM generally works well for virus concentrations greater than 10⁶ particles/mL. Because of high instrument cost and the amount of space and support facilities needed, TEM equipment is only available in a few laboratories.

• List of subviral agents
• Minimal infective dose
• Viral load

• Mitra, Anirban; Ignatovich, Filipp; Novotny, Lukas (มกราคม 2012). "การตรวจจับไวรัสเดี่ยวของมนุษย์และแบคทีเรียแบบเรียลไทม์ด้วยแสงโดยอาศัยการแทรกสอดแบบสนามมืด" . Biosensors and Bioelectronics . 31 (1): 499– 504. doi : 10.1016/j.bios.2011.11.025 . PMC  3256558 . PMID  22169818 .
• Ganesh, Atheesha; Lin, Johnson; Singh, Moganavelli (เมษายน 2014). "การตรวจจับอนุภาคคล้ายไวรัสจากแม่น้ำ Umgeni ประเทศแอฟริกาใต้" CLEAN – Soil, Air, Water . 42 (4): 393– 407. Bibcode : 2014CSAW...42..393G . doi : 10.1002/clen.201200564 . PMC  7159345 . PMID  32313584 .