TNP-ATPเป็นโมเลกุลเรืองแสง ที่สามารถระบุได้ว่าโปรตีนจับกับATP หรือ ไม่ และค่าคงที่ที่เกี่ยวข้องกับการจับนั้น โดยส่วนใหญ่ใช้ในสเปกโทรสโกปีแบบเรืองแสงแต่ยังมีประโยชน์มากในฐานะโมเลกุลตัวรับในFRETและในฐานะโพรบ เรืองแสง ในกล้องจุลทรรศน์ เรืองแสง และผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์^{[ 1 ]}

TNP หมายถึงสารประกอบทางเคมี 2,4,6-ไตรไนโตรฟีนอล หรือที่รู้จักกันในชื่อกรดพิคริก^{[ 2 ]}เป็นส่วนประกอบหลักของทุ่นระเบิดที่ยังไม่ระเบิดหลายชนิด และเป็นญาติกับTNTแต่มีความเสถียรน้อยกว่า^{[ 2 ]}ได้รับการยอมรับว่าเป็นสารปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อมและเป็นพิษต่อสิ่งมีชีวิตหลายชนิด^{[ 2 ]}ยังคงใช้กันอย่างแพร่หลายในการผลิตดอกไม้ไฟวัตถุระเบิดและเชื้อเพลิงจรวดรวมถึงในอุตสาหกรรมเครื่องหนัง ยา และสีย้อม^{[ 2 ]}

ATPเป็นตัวกลางที่จำเป็นต่อชีวิต^{[ 1 ]}มันถูกใช้เพื่อเอาชนะอุปสรรคทางพลังงานที่ไม่เอื้ออำนวยเพื่อเริ่มต้นและขับเคลื่อนปฏิกิริยาเคมี^{[ 1 ]}นอกจากนี้ยังใช้ในการขับเคลื่อนเครื่องจักรทางชีวภาพและควบคุมกระบวนการต่างๆ ผ่านการฟอสโฟรีเลชันของโปรตีน[ 1 ^{]อย่างไรก็ตามโปรตีน}ที่จับกับ ATP สำหรับทั้งการควบคุมและ ปฏิกิริยา ของเอนไซม์นั้นมีความหลากหลายมาก—หลายชนิดยังไม่ถูกค้นพบ—และสำหรับโปรตีนหลายชนิด ความสัมพันธ์ของพวกมันกับ ATP ในแง่ของจำนวนไซต์การจับค่าคงที่การจับและค่าคงที่การแยกตัวยังคงไม่ชัดเจน^{[ 1 ]}

การเชื่อมต่อ TNP กับ ATP ทำให้ไตรฟอสเฟตนิวคลีโอไทด์นี้เรืองแสงและมีสี ในขณะที่ยังคงรักษาการทำงานทางชีวภาพไว้ได้^{[ 1 ]}ดังนั้น TNP-ATP จึงเป็น อะนาล็อกเรืองแสง ของ ATP ^{[ 3 ]}การเชื่อมต่อนี้มีประโยชน์มากในการให้ข้อมูลเกี่ยวกับการโต้ตอบระหว่าง ATP กับโปรตีนที่จับกับ ATP เนื่องจาก TNP-ATP โต้ตอบกับโปรตีนและเอนไซม์ในฐานะตัวแทนของนิวคลีโอไทด์ดั้งเดิม และมีความสัมพันธ์ในการจับที่แข็งแกร่งกับระบบส่วนใหญ่ที่ต้องการ ATP ^{[ 1 ]}

TNP ถูกกระตุ้นด้วยความยาวคลื่น 408 และ 470  นาโนเมตร และเรืองแสงใน ช่วง 530–560 นาโนเมตร^{[ 1 ] [ 2 ] [ 4 ] [ 5 ]}นี่เป็นช่วงการกระตุ้นที่มีประโยชน์มากเพราะอยู่ห่างจากช่วงที่โปรตีนหรือนิวคลีโอไทด์ดูดซับ^{[ 1 ]}เมื่อ TNP-ATP อยู่ในน้ำหรือสารละลายในน้ำอื่นๆ การปล่อยแสงนี้จะอ่อนมาก^{[ 1 ] [ 6 ]}อย่างไรก็ตาม เมื่อ TNP-ATP จับกับโปรตีนความเข้มของการเรืองแสงจะเพิ่มขึ้นอย่างมาก^{[ 1 ] [ 3 ] [ 5 ] [ 6 ]}คุณสมบัตินี้ช่วยให้นักวิจัยสามารถศึกษาปฏิสัมพันธ์การจับกันของโปรตีนต่างๆ กับ ATP ได้ ดังนั้น ด้วยการเรืองแสงที่เพิ่มขึ้น จึงสามารถมองเห็นได้ว่าโปรตีนจับกับ ATP หรือไม่^{[ 1 ]}

เมื่อ TNP-ATP ในน้ำถูกกระตุ้นด้วยแสงที่ความยาวคลื่น 410  นาโนเมตร TNP-ATP จะแสดงค่าการเรืองแสงสูงสุดเพียงค่าเดียวที่ 561  นาโนเมตร^{[ 6 ]}ค่าสูงสุดนี้จะเปลี่ยนแปลงไปตามความหนืดของของเหลว ตัวอย่างเช่น ในN,N-dimethylformamideแทนที่จะมีค่าสูงสุดที่ 561  นาโนเมตรเหมือนในน้ำ ค่าสูงสุดจะอยู่ที่ 533  นาโนเมตร แทน ^{[ 6 ]}

การจับกับโปรตีนจะทำให้ความยาวคลื่นของการปล่อยแสงสูงสุดเปลี่ยนแปลงไปด้วย รวมถึงการเปลี่ยนแปลงความเข้มของการเรืองแสงด้วย^{[ 6 ]}ตัวอย่างเช่น การจับกับ โปรตีน เคโมแท็กซิส CheA แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของความเข้มของการเรืองแสงหลายเท่าและการเลื่อนไปทางสีน้ำเงินของความยาวคลื่นของการปล่อยแสงสูงสุด^{[ 6 ]}

การใช้สารอะนาล็อกนิวคลีโอไทด์ TNP นี้ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีประสิทธิภาพเหนือกว่าเทคนิคการติดฉลากนิวคลีโอไท ด์กัมมันตรังสีแบบดั้งเดิมในหลายกรณี ^{[ 1 ]}ความกังวลด้านสุขภาพและค่าใช้จ่ายที่เกี่ยวข้องกับการใช้ไอโซโทป กัมมันตรังสี ทำให้ TNP-ATP เป็นทางเลือกที่น่าสนใจ^{[ 1 ]}

ATP ที่ดัดแปลงด้วย ไรโบสเรืองแสงตัวแรกคือ 2',3'-O-(2,4,7-trinitrocyclohexadienylidene) adenosine 5'triphosphate (TNP-ATP) ซึ่งถูกนำเสนอในปี 1973 โดย Hiratsuka และ Uchida ^{[ 1 ] [ 4 ]} TNP-ATP ถูกสังเคราะห์ขึ้นครั้งแรกเพื่อตรวจสอบตำแหน่งการจับ ATP ของ ไมโอซิ นATPase ^{[ 1 ] [ 3 ]}รายงานความสำเร็จของ TNP-ATP ในการตรวจสอบโปรตีนมอเตอร์ นี้ ทำให้มีการขยายการใช้ TNP-ATP ไปยังโปรตีนและเอนไซม์อื่นๆ^{[ 1 ]}ปัจจุบัน TNP-ATP ถูกใช้เป็น โพรบ ทางสเปกโทรสโกปีสำหรับโปรตีนจำนวนมากที่สงสัยว่ามีปฏิสัมพันธ์กับ ATP ^{[ 1 ]}ซึ่งรวมถึงโปรตีนไคเนส หลายชนิด ATPases ไมโอซินและโปรตีนที่จับกับนิวคลีโอไทด์อื่นๆ^{[ 1 ]}ในช่วงยี่สิบปีที่ผ่านมา มีเอกสารหลายร้อยฉบับที่อธิบายถึงการใช้งานและการประยุกต์ใช้ TNP-ATP ^{[ 1 ]}การประยุกต์ใช้หลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์นี้ได้ช่วยชี้แจงความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและหน้าที่ของโปรตีนและเอนไซม์ที่ต้องการ ATP จำนวนมาก^{[ 1 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}นอกจากนี้ยังมีเอกสารจำนวนมากขึ้นเรื่อยๆ ที่แสดงให้เห็นถึงการใช้ TNP-ATP เป็นวิธีการประเมินความสามารถในการจับ ATP ของโปรตีนกลายพันธุ์ต่างๆ^{[ 1 ] [ 6 ]}

การเตรียม TNP-ATP เป็นการสังเคราะห์แบบขั้นตอนเดียวที่ค่อนข้างปลอดภัยและง่าย^{[ 1 ]}หมู่ไรโบสของอะดีโนซีนสามารถถูกไตรไนโตรฟีนิลเลตโดย 2,4,6-ไตรไนโตรเบนซีน-1-ซัลโฟเนต ( TNBS ) ^{[ 4 ]}สารประกอบที่ได้จะมีสีส้มสดใสและมีลักษณะการดูดกลืนแสงที่มองเห็นได้ ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของสารประกอบเชิงซ้อนสไปโรของ Meiseinheimer ที่เชื่อมโยงกัน^{[ 1 ] [ 4 ]}

หากต้องการทราบวิธีการเตรียมอย่างละเอียด โปรดดูบทความของ T. Hiratsuka และ K. Uchida เรื่อง"Preparation and Properties of 2'(r 3')-O(2,4,6-trinitrophenyl) Adenosine 5'-triphosphate, an Analog of Adenosine Triphosphate" ซึ่งอยู่ในส่วนเอกสารอ้างอิง

เพื่อให้ TNP-ATP กลับไปเป็นส่วนประกอบของมัน หรือกล่าวอีกนัยหนึ่งคือไฮโดรไลซ์ TNP-ATP เพื่อให้ได้กรดพิคริก (TNP) และ ATP ในปริมาณที่เท่ากัน TNP-ATP ควรได้รับการบำบัดด้วยHCl 1 M ที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1.5 ชั่วโมง^{[ 4 ]} ทั้งนี้เพราะหาก TNP-ATP ถูกทำให้เป็นกรดภายใต้สภาวะที่ไม่รุนแรง จะส่งผลให้วงแหวน ไดออกโซเลน ที่ติดอยู่กับออกซิเจน 2' เปิดออกทำให้เหลืออนุพันธ์ 3'O-TNP เป็นผลิตภัณฑ์เพียงอย่างเดียว^{[ 1 ]}

ควรเก็บ TNP-ATP ไว้ที่อุณหภูมิ -20  °C ในที่มืด และใช้งานภายใต้สภาพแสงน้อยที่สุด^{[ 6 ]}เมื่ออยู่ในสารละลาย TNP-ATP จะมีอายุการเก็บรักษาประมาณ 30 วัน

เมื่อวัดการดูดกลืนแสงเทียบกับความยาวคลื่นที่ค่า pH ต่างๆ การเปลี่ยนแปลงที่ความยาวคลื่น 408  นาโนเมตรและ 470  นาโนเมตรให้ เส้นโค้ง รูปตัว Sโดยมีจุดกึ่งกลางอยู่ที่ 5.1 ^{[ 4 ]}ซึ่งบ่งชี้ว่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นทั้งสองนี้ขึ้นอยู่กับการแตกตัวเป็นไอออนของ ส่วน โครโมฟอร์ของ TNP-ATP และไม่ได้รับผลกระทบจากการแตกตัวเป็นไอออนของ ATP ^{[ 4 ]}แม้ว่า ค่าคงที่ การแตกตัวเป็นไอออนที่ 5.1 นี้จะไม่อยู่ในช่วงทางสรีรวิทยา แต่ก็แสดงให้เห็นแล้วว่าการดูดกลืนแสงของ TNP-ATP มีความไวเพียงพอที่จะตรวจจับการเปลี่ยนแปลงเนื่องจากการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในค่า pH ที่เป็นกลาง^{[ 4 ]} การซ้อนทับทางสเปก โทรสโก ปีบ่งชี้ว่าจุด ไอโซสเบสติกของ TNP-ATP อยู่ที่ 339  นาโนเมตร^{[ 4 ]}

ที่ความเข้มข้นต่ำของ TNP-ATP (≤1  μM) ความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์จะเป็นสัดส่วนกับความเข้มข้นของ TNP ที่เติมเข้าไป^{[ 6 ]}อย่างไรก็ตาม ที่ความเข้มข้นเกิน 1  μM ผลกระทบจากตัวกรองภายในทำให้ความสัมพันธ์นี้ไม่เป็นแบบเส้นตรงอีกต่อไป^{[ 6 ]}เพื่อแก้ไขปัญหานี้ นักวิจัยต้องกำหนดอัตราส่วนของความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ตามทฤษฎีที่คาดการณ์ไว้ (โดยสมมติว่าเป็นเส้นตรง) ต่อความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ที่สังเกตได้ แล้วจึงใช้ปัจจัยการแก้ไขนี้^{[ 6 ]}อย่างไรก็ตาม ในกรณีส่วนใหญ่ นักวิจัยจะพยายามรักษาความเข้มข้นของ TNP ให้ต่ำกว่า 1  μM ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 5 ] [ 6 ]}

To determine binding affinities, TNP-ATP is added to a solution and then titrated with protein.^[5][6] This produces a saturation curve from which the binding affinity can be determined.^[5][6] The number of binding sites may also be determined through this saturation curve by looking to see if there are sudden changes in slope.^[5] One can also titrate a fixed amount of protein with increasing additions of TNP-ATP to obtain a saturation curve.^[6] To do so, however, may get complicated due to the inner filter effects that will need to be corrected for.^[6]

To determine dissociation constants, TNP-ATP can be competed off of a protein with ATP.^[5][6] The value of the dissociation constant K for a single-site binding can then be obtained by applying the Langmuir equation for a curve fit:

${\displaystyle \mathrm {RFU_{obs}} =\mathrm {RFU_{free}} +{\frac {(\mathrm {RFU_{bound}} -\mathrm {RFU_{free}} )\times \left((\mathrm {[โปรตีน]_{total}} +\mathrm {[TNP]_{total}} +\mathrm {K_{d}} )-{\sqrt {(\mathrm {[โปรตีน]_{total}} +\mathrm {[TNP]_{total}} +\mathrm {K_{d}} )^{2}-(4\times \mathrm {[โปรตีน]_{total}} \times \mathrm {[TNP]} )}}\right)}{2\mathrm {[TNP]_{รวม}} }}}$

where RFU is relative fluorescent units, RFU is the fluorescence observed, RFU is the fluorescence of free TNP-ATP, and RFU is the fluorescence of TNP-ATP when completely bound to a protein.^[5]

To measure an ATP competitor, one can add competitor to pre-incubated samples of protein:TNP-ATP. The fraction of TNP-ATP bound to the protein can be calculated via:

${\displaystyle \theta ={\frac {\mathrm {RFU_{obs}} -\mathrm {RFU_{free}} }{\mathrm {RFU_{max}} -\mathrm {RFU_{free}} }}}$

where θ is that fraction, and RFU is the value of fluorescence intensity at saturation, meaning when 100% of TNP-ATP is bound.^[5]

The dissociation constants for TNP and competitor can then be calculated through the equation:^[5]

${\displaystyle \theta ={\frac {1}{2}}\mathrm {[TNP]} \times \left(\mathrm {K_{TNP}} +{\frac {\mathrm {K_{TNP}} }{\mathrm {K_{competitor}} }}\times \mathrm {[competitor]} +\mathrm {[TNP]} +\mathrm {[protein]} -{\sqrt {\left(\mathrm {K_{TNP}} +{\frac {\mathrm {K_{TNP}} }{\mathrm {K_{competitor}} }}\times \mathrm {[competitor]} +\mathrm {[TNP]} +\mathrm {[protein]} \right)^{2}-4\times \mathrm {[TNP]} \times \mathrm {[protein]} }}\right)}$

For reasons not yet fully understood, TNP-ATP typically binds the ATP binding sites of proteins and enzymes anywhere from one to three times tighter than regular ATP.^[1][6] The dissociation constants are usually around 0.3–50 μM.^[1]

นอกจากการใช้ TNP-ATP เพื่อตรวจสอบว่าโปรตีนจับกับ ATP หรือไม่ รวมถึงความสัมพันธ์ในการจับและค่าคงที่การแยกตัว และจำนวนตำแหน่งการจับแล้ว TNP-ATP ยังสามารถใช้ในการศึกษาการจับของลิแกนด์ ได้อีกด้วย ^{[ 1 ]}ในการทำเช่นนี้ จะเติมโปรตีนลงใน TNP-ATP เพื่อทำการไทเทรต จากนั้นจึงเติมลิแกนด์เพื่อแทนที่อะนาล็อกที่จับอยู่^{[ 1 ]}ซึ่งวัดได้จากการลดลงของฟลูออเรสเซนซ์^{[ 1 ]}นอกจากนี้ยังสามารถทำได้โดยการไทเทรตโปรตีนด้วย TNP-ATP ในสภาวะที่มีและไม่มีลิแกนด์ที่สนใจในความเข้มข้นต่างๆ กัน^{[ 1 ]}การทดลองใดๆ ก็ตามจะช่วยให้สามารถวัดความสัมพันธ์ในการจับของลิแกนด์กับโปรตีนได้

TNP-ATP ยังเป็นตัวรับฟลูออเรสเซนซ์ที่มีคุณค่าอีกด้วย^{[ 1 ] [ 2 ]}ทั้งนี้เนื่องจาก TNP-ATP เช่นเดียวกับตัวรับที่ดีอื่นๆ ดูดซับในช่วงความยาวคลื่นที่กว้าง ซึ่งสอดคล้องกับช่วงการปล่อยแสงของตัวให้FRET ทั่วไป ^{[ 2 ]}ดังนั้น TNP-ATP จึงสามารถใช้เพื่อศึกษาการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่โปรตีนประสบได้^{[ 2 ]} ตัวอย่างเช่น Na+/K+ ATPase ระยะห่างระหว่างตำแหน่งออกฤทธิ์และ Cys457 แสดงให้เห็นว่าเปลี่ยนจาก 25 อังสตรอมเป็น 28 อังสตรอมเมื่อเปลี่ยนจากโครงสร้าง Na+ เป็นโครงสร้าง K+ ^{[ 1 ]}

นอกจากสเปกโทรสโกปีแบบฟลูออเรสเซนต์แล้ว TNP-ATP ยังมีประโยชน์มากในกล้องจุลทรรศน์ แบบฟลูออเร ส เซนต์ ^{[ 1 ]}เนื่องจากมันช่วยเพิ่มความไวในการสังเกตได้อย่างมากเมื่อจับกับโปรตีน—ฟลูออเรสเซนต์ที่เพิ่มขึ้นช่วยลดปัญหาฟลูออเรสเซนต์พื้นหลังได้อย่างมาก^{[ 1 ]}โดยเฉพาะอย่างยิ่งภายใต้ การส่องสว่าง แบบเอพิฟลูออเรสเซนต์ (การส่องสว่างและแสงอยู่ด้านเดียวกันของตัวอย่าง) ^{[ 1 ]}

TNP-ATP ยังถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์โครงสร้างผลึกด้วยรังสีเอกซ์เนื่องจากสามารถใช้ในการกำหนดค่าคงที่การจับของสารตั้งต้นที่ตกผลึกได้ เทคนิคนี้ยังแสดงให้เห็นโครงสร้างของโปรตีนในกรณีที่มีหรือไม่มี TNP-ATP ซึ่งอาจตรงหรือไม่ตรงกับโครงสร้างของโปรตีนเมื่อจับกับ ATP ก็ได้^{[ 1 ] [ 6 ]}