คอลัมน์ HPLC แบบโมโนลิธิก
คอลัมน์HPLC แบบโมโนลิธิกหรือคอลัมน์โมโนลิธิก คือคอลัมน์ที่ใช้ในโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) โครงสร้างภายในของคอลัมน์โมโนลิธิกถูกสร้างขึ้นในลักษณะที่ทำให้เกิดช่องทางจำนวนมากภายในคอลัมน์ วัสดุภายในคอลัมน์ที่แยกช่องทางเหล่านี้สามารถเป็นวัสดุที่มีรูพรุนและมีฟังก์ชันการทำงาน ในทางตรงกันข้าม การกำหนดค่า HPLC ส่วนใหญ่ใช้คอลัมน์บรรจุอนุภาค ในการกำหนดค่าเหล่านี้ จะใช้เม็ดเล็กๆ ของสารเฉื่อย ซึ่งโดยทั่วไปคือซิลิกา ที่ดัดแปลงแล้ว ภายในคอลัมน์[ 1 ]คอลัมน์โมโนลิธิกสามารถแบ่งออกเป็นสองประเภท คือ โมโนลิธิกที่ใช้ซิลิกาเป็นฐานและโมโนลิธิกที่ใช้พอลิเมอร์เป็นฐาน โมโนลิธิกที่ใช้ซิลิกาเป็นฐานเป็นที่รู้จักกันดีในด้านประสิทธิภาพในการแยกโมเลกุลขนาดเล็ก ในขณะที่โมโนลิธิกที่ใช้พอลิเมอร์เป็นฐานเป็นที่รู้จักกันดีในการแยกโมเลกุลโปรตีนขนาดใหญ่
ภาพรวมเทคโนโลยี
ในโครมาโทกราฟีเชิงวิเคราะห์ เป้าหมายคือการแยกและระบุสารประกอบแต่ละชนิดในสารนั้นได้อย่างเฉพาะเจาะจง ในทางกลับกัน โครมาโทกราฟีระดับเตรียมการเป็นวิธีการทำให้บริสุทธิ์ของวัสดุจำนวนมากในสภาพแวดล้อมการผลิต วิธีการแยกพื้นฐานใน HPLC อาศัยเฟสเคลื่อนที่ (น้ำตัวทำละลายอินทรีย์ฯลฯ) ที่ไหลผ่านเฟสคงที่ (สารบรรจุซิลิกาแบบอนุภาค โมโนลิธ ฯลฯ) ในสภาพแวดล้อมปิด (คอลัมน์) ความแตกต่างในปฏิกิริยาระหว่างตัวทำละลายที่สนใจและเฟสเคลื่อนที่และเฟสคงที่ทำให้สารประกอบต่าง ๆ แตกต่างกันออกไปในชุดของปรากฏการณ์การดูดซับและการคายประจุ จากนั้นผลลัพธ์จะแสดงให้เห็นในโครมาโทแกรมที่ได้ เฟสคงที่มีให้เลือกหลายรูปแบบการบรรจุและโครงสร้างทางเคมี และสามารถปรับแต่งเพื่อเพิ่มความจำเพาะได้ คอลัมน์แบบโมโนลิธ หรือโมโนลิธ เป็นหนึ่งในหลายประเภทของโครงสร้างเฟสคงที่
ในทางโครมาโทกราฟี โมโนลิธคือโครงสร้างแท่งพรุนที่มีลักษณะเฉพาะด้วยเมโซพอรัสและแมโครพอรัส รูพรุนเหล่านี้ทำให้โมโนลิธมีการซึมผ่านสูง มีช่องทางจำนวนมาก และมีพื้นที่ผิวสูงที่พร้อมสำหรับการทำปฏิกิริยา โครงสร้างหลักของคอลัมน์โมโนลิธประกอบด้วยสารตั้งต้นอินทรีย์หรืออนินทรีย์และสามารถเปลี่ยนแปลงทางเคมีได้ง่ายสำหรับการใช้งานเฉพาะ โครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์นี้ทำให้มีคุณสมบัติทางกายภาพและเชิงกลหลายประการที่ช่วยให้สามารถทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพเมื่อเทียบกับคอลัมน์บรรจุแบบดั้งเดิม[ 2 ]
ในอดีต คอลัมน์ HPLC ทั่วไปประกอบด้วยซิลิกาอนุภาคบริสุทธิ์สูงที่อัดแน่นอยู่ในท่อสแตนเลส เพื่อลดเวลาการทำงานและเพิ่มความสามารถในการเลือกสาร จึงมีการพยายามลดระยะการแพร่กระจายให้สั้นลง เพื่อให้ได้ระยะการแพร่กระจายที่สั้นลง จึงมีการลดขนาดอนุภาคลง อย่างไรก็ตาม เมื่อขนาดอนุภาคเล็ลง แรงดันย้อนกลับ (สำหรับเส้นผ่านศูนย์กลางคอลัมน์และอัตราการไหลเชิงปริมาตรที่กำหนด) จะเพิ่มขึ้นตามสัดส่วน แรงดันแปรผกผันกับกำลังสองของขนาดอนุภาค กล่าวคือ เมื่อขนาดอนุภาคลดลงครึ่งหนึ่ง แรงดันจะเพิ่มขึ้นเป็นสี่เท่า เนื่องจากเมื่อขนาดอนุภาคเล็ลง ช่องว่างระหว่างอนุภาคก็จะเล็ลงด้วย และยากที่จะผลักดันสารประกอบผ่านช่องว่างที่เล็กลง ระบบ HPLC สมัยใหม่โดยทั่วไปได้รับการออกแบบให้ทนต่อแรงดันย้อนกลับประมาณ18,000 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว (1,200 บาร์)เพื่อแก้ไขปัญหานี้
นอกจากนี้ โมโนลิธยังมี ระยะ การแพร่กระจาย ที่สั้นมาก ในขณะเดียวกันก็มีเส้นทางหลายเส้นทางสำหรับการกระจายตัวของสารละลาย คอลัมน์อนุภาคบรรจุมีค่าการเชื่อมต่อของรูพรุนประมาณ 1.5 ในขณะที่โมโนลิธมีค่าตั้งแต่ 6 ถึงมากกว่า 10 ซึ่งหมายความว่าในคอลัมน์อนุภาค สารวิเคราะห์ที่กำหนดอาจแพร่กระจายเข้าและออกจากรูพรุนเดียวกัน หรือเข้าผ่านรูพรุนหนึ่งและออกผ่านรูพรุนที่เชื่อมต่อกัน ในทางตรงกันข้าม สารวิเคราะห์ในโมโนลิธสามารถเข้าช่องทางหนึ่งและออกผ่านช่องทางใดก็ได้ 6 ช่องทางขึ้นไป[ 3 ]พื้นผิวส่วนใหญ่ในโมโนลิธไม่สามารถเข้าถึงได้โดยสารประกอบในเฟสเคลื่อนที่ ระดับการเชื่อมต่อที่สูงในโมโนลิธทำให้เกิดข้อได้เปรียบที่เห็นได้จากแรงดันย้อนกลับต่ำและอัตราการไหลสูงที่สามารถทำได้ง่าย
โมโนลิธเหมาะอย่างยิ่งสำหรับโมเลกุล ขนาดใหญ่ แม้ว่าการทำให้บริสุทธิ์ของโมเลกุลขนาดใหญ่อาจใช้เวลานานมากก็ตาม[ 2 ]ดังที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ ขนาดอนุภาคกำลังลดลงเพื่อพยายามให้ได้ความละเอียดสูงขึ้นและการแยกที่เร็วขึ้น ซึ่งนำไปสู่แรงดันย้อนกลับที่สูงขึ้น เมื่อใช้ขนาดอนุภาคที่เล็กกว่าในการแยกโมเลกุลชีวภาพแรงดันย้อนกลับจะเพิ่มขึ้นอีกเนื่องจากขนาดโมเลกุลที่ใหญ่ขึ้น ในโมโนลิธซึ่งมีแรงดันย้อนกลับต่ำและขนาดช่องใหญ่ การแยกโมเลกุลขนาดเล็กจะมีประสิทธิภาพน้อยลง สิ่งนี้แสดงให้เห็นได้จากความสามารถในการจับแบบไดนามิก ซึ่งเป็นการวัดว่าตัวอย่างสามารถจับกับพื้นผิวของเฟสคงที่ได้มากน้อยเพียงใด ความสามารถในการจับแบบไดนามิกของโมโนลิธสำหรับโมเลกุลขนาดใหญ่อาจมากกว่าการบรรจุอนุภาคถึงสิบเท่า[ 3 ]
โมโนลิธไม่มีแรงเฉือนหรือผลกระทบจากกระแสน้ำวน การเชื่อมต่อกันสูงของรูพรุนขนาดกลางช่วยให้เกิดการไหลแบบพาความร้อนหลายเส้นทางผ่านคอลัมน์การขนส่งมวลของสารละลายผ่านคอลัมน์ไม่ได้รับผลกระทบจากอัตราการไหลมากนัก ซึ่งแตกต่างอย่างสิ้นเชิงกับการบรรจุอนุภาคแบบดั้งเดิม ซึ่งผลกระทบจากกระแสน้ำวนและแรงเฉือนมีส่วนอย่างมากต่อการสูญเสียความละเอียดและความจุ ดังที่เห็นได้ในกราฟ vanDeemter อย่างไรก็ตาม โมโนลิธอาจประสบปัญหาด้านการไหลอีกแบบหนึ่ง คือ ผลกระทบจากผนัง โดยเฉพาะอย่างยิ่งโมโนลิธซิลิกา มีแนวโน้มที่จะแยกตัวออกจากด้านข้างของตัวห่อหุ้มคอลัมน์ เมื่อเกิดเหตุการณ์นี้ การไหลของเฟสเคลื่อนที่จะเกิดขึ้นรอบๆ เฟสคงที่เช่นเดียวกับการไหลผ่าน ทำให้ความละเอียดลดลง ผลกระทบจากผนังได้รับการลดลงอย่างมากด้วยความก้าวหน้าในการสร้างคอลัมน์
ข้อดีอื่นๆ ของโมโนลิธที่เกิดจากการสร้างแบบเฉพาะตัว ได้แก่ ความสามารถในการทำซ้ำได้ดีขึ้นระหว่างคอลัมน์ต่อคอลัมน์และระหว่างชุดการผลิต เทคนิคหนึ่งในการสร้างคอลัมน์โมโนลิธคือการพอลิเมอไร ซ์ โครงสร้างในแหล่งกำเนิดซึ่งเกี่ยวข้องกับการเติมแม่พิมพ์หรือท่อคอลัมน์ด้วยส่วนผสมของโมโนเมอร์สารเชื่อมโยง สารเริ่มต้นอนุมูลอิสระ และตัวทำละลายที่ทำให้เกิดรูพรุน จากนั้นจึงเริ่มกระบวนการพอลิเมอไรซ์ภายใต้สภาวะความร้อนหรือการฉายรังสีที่ควบคุมอย่างระมัดระวัง การพอลิเมอไรซ์ในแหล่งกำเนิดของโมโนลิธช่วยหลีกเลี่ยงแหล่งที่มาหลักของความแปรปรวนระหว่างคอลัมน์ต่อคอลัมน์ ซึ่งก็คือขั้นตอนการบรรจุ[ 4 ]
นอกจากนี้ คอลัมน์อนุภาคที่บรรจุแน่นจะต้องคงอยู่ในสภาพแวดล้อมของตัวทำละลายและห้ามสัมผัสกับอากาศในระหว่างหรือหลังกระบวนการบรรจุ หากสัมผัสกับอากาศ รูพรุนจะแห้งและไม่ให้พื้นที่ผิวเพียงพอสำหรับการเกิดปฏิกิริยาอีกต่อไป คอลัมน์จะต้องถูกบรรจุใหม่หรือทิ้งไป ยิ่งไปกว่านั้น เนื่องจากการบีบอัดอนุภาคและความสม่ำเสมอในการบรรจุไม่เกี่ยวข้องกับคอลัมน์แบบโมโนลิธ คอลัมน์แบบโมโนลิธจึงมีความแข็งแรงทางกลมากกว่า หากคอลัมน์อนุภาคตกหล่น ตัวอย่างเช่น ความสมบูรณ์ของคอลัมน์อาจเสียหายได้ คอลัมน์แบบโมโนลิธจึงมีความเสถียรทางกายภาพมากกว่าคอลัมน์อนุภาค
การพัฒนาเทคโนโลยี
รากฐานของโครมาโทกราฟีของเหลวย้อนกลับไปกว่าศตวรรษที่แล้วในปี 1900 เมื่อมิคาอิล ทสเวต นักพฤกษศาสตร์ชาวรัสเซีย เริ่มทำการทดลองกับ รงควัตถุพืชในคลอโรฟิลล์ [ 5 ] เขาตั้งข้อสังเกตว่า เมื่อใช้ตัวทำละลาย จะปรากฏแถบที่แตกต่างกันซึ่งเคลื่อนที่ด้วยอัตราที่แตกต่างกันไปตามเฟสคงที่ จากการสังเกตใหม่นี้ เขาจึงบัญญัติศัพท์คำว่า "โครมาโทกราฟี" ขึ้นมา การบรรยายครั้งแรกของเขาเกี่ยวกับเรื่องนี้เกิดขึ้นในปี 1903 แต่ผลงานที่สำคัญที่สุดของเขาเกิดขึ้นสามปีต่อมาในปี 1906 เมื่อบทความเรื่อง " การวิเคราะห์ การดูดซับและวิธีการโครมาโทกราฟี การประยุกต์ใช้ในเคมีของคลอโรฟิลล์" ได้รับการตีพิมพ์ การแข่งขันกับเพื่อนร่วมงานที่ประณามงานของเขาอย่างเปิดเผยและเสียงดัง ทำให้การวิเคราะห์โครมาโทกราฟีถูกระงับไปเกือบ 25 ปี ความน่าขันอย่างยิ่งของเรื่องนี้ก็คือ นักศึกษาของคู่แข่งของเขานั่นเองที่ต่อมาได้นำเอาโครมาโทกราฟีมาใช้ในการทำงานกับแคโรทีน
วิธี การโครมาโทกราฟีแบบเฟสปกติ (Normal Phase Chromatography: LC) นั้นแทบไม่เปลี่ยนแปลงเลยตั้งแต่สมัยของทสเว็ตต์จนถึงทศวรรษ 1940 โดยใช้วิธีปล่อยตัวทำละลาย ด้วย แรง โน้มถ่วง ผ่านหลอดแก้วขนาดเล็กที่บรรจุด้วยเม็ดสารดูดซับแบบเพลลิคูลาร์อย่างไรก็ตาม ในทศวรรษ 1940 นั้นเอง ได้เกิดการปฏิวัติครั้งใหญ่ในโครมาโทกราฟีแบบแก๊ส (GC) แม้ว่า GC จะเป็นเทคนิคที่ยอดเยี่ยมสำหรับการวิเคราะห์ สารประกอบอนินทรีย์ แต่โมเลกุล อินทรีย์น้อยกว่า 20% เท่านั้นที่สามารถแยกได้ด้วยเทคนิคนี้ริชาร์ด ซิงจ์ ผู้ซึ่งได้รับ รางวัลโนเบล สาขาเคมี ในปี 1952 จากผลงานด้านโครมาโทกราฟีแบบแบ่งส่วน (Partition Chromatography: PARTITION) ได้นำความรู้ทางทฤษฎีที่ได้จากงานของเขาใน GC มาประยุกต์ใช้กับ LC จากการปฏิวัติครั้งนี้ ในทศวรรษ 1950 ยังได้เห็นการเกิดขึ้นของโครมาโทกราฟีแบบกระดาษ โครมาโทกราฟีแบบแบ่งส่วนเฟสผกผัน (Reversed-Phase Partition Chromatography: RPC) และโครมาโทกราฟีแบบปฏิสัมพันธ์ไฮโดรโฟบิก (Hydrophobic Interaction Chromatography: HIC) เจลชนิดแรกที่ใช้ใน LC ถูกสร้างขึ้นโดยใช้เดกซ์แทรนแบบเชื่อมโยง ( Sephadex ) โดยมีจุดประสงค์เพื่อทำให้คำทำนายของ Synge ที่ว่าเฟสคงที่แบบชิ้นเดียวที่มีเอกลักษณ์เฉพาะตัวสามารถให้โซลูชันโครมาโทกราฟีที่เหมาะสมที่สุดนั้นเป็นจริง
ในทศวรรษ 1960 มีการสร้างเจลโพ ลีอะคริลาไมด์และอะกาโรสขึ้นมาเพื่อพยายามสร้างเฟสคงที่แบบชิ้นเดียว แต่ความบริสุทธิ์และความเสถียรของส่วนประกอบที่มีอยู่ไม่เอื้อต่อการนำไปใช้ใน HPLC ในทศวรรษนี้เอง มีการคิดค้นโครมาโทกราฟีแบบอาศัยแรงดึงดูด (affinity chromatography) มีการใช้เครื่องตรวจจับรังสีอัลตราไวโอเลต ( UV ) ร่วมกับ LC เป็นครั้งแรก และที่สำคัญที่สุดคือ HPLC สมัยใหม่ได้ถือกำเนิดขึ้นCsaba Horvathเป็นผู้นำในการพัฒนา HPLC สมัยใหม่โดยการประกอบอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการเข้าด้วยกันให้เหมาะสมกับวัตถุประสงค์ของเขา ในปี 1968 บริษัท Picker Nuclear Company ได้วางจำหน่าย HPLC เครื่องแรกในเชิงพาณิชย์ในชื่อ “เครื่องวิเคราะห์กรดนิวคลีอิก” ในปีต่อมา มีการจัดประชุมสัมมนาวิชาการนานาชาติครั้งแรกเกี่ยวกับ HPLC และ Kirkland จากDuPontสามารถสร้างอนุภาคเพลลิคูลาร์ที่มีรูพรุนควบคุมได้เป็นครั้งแรก
ในช่วงทศวรรษ 1970 และ 1980 ความสนใจในสื่อการแยกที่มีปริมาตรช่องว่างระหว่างอนุภาคลดลงได้กลับมาอีกครั้ง โครมาโทกราฟี แบบเพอร์ฟิวชั่นแสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่าสื่อโครมาโทกราฟีสามารถรองรับอัตราการไหลสูงได้โดยไม่ลดความละเอียด[ 6 ]โมโนลิธจัดอยู่ในกลุ่มสื่อประเภทใหม่นี้ได้อย่างเหมาะสม เนื่องจากไม่มีปริมาตรช่องว่างและสามารถทนต่ออัตราการไหลได้ถึง 9 มล./นาทีโมโนลิธพอลิเมอร์ที่มีอยู่ในปัจจุบันได้รับการพัฒนาขึ้นโดยอิสระจากห้องปฏิบัติการ 3 แห่งที่แตกต่างกันในช่วงปลายทศวรรษ 1980 นำโดย Hjerten, Svec และ Tennikova ในขณะเดียวกัน การแยกสารชีวภาพก็มีความสำคัญมากขึ้นเรื่อยๆ และเทคโนโลยีโมโนลิธก็พิสูจน์แล้วว่ามีประโยชน์ในการแยกสารทางเทคโนโลยีชีวภาพ
แม้ว่าในช่วงทศวรรษ 1980 อุตสาหกรรมจะมุ่งเน้นไปที่เทคโนโลยีชีวภาพ แต่ในช่วงทศวรรษ 1990 ความสนใจได้เปลี่ยนไปสู่ด้านวิศวกรรมกระบวนการในขณะที่นักโครมาโทกราฟีทั่วไปใช้คอลัมน์อนุภาคขนาด 3 ไมโครเมตรคอลัมน์ขนาดเล็กกว่า 2 ไมโครเมตรยังอยู่ในขั้นตอนการวิจัย อนุภาคที่เล็กกว่าหมายถึงความละเอียดที่ดีกว่าและเวลาในการทำงานที่สั้นลง นอกจากนี้ยังมีการเพิ่มขึ้นของแรงดันย้อนกลับที่เกี่ยวข้องด้วย เพื่อให้ทนต่อแรงดันดังกล่าว จึงเกิดสาขาใหม่ของโครมาโทกราฟีขึ้นมา นั่นคือ UHPLC หรือ UPLC - โครมาโทกราฟีของเหลวแรงดันสูงพิเศษ เครื่องมือใหม่เหล่านี้สามารถทนต่อแรงดันได้สูงถึง15,000 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว (1,000 บาร์)ซึ่งแตกต่างจากเครื่องจักรทั่วไปที่สามารถรับแรงดันได้สูงสุดเพียง5,000 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว (340 บาร์) UPLC เป็นทางเลือกในการแก้ปัญหาเดียวกันกับที่คอลัมน์แบบโมโนลิธิกแก้ไขได้ เช่นเดียวกับ UPLC โครมาโทกราฟีแบบโมโนลิธิกสามารถช่วยเพิ่มผลกำไรโดยการเพิ่มปริมาณตัวอย่างที่ประมวลผลได้ แต่ไม่จำเป็นต้องลงทุนในอุปกรณ์ใหม่
ในปี 1996 โนบุโอะ ทานากะที่สถาบันเทคโนโลยีเกียวโตได้เตรียมโมโนลิธซิลิกาโดยใช้การสังเคราะห์สารแขวนลอยคอลลอยด์ (หรือที่เรียกว่า “ โซล-เจล ”) ซึ่งพัฒนาโดยเพื่อนร่วมงานกระบวนการนี้แตกต่างจากที่ใช้ในโมโนลิธพอลิเมอร์ โมโนลิธพอลิเมอร์นั้นถูกสร้างขึ้นในแหล่งกำเนิด โดยใช้ส่วนผสมของโมโนเมอร์และสารก่อรูพรุนภายในท่อคอลัมน์ ในทางกลับกัน โมโนลิธซิลิกาถูกสร้างขึ้นในแม่พิมพ์ เกิดการหดตัวอย่างมาก แล้วจึงหุ้มด้วยท่อหดตัวพอลิเมอร์ เช่นPEEK (โพลีอีเทอร์อีเทอร์คีโตน) เพื่อลดผลกระทบจากผนัง วิธีนี้จำกัดขนาดของคอลัมน์ที่สามารถผลิตได้ให้มีความยาวน้อยกว่า 15 เซนติเมตร และถึงแม้ว่า จะสามารถผลิต เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน มาตรฐานสำหรับการวิเคราะห์ ได้ง่าย แต่ปัจจุบันมีแนวโน้มในการพัฒนา โมโน ลิธ ซิลิกาขนาด นาโนสเกลและขนาดเตรียมการ
วงจรชีวิตของเทคโนโลยี
โมโนลิธซิลิกาเพิ่งมีวางจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ตั้งแต่ปี 2001 เมื่อMerckเริ่มโครงการ Chromolith [ 7 ]เทคโนโลยี Chromolith ได้รับการอนุญาตจากกลุ่มของ Soga และ Nakanishi ที่มหาวิทยาลัยเกียวโต ผลิตภัณฑ์ใหม่นี้ได้รับรางวัล PittCon Editors' Gold Award สำหรับผลิตภัณฑ์ใหม่ยอดเยี่ยม รวมถึงรางวัล R&D 100 Awardทั้งสองรางวัลในปี 2001
คอลัมน์โมโนลิธแต่ละคอลัมน์มีวงจรชีวิตที่โดยทั่วไปแล้วยาวนานกว่าคอลัมน์แบบอนุภาค เมื่อเลือกซัพพลายเออร์คอลัมน์ HPLC อายุการใช้งานของคอลัมน์มีความสำคัญรองลงมาจากความสามารถในการทำซ้ำระหว่างคอลัมน์ต่อคอลัมน์สำหรับผู้ซื้อ ตัวอย่างเช่น คอลัมน์โครโมลิธแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการทำซ้ำของการฉีดตัวอย่าง 3,300 ครั้งและปริมาตรคอลัมน์ของเฟสเคลื่อนที่ 50,000 ครั้ง สิ่งสำคัญอีกประการหนึ่งสำหรับวงจรชีวิตของโมโนลิธคือความแข็งแรงเชิงกลที่เพิ่มขึ้น โมโนลิธพอลิเมอร์สามารถทนต่อ ช่วง pHตั้งแต่ 1 ถึง 14 สามารถทนต่ออุณหภูมิสูง และไม่จำเป็นต้องจัดการอย่างระมัดระวัง “โมโนลิธยังอยู่ในช่วงวัยรุ่น” Frantisec Svec ผู้นำในด้านเฟสคงที่ใหม่สำหรับ LC กล่าว[ 8 ]
วิวัฒนาการของอุตสาหกรรม
โครมาโทกราฟีของเหลวอย่างที่เรารู้จักกันในปัจจุบันนั้นเริ่มต้นขึ้นในปี 1969 เมื่อมีการออกแบบและวางจำหน่าย HPLC สมัยใหม่เครื่องแรกในฐานะเครื่องวิเคราะห์กรดนิวคลีอิก[ 9 ] คอลัมน์ในช่วงทศวรรษ 1970 นั้นไม่น่าเชื่อถือ อัตราการไหลของปั๊มไม่สม่ำเสมอ และสารประกอบที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพจำนวนมากหลุดรอดจากการตรวจจับโดยเครื่องตรวจจับ UV และฟลูออเรสเซนซ์ การมุ่งเน้นไปที่วิธีการทำให้บริสุทธิ์ในช่วงทศวรรษ 1970 ได้เปลี่ยนไปเป็นการวิเคราะห์ที่รวดเร็วยิ่งขึ้นในช่วงทศวรรษ 1980 เมื่อมีการบูรณาการการควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์เข้ากับอุปกรณ์ HPLC ระดับของคอมพิวเตอร์ที่สูงขึ้นนำไปสู่การเน้นย้ำถึงอุปกรณ์อัตโนมัติที่แม่นยำและรวดเร็วยิ่งขึ้นในช่วงทศวรรษ 1990 ซึ่งแตกต่างจากเทคโนโลยีหลายอย่างในช่วงทศวรรษ 1960 และ 1970 การเน้นย้ำในการปรับปรุงไม่ได้อยู่ที่ "ใหญ่ขึ้นและดีขึ้น" แต่เป็น "เล็กลงและดีขึ้น" ในขณะเดียวกันกับการปรับปรุงส่วนติดต่อผู้ใช้ของ HPLC ก็เป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งที่จะต้องสามารถแยกเปปไทด์หรือไบโอมาร์กเกอร์ หลายร้อยตัว จากตัวอย่างที่มีขนาดเล็กลงเรื่อยๆ
เครื่องมือวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการได้รับการยอมรับว่าเป็นอุตสาหกรรมที่แยกต่างหากและแตกต่างโดยNAICSและSICตั้งแต่ปี 1987 การแบ่งส่วนตลาดนี้ไม่เพียงแต่รวมถึงโครมาโทกราฟีก๊าซและของเหลวเท่านั้น แต่ยังรวมถึง เครื่องมือ สเปกโทรเมตรีมวลและสเปกโทรโฟโตเมตริกด้วย นับตั้งแต่ได้รับการยอมรับว่าเป็นตลาดที่แยกต่างหาก ยอดขายอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการวิเคราะห์เพิ่มขึ้นจากประมาณ 3.5 พันล้านดอลลาร์ในปี 1987 เป็นมากกว่า 26 พันล้านดอลลาร์ในปี 2004 [ 10 ]รายได้ในตลาดโครมาโทกราฟีของเหลวโลกโดยเฉพาะ คาดว่าจะเติบโตจาก 3.4 พันล้านดอลลาร์ในปี 2007 เป็น 4.7 พันล้านดอลลาร์ในปี 2013 โดยคาดว่าจะมีการลดลงเล็กน้อยในการใช้จ่ายในปี 2008 และ 2009 จากภาวะเศรษฐกิจตกต่ำทั่วโลกและการใช้จ่ายที่ลดลงหรือคงที่ อุตสาหกรรมยาเพียงอย่างเดียวคิดเป็น 35% ของเครื่องมือ HPLC ทั้งหมดที่ใช้งานอยู่[ 11 ]แหล่งที่มาหลักของการเติบโตใน LC มาจากบริษัทด้านชีววิทยาศาสตร์และเภสัชกรรม
การประยุกต์ใช้เทคโนโลยี
ในรูปแบบแรกเริ่ม การโครมาโทกราฟีของเหลวถูกใช้เพื่อแยกเม็ดสีคลอโรฟิลล์โดยนักพฤกษศาสตร์ชาวรัสเซีย หลายทศวรรษต่อมา นักเคมีคนอื่นๆ ได้นำวิธีการนี้ไปใช้ในการศึกษาแคโรทีน จากนั้นการโครมาโทกราฟีของเหลวก็ถูกนำมาใช้ในการแยกโมเลกุลขนาดเล็กและสารประกอบอินทรีย์ เช่นกรดอะมิโนและล่าสุดได้ถูกนำมาใช้ใน การวิจัย เปปไทด์และดีเอ็นเอคอลัมน์แบบโมโนลิธมีบทบาทสำคัญในการพัฒนาสาขาการวิจัยทางชีวโมเลกุล
ในงานแสดงสินค้าและงานประชุมนานาชาติเกี่ยวกับ HPLC ที่ผ่านมา ความสนใจในคอลัมน์โมโนลิธและการประยุกต์ใช้ในด้านชีวโมเลกุลเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง และความสัมพันธ์นี้ไม่ใช่เรื่องบังเอิญ โมโนลิธได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีศักยภาพสูงในสาขา "โอมิกส์" เช่นจีโนมิกส์โปรตีโอมิกส์ เม ตาโบโลมิกส์และเภสัชจีโนมิกส์เป็นต้น แนวทางการลดทอนเพื่อทำความเข้าใจเส้นทางเคมีของร่างกายและปฏิกิริยาต่อสิ่งกระตุ้นต่างๆ เช่น ยา เป็นสิ่งสำคัญสำหรับแนวทางการแพทย์ รูปแบบใหม่ เช่นการแพทย์เฉพาะบุคคล
เภสัชพันธุศาสตร์ศึกษาว่าการตอบสนองต่อผลิตภัณฑ์ยาแตกต่างกันอย่างไรในด้านประสิทธิภาพและความเป็นพิษโดยอาศัยความแปรผันในจีโนมของผู้ป่วย เป็นความสัมพันธ์ระหว่างการตอบสนองต่อยาและการแสดงออกของยีนในผู้ป่วยJeremy K. NicholsonจากImperial College , Londonใช้มุมมองหลังจีโนมิกส์เพื่อทำความเข้าใจปฏิกิริยาไม่พึงประสงค์จากยาและพื้นฐานโมเลกุลของโรคในมนุษย์[ 12 ]กลุ่มของเขาศึกษา โปรไฟล์การเผาผลาญ ของจุลินทรีย์ ในลำไส้ และสามารถเห็นความแตกต่างที่ชัดเจนในปฏิกิริยาต่อความเป็นพิษและการเผาผลาญของยา แม้กระทั่งในพื้นที่ทางภูมิศาสตร์ต่างๆ ของเชื้อชาติเดียวกัน โครมาโทกราฟีแบบโมโนลิธที่มีความสัมพันธ์ให้แนวทางอื่นในการวัดการตอบสนองต่อยา David Hage ที่มหาวิทยาลัยเนบราสกา–ลินคอล์นผูกลิแกนด์เข้ากับตัวรองรับแบบโมโนลิธและวัด ปรากฏการณ์ สมดุลของปฏิกิริยาการผูกระหว่างยาและโปรตีนในซีรั่ม[ 8 ]ปัจจุบันมีการใช้แนวทางแบบโมโนลิธที่มหาวิทยาลัยโบโลญญาประเทศอิตาลี เพื่อการคัดกรองยาที่อาจใช้รักษาโรค อัลไซเมอร์ด้วย ความเร็วสูง [ 6 ]ในปี 2546 Regnier และ Liu จากมหาวิทยาลัย Purdueได้อธิบายขั้นตอน LC แบบหลายมิติสำหรับการระบุโพลีมอร์ฟิซึมของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว ( SNPs) ในโปรตีน[ 13 ] SNPs คือการเปลี่ยนแปลงในรหัสพันธุกรรมที่บางครั้งอาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในโครงสร้างของโปรตีนเช่นเดียวกับกรณีของโรคโลหิตจางชนิดเคียว โมโนลิธมีประโยชน์อย่างยิ่งในการแยกสารประเภทนี้เนื่องจาก ความสามารถ ในการขนส่งมวล ที่เหนือกว่า แรงดันย้อนกลับต่ำควบคู่กับอัตราการไหลที่เร็วขึ้น และความง่ายในการปรับเปลี่ยนพื้นผิวรองรับ
เทคโนโลยีคอลัมน์โมโนลิธช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการแยกสารชีวภาพในระดับการผลิตด้วยเช่นกัน การแยกสารอย่างรวดเร็วและความสามารถในการแยกสารโมเลกุลขนาดใหญ่ด้วยโมโนลิธ ทำให้สามารถวิเคราะห์แบบเรียลไทม์ในถังหมักได้การหมักเป็นที่รู้จักกันดีในการใช้ทำเครื่องดื่มแอลกอฮอล์แต่ก็เป็นขั้นตอนสำคัญในการผลิตวัคซีนป้องกัน โรค พิษสุนัขบ้าและไวรัส อื่นๆ ด้วย การวิเคราะห์แบบเรียลไทม์ออนไลน์มีความสำคัญต่อการตรวจสอบสภาวะการผลิต และสามารถปรับเปลี่ยนได้หากจำเป็น Boehringer Ingelheim Austria ได้ตรวจสอบวิธีการด้วย cGMP (หลักปฏิบัติที่ดีในการผลิตเชิงพาณิชย์) สำหรับการผลิตพลาสมิด DNA เกรดเภสัชกรรม พวกเขาสามารถประมวลผลน้ำ หมัก 200 ลิตร บนโมโนลิธขนาด 800 มิลลิลิตร[ 6 ]ที่BIA Separationsเวลาในการประมวลผลไวรัสโมเสกมะเขือเทศลดลงอย่างมากจากห้าวันของการทำงานด้วยมืออย่างเข้มข้นตามมาตรฐาน เหลือเพียงสองชั่วโมงด้วยคอลัมน์โมโนลิธที่มีความบริสุทธิ์เทียบเท่าและการกู้คืนที่ดีกว่า[ 6 ]ไวรัสอื่นๆ ก็ได้รับการทำให้บริสุทธิ์บนโมโนลิธเช่นกัน
อีกหนึ่งด้านที่น่าสนใจของ HPLC คือด้านนิติวิทยาศาสตร์GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectroscopy) โดยทั่วไปถือเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการวิเคราะห์ทางนิติวิทยาศาสตร์ โดยใช้ร่วมกับฐานข้อมูลออนไลน์เพื่อการวิเคราะห์สารประกอบอย่างรวดเร็วในการทดสอบแอลกอฮอล์ในเลือดสาเหตุการตาย ยาเสพติด และการวิเคราะห์อาหาร โดยเฉพาะในกรณีการวางยาพิษ[ 13 ]การวิเคราะห์บูปรีนอร์ฟีนซึ่ง เป็นสารทดแทน เฮโรอีนแสดงให้เห็นถึงประโยชน์ที่เป็นไปได้ของ LC แบบหลายมิติในฐานะวิธีการตรวจจับระดับต่ำ วิธีการ HPLC สามารถวัดสารประกอบนี้ได้ที่ 40 ng / mLเมื่อเทียบกับ GC-MS ที่ 0.5 ng/mL แต่ LC-MS-MS สามารถตรวจจับบูปรีนอร์ฟีนได้ในระดับต่ำถึง 0.02 ng/mL ดังนั้นความไวของ LC แบบหลายมิติจึงมากกว่า HPLC แบบดั้งเดิมถึง 2000 เท่า
การประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรม
ตลาดโครมาโทกราฟีของเหลวมีความหลากหลายอย่างมาก มีบริษัทชั้นนำเพียงห้าถึงสิบแห่งเท่านั้นที่ครองตลาดอย่างต่อเนื่อง แต่เกือบครึ่งหนึ่งของตลาดประกอบไปด้วยบริษัทขนาดเล็กที่กระจัดกระจาย ส่วนนี้ของรายงานจะมุ่งเน้นไปที่บทบาทของบริษัทเพียงไม่กี่แห่งในการนำเทคโนโลยีคอลัมน์แบบโมโนลิธมาสู่ตลาดเชิงพาณิชย์
ในปี 1998 บริษัทสตาร์ทอัพด้านเทคโนโลยีชีวภาพBIA Separationsแห่งเมืองลูบลิยานาประเทศสโลวีเนียได้ถือกำเนิดขึ้น เทคโนโลยีนี้ได้รับการพัฒนาขึ้นครั้งแรกโดย Tatiana Tennikova และ Frantisek Svec ในระหว่างการทำงานร่วมกันระหว่างสถาบันของทั้งสอง บริษัท BIA Separations ได้ซื้อสิทธิบัตรสำหรับคอลัมน์เหล่านี้ และ Ales Podgornik กับ Milos Barut ได้พัฒนาคอลัมน์โมโนลิธเชิงพาณิชย์ตัวแรกในรูปแบบแผ่นดิสก์สั้นที่ห่อหุ้มด้วยตัวเรือนพลาสติก BIA Separations ได้จดทะเบียนเครื่องหมายการค้า CIM และได้เปิดตัวคอลัมน์โมโนลิธแบบรีเวิร์สเฟส นอร์มัลเฟส ไอออนเอ็กซ์เชนจ์ และแอฟฟินิตี้โพลีเมอร์ครบวงจร ต่อมา Ales Podgornik และ Janez Jancar ได้พัฒนาคอลัมน์โมโนลิธแบบท่อขนาดใหญ่สำหรับใช้ในอุตสาหกรรม คอลัมน์ที่ใหญ่ที่สุดที่มีจำหน่ายในปัจจุบันมีขนาด 8 ลิตร ในเดือนพฤษภาคม 2008 บริษัท Agilent Technologies ซึ่งเป็นผู้ผลิตเครื่องมือ LC ชั้นนำ ได้ตกลงที่จะทำการตลาดคอลัมน์วิเคราะห์ของ BIA Separations ที่ใช้เทคโนโลยีโมโนลิธ Agilent ได้นำคอลัมน์ที่มี เฟส แลกเปลี่ยนไอออน แบบแรงและแบบอ่อน รวมถึงโปรตีนเอ ออกสู่ตลาดในเดือนกันยายน 2551 โดยเปิดตัวผลิตภัณฑ์ใหม่ในชื่อ Bio-Monolith ในงานประชุม BioProcess International
แม้ว่า BIA Separations จะเป็นบริษัทแรกที่ทำการตลาดโมโนลิธโพลีเมอร์ในเชิงพาณิชย์ แต่ Merck KGaA เป็นบริษัทแรกที่ทำการตลาดโมโนลิธซิลิกา ในปี 1996 Tanaka และเพื่อนร่วมงานที่สถาบันเทคโนโลยีเกียวโตได้ตีพิมพ์ผลงานมากมายเกี่ยวกับเทคโนโลยีโมโนลิธซิลิกา ต่อมา Merck ได้รับใบอนุญาตจากสถาบันเทคโนโลยีเกียวโตให้พัฒนาและผลิตโมโนลิธซิลิกา หลังจากนั้นไม่นาน ในปี 2001 Merck ได้เปิดตัวคอลัมน์ HPLC แบบโมโนลิธ Chromolith ในงานแสดงสินค้าเครื่องมือวิเคราะห์ PittCon ในตอนแรก Karin Cabrera นักวิทยาศาสตร์อาวุโสของ Merck กล่าวว่า อัตราการไหลสูงเป็นจุดขายของคอลัมน์ Chromolith อย่างไรก็ตาม จากผลตอบรับของลูกค้า Merck ได้เรียนรู้ในไม่ช้าว่าคอลัมน์เหล่านี้มีความเสถียรและมีอายุการใช้งานยาวนานกว่าคอลัมน์ที่บรรจุอนุภาค[ 8 ]คอลัมน์เหล่านี้ได้รับรางวัลผลิตภัณฑ์ใหม่มากมาย ความยากลำบากในการผลิตแท่งซิลิกาและ การคุ้มครอง สิทธิบัตร ที่เข้มงวด ได้ขัดขวางความพยายามของบริษัทอื่นๆ ในการพัฒนาผลิตภัณฑ์ที่คล้ายคลึงกัน มีข้อสังเกตว่ามีสิทธิบัตรเกี่ยวกับการห่อหุ้มแท่งซิลิกามากกว่าสิทธิบัตรเกี่ยวกับการผลิตซิลิกาเองเสียอีก
ในอดีต Merck เป็นที่รู้จักในด้านผลิตภัณฑ์เคมีคุณภาพสูง และในด้านโครมาโทกราฟีของเหลว (LC) ก็เป็นที่รู้จักในด้านความบริสุทธิ์และความน่าเชื่อถือของซิลิกาอนุภาค แต่ Merck ไม่ได้เป็นที่รู้จักในด้านคอลัมน์ LC ห้าปีหลังจากเปิดตัวผลิตภัณฑ์ Chromolith Merck ได้ตัดสินใจทางการตลาดเชิงกลยุทธ์อย่างมาก โดยการให้สิทธิ์ใช้งานเทคโนโลยีทั่วโลกแก่บริษัทขนาดเล็ก (ยอดขายต่ำกว่า 100 ล้านดอลลาร์สหรัฐ) ที่มีนวัตกรรมและเป็นที่รู้จักในด้านเทคโนโลยีคอลัมน์ที่ล้ำสมัย นั่นคือ Phenomenex นี่เป็นการเคลื่อนไหวเชิงกลยุทธ์ที่ยอดเยี่ยมด้วยเหตุผลสองประการ ดังที่กล่าวมาแล้วข้างต้น Merck ไม่ได้เป็นที่รู้จักในด้านการผลิตคอลัมน์ นอกจากนี้ การมีผู้ผลิตซิลิกาโมโนลิธมากกว่าหนึ่งรายจะช่วยให้สามารถตรวจสอบความถูกต้องของเทคโนโลยีได้ดียิ่งขึ้น หลังจากได้รับสิทธิ์ใช้งานเทคโนโลยีจาก Merck แล้ว Phenomenex ได้เปิดตัวผลิตภัณฑ์ Onyx ในเดือนมกราคม 2548
อีกด้านหนึ่งของเทคโนโลยีโมโนลิธคือเทคโนโลยีพอลิเมอร์ ซึ่งแตกต่างจากคอลัมน์ซิลิกาอนินทรีย์ โมโนลิธพอลิเมอร์ทำจากฐานพอลิเมอร์อินทรีย์บริษัท Dionexซึ่งเป็นที่รู้จักกันดีในด้านความสามารถด้านไอออนโครมาโทกราฟี ได้เป็นผู้นำในด้านนี้มาโดยตลอด ในช่วงทศวรรษ 1990 Dionex ได้รับใบอนุญาตสำหรับเทคโนโลยีโมโนลิธพอลิเมอร์ที่พัฒนาโดย Frantisec Svec นักวิจัยชั้นนำด้านโมโนลิธโครมาโทกราฟี ขณะที่เขาอยู่ที่มหาวิทยาลัยคอร์เนลล์ในปี 2000 พวกเขาได้เข้าซื้อกิจการ LC Packings ซึ่งมีความเชี่ยวชาญด้านวัสดุบรรจุคอลัมน์ LC LC Packings/Dionex ได้เปิดตัวคอลัมน์แคปิลลารีโมโนลิธตัวแรกที่งานประชุม Montreux LC-MS ก่อนหน้านั้นในปีเดียวกัน บริษัท Isco ได้เปิดตัวคอลัมน์โมโนลิธโพลีสไตรีนไดไวนิลเบนซีน (PS-DVB) ภายใต้แบรนด์ SWIFT ในเดือนมกราคม 2005 Dionex ได้รับสิทธิ์ในผลิตภัณฑ์สื่อ SWIFT ทรัพย์สินทางปัญญา เทคโนโลยี และสินทรัพย์ที่เกี่ยวข้องจาก Teledyne Isco แม้ว่าความเชี่ยวชาญหลักของ Dionex จะอยู่ที่ด้านไอออนโครมาโทกราฟีมาโดยตลอด แต่ด้วยการเข้าซื้อกิจการเชิงกลยุทธ์และการถ่ายทอดเทคโนโลยี บริษัทจึงได้สร้างชื่อเสียงอย่างรวดเร็วในฐานะผู้ผลิตโมโนลิธโพลีเมอร์รายใหญ่
ผลกระทบทางเศรษฐกิจ
แม้ว่าความก้าวหน้ามากมายของ HPLC และโมโนลิธจะเห็นได้ชัดเจนในแวดวงอุตสาหกรรมการวิเคราะห์และเภสัชกรรม แต่ก็ไม่น่าเป็นไปได้ที่คนทั่วไปจะรับรู้ถึงการพัฒนาเหล่านี้ ปัจจุบัน ผู้บริโภคอาจเห็นการพัฒนาเทคโนโลยีในอุตสาหกรรมวิทยาศาสตร์การวิเคราะห์ในรูปแบบของ ผลิตภัณฑ์ ยา ที่มีให้เลือกหลากหลายมากขึ้น มีความบริสุทธิ์สูงขึ้น การทดสอบทางนิติวิทยาศาสตร์ขั้นสูงในคดีอาญาการตรวจสอบสิ่งแวดล้อม ที่ดีขึ้น และผลการตรวจทางการแพทย์ ที่รวดเร็วขึ้น ในอนาคต อาจเป็นเช่นนี้ไม่เสมอไป เนื่องจากยาจะถูกปรับให้เหมาะสมกับแต่ละบุคคลมากขึ้นเรื่อยๆ ความตระหนักของผู้บริโภคว่ามีสิ่งใดที่ช่วยปรับปรุงคุณภาพการดูแลรักษาของพวกเขาจึงมีแนวโน้มมากขึ้น อย่างไรก็ตาม ความคิดที่ว่าโมโนลิธหรือ HPLC เข้ามาเกี่ยวข้องนั้น ไม่น่าจะเป็นเรื่องที่ประชาชนทั่วไปให้ความสนใจ
ปัจจัยหลักสองประการที่ขับเคลื่อนการเปลี่ยนแปลงทางเทคโนโลยีในอุตสาหกรรมนี้คือ ต้นทุน แม้ว่า LC จะถูกนำไปใช้ในหลายสาขาการวิเคราะห์ รวมถึงอุตสาหกรรมอาหารและเครื่องดื่ม ห้องปฏิบัติการนิติวิทยาศาสตร์ และสถานทดสอบทางคลินิก แต่แรงผลักดันที่สำคัญที่สุดในการพัฒนาเทคโนโลยีมาจากฝ่ายวิจัยและพัฒนา และฝ่ายผลิตของอุตสาหกรรมยา โดยสาขาที่เทคโนโลยีคอลัมน์โมโนลิธิกที่มีประสิทธิภาพสูงน่าจะมีผลกระทบทางเศรษฐกิจมากที่สุดคือ ฝ่ายวิจัยและพัฒนา และฝ่ายแปรรูปขั้นปลายน้ำ
จาก สาขา การวิจัยและพัฒนาความต้องการการแยกสารที่มีความละเอียดสูงขึ้นและรวดเร็วขึ้นจากตัวอย่างปริมาณน้อยลงก็เกิดขึ้น ขั้นตอนการพัฒนายาเพียงขั้นตอนเดียวที่อยู่ภายใต้การควบคุมโดยตรงของบริษัทยาคือขั้นตอนการวิจัยและพัฒนา เป้าหมายของ งาน วิเคราะห์คือการได้รับข้อมูลให้ได้มากที่สุดจากตัวอย่าง ในขั้นตอนนี้ การวิเคราะห์ตัวอย่างปริมาณน้อยและมีประสิทธิภาพสูงมีความสำคัญอย่างยิ่ง บริษัทยาต่างมองหาเครื่องมือที่จะช่วยให้พวกเขาสามารถวัดและทำนายประสิทธิภาพของยาที่กำลังพัฒนาได้ดีขึ้น ในเวลาที่สั้นลง และด้วยการทดลองทางคลินิกที่มีต้นทุนต่ำกว่า[ 12 ]ด้วยเหตุนี้ การแยกสารระดับนาโน อุปกรณ์ HPLC อัตโนมัติสูง และโครมาโทกราฟีแบบหลายมิติ จึงกลายเป็นสิ่งที่มีอิทธิพล
วิธีการที่นิยมใช้เพื่อเพิ่มความไวของวิธีการวิเคราะห์คือ โครมาโทกราฟีแบบหลายมิติ วิธีนี้ใช้เทคนิคการวิเคราะห์อื่นๆ ร่วมกับโครมาโทกราฟีของเหลว ตัวอย่างเช่นแมสสเปกโทรเมตรี (MS) ได้รับความนิยมอย่างมากในฐานะเทคนิคการวิเคราะห์แบบออนไลน์หลังจาก HPLC อย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดของ MS คือ เช่นเดียวกับนิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์ สเปกโทรสโก ปี (NMR) หรือ เทคนิค การแตกตัวเป็นไอออนด้วยไฟฟ้าสถิต (ESI) สามารถทำได้เฉพาะเมื่อใช้ปริมาณตัวถูกละลายและตัวทำละลายในปริมาณน้อยมากเท่านั้น LC-MS ใช้กับเทคนิคระดับนาโนหรือระดับแคปิลลารี แต่ไม่สามารถใช้ในระดับการเตรียมสารได้ กลยุทธ์อีกอย่างหนึ่งในการเพิ่มความเลือกสรรในโครมาโทกราฟีแบบหลายมิติคือการใช้คอลัมน์สองคอลัมน์ที่มีความเลือกสรรต่างกันในแนวตั้งฉากกัน เช่น การเชื่อมต่อคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนกับคอลัมน์ C18 ที่ปิดปลาย ในปี 2550 Karger รายงานว่า ด้วยวิธีการโครมาโทกราฟีแบบหลายมิติและเทคนิคอื่นๆ โดยเริ่มต้นจากเซลล์เพียงประมาณ 12,000 เซลล์ที่มีโปรตีน 1-4 ไมโครกรัม เขาสามารถระบุโปรตีนที่ไม่ซ้ำกันได้ 1,867 ชนิด จากจำนวนนั้น Karger สามารถแยกโปรตีนได้ 4 ชนิดที่อาจเป็นตัวบ่งชี้มะเร็งปากมดลูกที่น่าสนใจ[ 12 ]ปัจจุบัน นักโครมาโทกราฟีของเหลวที่ใช้ LC แบบหลายมิติสามารถแยกสารประกอบได้ในระดับเฟมโตโมล (10 −15โมล) และอัตโตโมล (10 −18โมล)
หลังจากที่ยาได้รับการอนุมัติจากสำนักงานคณะกรรมการอาหารและยาแห่งสหรัฐอเมริกา (FDA) แล้ว บริษัทเภสัชกรรมจะให้ความสำคัญกับการนำผลิตภัณฑ์ออกสู่ตลาด ซึ่งนี่คือจุดที่โครมาโทกราฟีระดับการเตรียมหรือระดับกระบวนการเข้ามามีบทบาท ในทางตรงกันข้ามกับการวิเคราะห์เชิงวิเคราะห์ โครมาโทกราฟีระดับการเตรียมจะเน้นที่การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของสารประกอบ มีความสมดุลระหว่างระดับความบริสุทธิ์ของสารประกอบและปริมาณเวลาที่ต้องใช้เพื่อให้ได้ความบริสุทธิ์นั้น น่าเสียดายที่วิธีการแก้ปัญหาในระดับการเตรียมหรือระดับกระบวนการที่บริษัทเภสัชกรรมใช้หลายวิธีเป็นกรรมสิทธิ์ เนื่องจากความยากลำบากในการจดสิทธิบัตรกระบวนการ ดังนั้นจึงมีเอกสารทางวิชาการไม่มากนัก อย่างไรก็ตาม ความพยายามบางอย่างในการแก้ไขปัญหาของโครมาโทกราฟีระดับการเตรียม ได้แก่ โมโนลิธและ เตียง เคลื่อนที่จำลอง
การเปรียบเทียบการ จับโปรตีน อิมมูโนโกลบูลินบนคอลัมน์แบบดั้งเดิมและคอลัมน์แบบโมโนลิธิกให้ผลลัพธ์ที่น่าสนใจทางเศรษฐกิจ[ 3 ]หากเวลาในการประมวลผลเท่ากัน ปริมาตรของIgGซึ่งเป็นแอนติบอดีจะอยู่ที่ 3,120 ลิตรสำหรับคอลัมน์แบบดั้งเดิม เทียบกับ 5,538 ลิตรสำหรับคอลัมน์แบบโมโนลิธิก ซึ่งแสดงถึงประสิทธิภาพปริมาตรของกระบวนการที่เพิ่มขึ้น 78% ในขณะเดียวกันปริมาณของเสียจากตัวกลางที่เกิดขึ้นมีเพียงหนึ่งในสิบเท่านั้น คอลัมน์แบบโมโนลิธิกไม่เพียงแต่มีความรอบคอบทางเศรษฐกิจมากกว่าเมื่อพิจารณาถึงมูลค่าของเวลาในการประมวลผลผลิตภัณฑ์ แต่ในขณะเดียวกันก็ใช้ตัวกลางน้อยลง ซึ่งแสดงถึงการลดต้นทุนผันแปรอย่างมีนัยสำคัญ
ลิงก์ภายนอก
- “ ประวัติของ HPLC” https://web.archive.org/web/20100410045845/http://kerouac.pharm.uky.edu/