การตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์นำไปสู่ความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับพันธะเคมีและปฏิสัมพันธ์ที่ไม่ใช่โคเวเลนต์การศึกษาเบื้องต้นเผยให้เห็นรัศมีทั่วไปของอะตอม และยืนยันแบบจำลองทางทฤษฎีของพันธะเคมีหลายแบบ เช่น พันธะเตตระเฮดรัลของคาร์บอนในโครงสร้างเพชร^{[ 30 ]}พันธะออกตาเฮดรัลของโลหะที่พบในแอมโมเนียมเฮกซาคลอโรแพลทิเนต (IV) ^{[ 48 ]}และเรโซแนนซ์ที่พบในกลุ่มคาร์บอเนตแบบระนาบ^{[ 33 ]}และในโมเลกุลอะโรมาติก^{[ 49 ]} โครงสร้างของ เฮกซาเมทิลเบนซีนในปี 1928 ของKathleen Lonsdale ^{[ 50 ]}ได้สร้างสมมาตรหกเหลี่ยมของเบนซีนและแสดงให้เห็นความแตกต่างที่ชัดเจนในความยาวพันธะระหว่างพันธะ C–C แบบอะลิฟาติกและพันธะ C–C แบบอะโรมาติก การค้นพบนี้ทำให้เกิดแนวคิดเรื่องเรโซแนนซ์ระหว่างพันธะเคมี ซึ่งมีผลกระทบอย่างมากต่อการพัฒนาเคมี^{[ 51 ]}ข้อสรุปของเธอได้รับการคาดการณ์ไว้ล่วงหน้าโดยWilliam Henry Braggซึ่งตีพิมพ์แบบจำลองของแนฟทาลีนและแอนทราซีนในปี พ.ศ. 2464 โดยอิงจากโมเลกุลอื่น ซึ่งเป็นรูปแบบแรกเริ่มของการแทนที่โมเลกุล^{[ 49 ] [ 52 ]}

โครงสร้างแรกของสารประกอบอินทรีย์เฮกซาเมทิลีนเตตรามีนได้รับการแก้ไขในปี พ.ศ. 2466 ^{[ 53 ]} ตามมาอย่างรวดเร็วด้วยการศึกษา กรดไขมันสายยาวต่างๆซึ่งเป็นส่วนประกอบสำคัญของเยื่อชีวภาพ^{[ 54 ] [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] [ 60 ] [ 61 ] [ 62 ] ในช่วงทศวรรษ พ.ศ. 2473}โครงสร้างของโมเลกุลขนาดใหญ่ที่มีความซับซ้อนแบบสองมิติเริ่มได้รับการแก้ไข ความก้าวหน้าที่สำคัญคือโครงสร้างของฟทาโลไซยานีน^{[ 63 ]ซึ่ง}เป็นโมเลกุลระนาบขนาดใหญ่ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับโมเลกุลพอร์ไฟริน ที่สำคัญใน ^ทางชีววิทยา เช่นฮีมคอร์รินและคลอโรฟิลล์

ในช่วงทศวรรษ 1920 วิคเตอร์ มอริตซ์ โกลด์ชมิดท์และต่อมาไลนัส พอลลิงได้พัฒนากฎเกณฑ์สำหรับการกำจัดโครงสร้างที่ไม่น่าจะเป็นไปได้ทางเคมี และสำหรับการกำหนดขนาดสัมพัทธ์ของอะตอม กฎเกณฑ์เหล่านี้ได้นำไปสู่โครงสร้างของบรูไคต์ (1928) และความเข้าใจเกี่ยวกับความเสถียรสัมพัทธ์ ของ ไทเทเนียมไดออกไซด์ในรูปรูไทล์บรูไคต์และอนาเทส

ระยะห่างระหว่างอะตอมที่เชื่อมต่อกันสองอะตอมเป็นการวัดที่ไวต่อความแข็งแรงของพันธะและลำดับของพันธะดังนั้น การศึกษาผลึกศาสตร์ด้วยรังสีเอกซ์จึงนำไปสู่การค้นพบพันธะประเภทแปลกใหม่ยิ่งขึ้นในเคมีอนินทรีย์เช่น พันธะคู่โลหะ-โลหะ^{[ 64 ] [ 65 ] [ 66 ]}พันธะสี่เท่าโลหะ-โลหะ^{[ 67 ] [ 68 ] [ 69 ]}และพันธะสามศูนย์สองอิเล็กตรอน [ ^{70 ] ผลึก}ศาสตร์ด้วยรังสีเอกซ์ หรือที่จริงแล้วคือ การทดลอง การกระเจิงคอมป์ตัน แบบไม่ยืดหยุ่น ยังได้ให้หลักฐานเกี่ยวกับลักษณะกึ่งโควาเลนต์ของพันธะไฮโดรเจน อีกด้วย [ ^{71 ]}ในสาขาเคมีออร์กาโนเมทัลลิกโครงสร้างรังสีเอกซ์ของเฟอร์โรซีนได้เริ่มต้นการศึกษาทางวิทยาศาสตร์เกี่ยวกับ^{สารประกอบ}แซนด์วิช [ ^{72 ] [ 73 ]}ในขณะที่โครงสร้างของเกลือ Zeise กระตุ้นการวิจัยเกี่ยวกับ "พันธะย้อนกลับ" และสารประกอบ ^{เชิงซ้อน}โลหะ-ไพ^{[ 74 ] [ 75 ] [ 76 ] [ 77 ]}ในที่สุด ผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์ก็มีบทบาทสำคัญในการพัฒนาเคมีระดับเหนือโมเลกุลโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการชี้แจงโครงสร้างของคราวน์อีเทอร์และหลักการของเคมีโฮสต์-เกสต์

ระบบ อนินทรีย์และออร์กาโนเมทัลลิกที่ซับซ้อนจำนวนมากได้รับการวิเคราะห์โดยใช้วิธีการผลึกเดี่ยว เช่นฟูล เลอรี นเมทัลโลพอร์ไฟรินและสารประกอบที่ซับซ้อนอื่นๆ การเลี้ยวเบนของผลึกเดี่ยวยังถูกนำมาใช้ในอุตสาหกรรมยาด้วย ฐานข้อมูลโครงสร้างเคมบริดจ์มีโครงสร้างมากกว่า 1,000,000 โครงสร้าง ณ เดือนมิถุนายน 2019 โดยโครงสร้างส่วนใหญ่เหล่านี้ได้รับการกำหนดโดยการวิเคราะห์ผลึกด้วยรังสีเอกซ์^{[ 78 ]}

การประยุกต์ใช้ผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์กับแร่ธาตุวิทยาเริ่มต้นด้วยโครงสร้างของแร่การ์เนตซึ่งถูกกำหนดโดยเมนเซอร์ในปี 1924 การศึกษาผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์อย่างเป็นระบบของซิลิเกตได้ดำเนินการในช่วงทศวรรษที่ 1920 การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า เมื่อ อัตราส่วน Si / Oเปลี่ยนไป ผลึกซิลิเกตจะแสดงการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในการจัดเรียงอะตอม มาชาตช์กีได้ขยายความเข้าใจเหล่านี้ไปยังแร่ธาตุที่อะลูมิเนียมเข้ามาแทนที่ อะตอม ซิลิคอนของซิลิเกต การประยุกต์ใช้ผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์ครั้งแรกกับโลหะวิทยาก็เกิดขึ้นในช่วงกลางทศวรรษที่ 1920 เช่นกัน^{[ 80 ] [ 81 ] [ 82 ] [ 83 ] [ 84 ] [ 85 ]}ที่โดดเด่นที่สุดคือโครงสร้างของโลหะผสม Mg Sn ของไล นัส พอลลิง^{[ 86 ]}นำไปสู่ทฤษฎีของเขาเกี่ยวกับความเสถียรและโครงสร้างของผลึกไอออนิกเชิงซ้อน^{[ 87 ]}

เมื่อวันที่ 17 ตุลาคม พ.ศ. 2555 ยานสำรวจ Curiosityบนดาวอังคารที่ " Rocknest " ได้ทำการวิเคราะห์การเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ของดินบนดาวอังคารเป็นครั้งแรกผลลัพธ์จากเครื่องวิเคราะห์ CheMin ของยานสำรวจเผยให้เห็นการมีอยู่ของแร่ธาตุหลายชนิด รวมถึงเฟลด์สปาร์ ไพรอกซีน และโอลิวีนและชี้ให้เห็นว่าดินบนดาวอังคารในตัวอย่างนั้นคล้ายกับ " ดินบะซอลต์ ที่ผุพัง " ของภูเขาไฟฮาวาย^{[ 79 ]}

การศึกษาโครงสร้างผลึกด้วยรังสีเอกซ์ของโมเลกุลทางชีวภาพเริ่มต้นขึ้นด้วย ผลงานของ Dorothy Crowfoot Hodgkinผู้ซึ่งไขโครงสร้างของคอเลสเตอรอล (1937) เพนิซิลลิน (1946) และวิตามินบี (1956) ซึ่งทำให้เธอได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีในปี 1964 ในปี 1969 เธอประสบความสำเร็จในการไขโครงสร้างของอินซูลินซึ่งเธอทำงานมานานกว่าสามสิบปี^{[ 88 ]}

โครงสร้างผลึกของโปรตีน (ซึ่งมีรูปร่างไม่สม่ำเสมอและมีขนาดใหญ่กว่าคอเลสเตอรอลหลายร้อยเท่า) เริ่มได้รับการแก้ไขในช่วงปลายทศวรรษ 1950 โดยเริ่มจากโครงสร้างของ ไมโอโกลบินจาก วาฬสเปิร์มโดยเซอร์จอห์น โควดรีย์ เคนดรูว์ [ ^{89 ] ซึ่ง}ทำให้เขาได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมี ร่วม กับแม็กซ์ เพรุตซ์ในปี 1962 ^{[ 90 ]}นับตั้งแต่ความสำเร็จนั้น โครงสร้างผลึกเอ็กซ์เรย์ของโปรตีน กรดนิวคลีอิก และโมเลกุลทางชีวภาพอื่นๆ ได้รับการกำหนดแล้ว 190,000 โครงสร้าง^{[ 91 ]}วิธีการที่ใกล้เคียงที่สุดในแง่ของจำนวนโครงสร้างที่วิเคราะห์คือสเปกโทรสโกปีนิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์ (NMR)ซึ่งแก้ไขได้น้อยกว่าหนึ่งในสิบของจำนวนดังกล่าว^{[ 92 ]}ผลึกศาสตร์สามารถแก้ไขโครงสร้างของโมเลกุลขนาดใหญ่ได้ตามต้องการ ในขณะที่ NMR ในสถานะสารละลายถูกจำกัดไว้ที่โมเลกุลขนาดเล็ก (น้อยกว่า)70 kDa  ) การวิเคราะห์โครงสร้างผลึกด้วยรังสีเอกซ์ถูกนำมาใช้เป็นประจำเพื่อตรวจสอบว่ายาออกฤทธิ์กับโปรตีนเป้าหมายอย่างไร และการเปลี่ยนแปลงใดบ้างที่อาจช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพได้^{[ 93 ]}อย่างไรก็ตามโปรตีนเยื่อหุ้ม เซลล์ ยังคงเป็นเรื่องท้าทายในการตกผลึก เนื่องจากต้องใช้สารซักฟอกหรือสารทำให้เสียสภาพ อื่นๆ เพื่อละลายโปรตีนเหล่านั้นในสภาวะแยกเดี่ยว และสารซักฟอกดังกล่าวมักจะรบกวนการตกผลึก โปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์เป็นส่วนประกอบขนาดใหญ่ของจีโนมและรวมถึงโปรตีนที่มีความสำคัญทางสรีรวิทยาอย่างมากหลายชนิด เช่นช่องไอออนและตัวรับ [ ^{94 ] [ 95 ] การ}แช่แข็งด้วยฮีเลียมถูกนำมาใช้เพื่อลดความเสียหายจากรังสีในผลึกโปรตีน^{[ 96 ]}

โดยทั่วไปมักใช้กรณีจำกัดสองกรณีของการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ ได้แก่ "การตกผลึกโมเลกุลขนาดเล็ก" (ซึ่งรวมถึงของแข็งอนินทรีย์ต่อเนื่อง) และการตกผลึก "โมเลกุลขนาดใหญ่" การตกผลึกโมเลกุลขนาดเล็กมักเกี่ยวข้องกับผลึกที่มีอะตอมน้อยกว่า 100 อะตอมในหน่วยอสมมาตรโครงสร้างผลึกดังกล่าวโดยทั่วไปมีความละเอียดดีมากจนสามารถแยกแยะอะตอมได้เป็น "กลุ่ม" ของความหนาแน่นอิเล็กตรอนที่แยกจากกัน ในทางตรงกันข้าม การตกผลึกโมเลกุลขนาดใหญ่มักเกี่ยวข้องกับอะตอมหลายหมื่นอะตอมในเซลล์หน่วย โครงสร้างผลึกดังกล่าวโดยทั่วไปมีความละเอียดน้อยกว่า อะตอมและพันธะเคมีปรากฏเป็นท่อของความหนาแน่นอิเล็กตรอน แทนที่จะเป็นอะตอมที่แยกจากกัน โดยทั่วไป โมเลกุลขนาดเล็กก็ตกผลึกได้ง่ายกว่าโมเลกุลขนาดใหญ่ อย่างไรก็ตาม การตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ได้พิสูจน์แล้วว่าสามารถทำได้แม้กระทั่งกับไวรัสและโปรตีนที่มีอะตอมหลายแสนอะตอม ผ่านการสร้างภาพและเทคโนโลยีการตกผลึกที่ดีขึ้น^{[ 97 ]}

เทคนิคการวิเคราะห์ผลึกเดี่ยวด้วยรังสีเอกซ์มีขั้นตอนพื้นฐานสามขั้นตอน ขั้นตอนแรก—และมักจะเป็นขั้นตอนที่ยากที่สุด—คือการได้ผลึกที่เหมาะสมของวัสดุที่กำลังศึกษา ผลึกควรมีขนาดใหญ่พอสมควร (โดยทั่วไปใหญ่กว่า 0.1 มม. ในทุกมิติ) มีองค์ประกอบที่บริสุทธิ์และมีโครงสร้างที่สม่ำเสมอ โดยไม่มี ข้อบกพร่อง ภายในที่สำคัญเช่น รอยแตกหรือการเกิดแฝด^{[ 98 ]}

ในขั้นตอนที่สอง ผลึกจะถูกวางไว้ในลำแสงเอ็กซ์เรย์ที่มีความเข้มสูง ซึ่งโดยปกติจะเป็นความยาวคลื่นเดียว ( เอ็กซ์เรย์โมโนโครมาติก ) ทำให้เกิดรูปแบบการสะท้อนที่สม่ำเสมอ มุมและความเข้มของเอ็กซ์เรย์ที่เลี้ยวเบนจะถูกวัด โดยแต่ละสารประกอบจะมีรูปแบบการเลี้ยวเบนที่ไม่ซ้ำกัน^{[ 99 ]}เมื่อผลึกหมุนไปทีละน้อย การสะท้อนก่อนหน้าจะหายไปและการสะท้อนใหม่จะปรากฏขึ้น ความเข้มของทุกจุดจะถูกบันทึกไว้ในทุกทิศทางของผลึก อาจต้องรวบรวมชุดข้อมูลหลายชุด โดยแต่ละชุดจะครอบคลุมการหมุนของผลึกมากกว่าครึ่งรอบเล็กน้อย และโดยทั่วไปจะมีค่าการสะท้อนหลายหมื่นค่า^{[ 100 ]}

ในขั้นตอนที่สาม ข้อมูลเหล่านี้จะถูกรวมเข้าด้วยกันทางคอมพิวเตอร์พร้อมกับข้อมูลทางเคมีเสริมเพื่อสร้างและปรับปรุงแบบจำลองการจัดเรียงอะตอมภายในผลึก แบบจำลองการจัดเรียงอะตอมที่ปรับปรุงแล้วขั้นสุดท้าย—ซึ่งตอนนี้เรียกว่าโครงสร้างผลึก —มักจะถูกเก็บไว้ในฐานข้อมูลสาธารณะ^{[ 101 ]}

แม้ว่าผลึกศาสตร์จะสามารถใช้เพื่อระบุลักษณะความไม่เป็นระเบียบในผลึกที่ไม่บริสุทธิ์หรือไม่สม่ำเสมอได้ แต่โดยทั่วไปแล้วผลึกศาสตร์ต้องการผลึกบริสุทธิ์ที่มีความสม่ำเสมอสูงเพื่อแก้โครงสร้างของการจัดเรียงอะตอมที่ซับซ้อน ผลึกบริสุทธิ์ที่มีความสม่ำเสมอสามารถหาได้จากวัสดุธรรมชาติหรือวัสดุสังเคราะห์ เช่น ตัวอย่างโลหะ แร่ธาตุ หรือวัสดุขนาดใหญ่อื่นๆ ความสม่ำเสมอของผลึกดังกล่าวสามารถปรับปรุงได้ด้วยการอบผลึก โมเลกุลขนาดใหญ่ ^{[ 102 ] [ 103 ] [ 104 ]}และวิธีการอื่นๆ อย่างไรก็ตาม ในหลายกรณี การได้ผลึกที่มีคุณภาพสำหรับการเลี้ยวเบนถือเป็นอุปสรรคสำคัญในการแก้โครงสร้างที่มีความละเอียดระดับอะตอม^{[ 105 ]}

การศึกษาโครงสร้างผลึกของโมเลกุลขนาดเล็กและโมเลกุลขนาดใหญ่แตกต่างกันในขอบเขตของเทคนิคที่สามารถใช้ในการสร้างผลึกที่มีคุณภาพสำหรับการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ โมเลกุลขนาดเล็กโดยทั่วไปมีระดับความเป็นอิสระในการเปลี่ยนแปลงรูปร่างน้อย และสามารถตกผลึกได้ด้วยวิธีการที่หลากหลาย เช่น การตกตะกอนด้วยไอสารเคมีและการตกผลึกซ้ำในทางตรงกันข้าม โมเลกุลขนาดใหญ่โดยทั่วไปมีระดับความเป็นอิสระหลายระดับ และการตกผลึกของพวกมันจะต้องดำเนินการโดยรักษาสภาพโครงสร้างที่เสถียร ตัวอย่างเช่น โปรตีนและ โมเลกุล RNA ขนาดใหญ่ ไม่สามารถตกผลึกได้หากโครงสร้างระดับตติยภูมิของพวกมันคลี่ออกดังนั้น ขอบเขตของสภาวะการตกผลึกจึงจำกัดอยู่เฉพาะในสภาวะสารละลายที่โมเลกุลดังกล่าวคงสภาพพับอยู่

ผลึกโปรตีนมักจะเติบโตในสารละลาย วิธีที่พบได้บ่อยที่สุดคือการลดความสามารถในการละลายของโมเลกุลที่เป็นส่วนประกอบลงอย่างค่อยเป็นค่อยไป หากทำเร็วเกินไป โมเลกุลจะตกตะกอนออกจากสารละลาย กลายเป็นฝุ่นหรือเจลอสัณฐานที่ไร้ประโยชน์อยู่ที่ก้นภาชนะ การเติบโตของผลึกในสารละลายมีลักษณะเป็นสองขั้นตอน คือการเกิดนิวเคลียสของผลึกขนาดเล็ก (อาจมีเพียง 100 โมเลกุล) ตามด้วยการเติบโตของผลึกนั้น โดยในอุดมคติแล้วควรเป็นผลึกที่มีคุณภาพสำหรับการเลี้ยวเบน^{[ 106 ] [ 107 ]}สภาวะของสารละลายที่เอื้อต่อขั้นตอนแรก (การเกิดนิวเคลียส) ไม่จำเป็นต้องเป็นสภาวะเดียวกันกับที่เอื้อต่อขั้นตอนที่สอง (การเติบโตในภายหลัง) สภาวะของสารละลายควรไม่เอื้อต่อขั้นตอนแรก (การเกิดนิวเคลียส) แต่ควรเอื้อต่อขั้นตอนที่สอง (การเติบโต) เพื่อให้เกิดผลึกขนาดใหญ่เพียงหนึ่งเดียวต่อหยด หากการเกิดนิวเคลียสเอื้อมากเกินไป จะเกิดผลึกขนาดเล็กจำนวนมากในหยดแทนที่จะเป็นผลึกขนาดใหญ่หนึ่งเดียว หากเอื้อน้อยเกินไป จะไม่มีผลึกเกิดขึ้นเลย แนวทางอื่นๆ เกี่ยวข้องกับการตกผลึกโปรตีนภายใต้น้ำมัน โดยที่สารละลายโปรตีนในน้ำจะถูกกระจายภายใต้น้ำมันเหลว และน้ำจะระเหยผ่านชั้นน้ำมัน น้ำมันชนิดต่างๆ มีค่าการซึมผ่านของการระเหยที่แตกต่างกัน ดังนั้นจึงทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอัตราความเข้มข้นจากส่วนผสมของสารรับ/โปรตีนที่แตกต่างกัน^{[ 108 ]}

เป็นการยากที่จะคาดการณ์สภาวะที่ดีสำหรับการเกิดนิวเคลียสหรือการเติบโตของผลึกที่มีระเบียบ^{[ 109 ]}ในทางปฏิบัติ สภาวะที่เหมาะสมจะถูกระบุโดยการคัดกรองโดยจะเตรียมโมเลกุลจำนวนมาก และทดสอบสารละลายการตกผลึกที่หลากหลาย^{[ 110 ]}โดยทั่วไปแล้วจะต้องทดลองสภาวะของสารละลายหลายร้อยหรือหลายพันสภาวะก่อนที่จะพบสภาวะที่ประสบความสำเร็จ สภาวะต่างๆ สามารถใช้กลไกทางกายภาพอย่างน้อยหนึ่งอย่างเพื่อลดความสามารถในการละลายของโมเลกุล ตัวอย่างเช่น บางสภาวะอาจเปลี่ยนค่า pH บางสภาวะมีเกลือในอนุกรม Hofmeisterหรือสารเคมีที่ลดค่าคงที่ไดอิเล็กตริกของสารละลาย และบางสภาวะมีพอลิเมอร์ขนาดใหญ่ เช่นโพลีเอทิลีนไกลคอล ที่ผลักโมเลกุลออกจากสารละลายด้วยผลกระทบทางเอนโทรปี นอกจากนี้ยังเป็นเรื่องปกติที่จะลองอุณหภูมิหลายๆ ระดับเพื่อกระตุ้นการตกผลึก หรือค่อยๆ ลดอุณหภูมิลงเพื่อให้สารละลายอิ่มตัวยิ่งยวด วิธีการเหล่านี้ต้องการโมเลกุลเป้าหมายจำนวนมาก เนื่องจากใช้ความเข้มข้นสูงของโมเลกุลที่จะตกผลึก เนื่องจากความยากลำบากในการได้รับโปรตีนเกรดการตกผลึกใน ปริมาณมาก ( มิลลิกรัม ) จึงได้มีการพัฒนาหุ่นยนต์ที่สามารถจ่ายหยดทดลองการตกผลึกได้อย่างแม่นยำ ซึ่งมีปริมาตรประมาณ 100 นาโนลิตรหมายความว่าใช้โปรตีนน้อยลง 10 เท่าต่อการทดลอง เมื่อเทียบกับการทดลองการตกผลึกที่จัดเตรียมด้วยมือ (ประมาณ 1 ไมโครลิตร ) ^{[ 111 ]}

มีหลายปัจจัยที่ทราบกันดีว่าสามารถยับยั้งการตกผลึกได้ โดยทั่วไปแล้ว ผลึกที่กำลังเติบโตจะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิคงที่และป้องกันจากแรงกระแทกหรือการสั่นสะเทือนที่อาจรบกวนการตกผลึก สารเจือปนในโมเลกุลหรือในสารละลายสำหรับการตกผลึกมักเป็นอุปสรรคต่อการตกผลึก ความยืดหยุ่นของโครงสร้างในโมเลกุลก็มีแนวโน้มที่จะทำให้การตกผลึกเกิดขึ้นได้ยากขึ้นเช่นกัน เนื่องจากเอนโทรปี โมเลกุลที่มักจะรวมตัวกันเป็นเกลียวปกติมักจะไม่เต็มใจที่จะรวมตัวกันเป็นผลึก ผลึกอาจเสียหายได้จากการเกิดผลึกแฝดซึ่งอาจเกิดขึ้นเมื่อเซลล์หน่วยสามารถจัดเรียงตัวได้อย่างเหมาะสมในหลายทิศทาง แม้ว่าความก้าวหน้าล่าสุดในวิธีการคำนวณอาจช่วยให้สามารถแก้โครงสร้างของผลึกแฝดบางชนิดได้ก็ตาม เมื่อไม่สามารถตกผลึกโมเลกุลเป้าหมายได้ นักผลึกศาสตร์อาจลองอีกครั้งด้วยโมเลกุลที่มีการดัดแปลงเล็กน้อย แม้แต่การเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในคุณสมบัติของโมเลกุลก็อาจนำไปสู่ความแตกต่างอย่างมากในพฤติกรรมการตกผลึกได้

สำหรับโปรตีน พบว่าสิ่งเจือปนบางครั้งอาจช่วยส่งเสริมและบางครั้งอาจขัดขวางการเติบโตของผลึก การสั่นด้วยเสียงที่ได้ยินบางครั้งก็ได้ผล ปัญหาเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับ ลักษณะ การแยกเฟสของการตกผลึกของโปรตีน^{[ 112 ]}

ชุดรูปแบบการเลี้ยวเบนสองมิติที่บันทึกไว้ ซึ่งแต่ละรูปแบบสอดคล้องกับการวางแนวผลึกที่แตกต่างกัน จะถูกแปลงเป็นชุดสามมิติ การประมวลผลข้อมูลเริ่มต้นด้วยการจัดทำดัชนีการสะท้อน ซึ่งหมายถึงการระบุขนาดของเซลล์หน่วยและจุดสูงสุดของภาพใดที่สอดคล้องกับตำแหน่งใดในปริภูมิผกผัน ผลพลอยได้ของการจัดทำดัชนีคือการกำหนดสมมาตรของผลึก กล่าวคือ กลุ่มปริภูมิของมันกลุ่มปริภูมิบางกลุ่มสามารถตัดออกได้ตั้งแต่เริ่มต้น ตัวอย่างเช่น ไม่สามารถสังเกตสมมาตรการสะท้อนในโมเลกุลไครัลได้ ดังนั้นจึงอนุญาตให้มีเพียง 65 กลุ่มปริภูมิจาก 230 กลุ่มที่เป็นไปได้สำหรับโมเลกุลโปรตีนซึ่งเกือบทั้งหมดเป็นไครัล การจัดทำดัชนีโดยทั่วไปทำได้โดยใช้รูทีนการจัดทำดัชนีอัตโนมัติ^{[ 116 ]}เมื่อกำหนดสมมาตรแล้ว ข้อมูลจะถูกรวมเข้าด้วยกัน กระบวนการ นี้จะแปลงภาพหลายร้อยภาพที่มีการสะท้อนแสงหลายพันจุดให้เป็นไฟล์เดียว ซึ่งประกอบด้วย (อย่างน้อยที่สุด) บันทึกค่าดัชนีมิลเลอร์ของการสะท้อนแสงแต่ละจุด และค่าความเข้มของการสะท้อนแสงแต่ละจุด (ในขั้นตอนนี้ ไฟล์มักจะรวมถึงการประมาณค่าความคลาดเคลื่อนและการวัดความไม่สมบูรณ์ (ส่วนใดของการสะท้อนแสงที่กำหนดถูกบันทึกไว้ในภาพนั้น))

ชุดข้อมูลทั้งหมดอาจประกอบด้วยภาพแยกกันหลายร้อยภาพที่ถ่ายจากทิศทางการวางตัวที่แตกต่างกันของผลึก จะต้องรวมและปรับขนาดภาพเหล่านี้โดยใช้จุดสูงสุดที่ปรากฏในภาพสองภาพขึ้นไป ( การรวม ) และการปรับขนาดเพื่อให้ได้มาตราส่วนความเข้มที่สม่ำเสมอ การเพิ่มประสิทธิภาพมาตราส่วนความเข้มมีความสำคัญอย่างยิ่ง เนื่องจากความเข้มสัมพัทธ์ของจุดสูงสุดเป็นข้อมูลสำคัญที่ใช้ในการกำหนดโครงสร้าง เทคนิคการเก็บข้อมูลทางผลึกศาสตร์แบบซ้ำๆ และความสมมาตรสูงของวัสดุผลึกทำให้เครื่องวัดการเลี้ยวเบนบันทึกการสะท้อนที่สมมาตรกันหลายครั้ง สิ่งนี้ช่วยให้สามารถคำนวณค่าR-factor ที่เกี่ยวข้องกับความสมมาตร ซึ่งเป็นดัชนีความน่าเชื่อถือโดยพิจารณาจากความคล้ายคลึงกันของความเข้มที่วัดได้ของการสะท้อนที่สมมาตรกัน^{[ 117 ]}ดังนั้นจึงสามารถประเมินคุณภาพของข้อมูลได้

ความเข้มของ "จุด" การเลี้ยวเบนแต่ละจุดเป็นสัดส่วนกับค่าสัมบูรณ์ยกกำลังสองของแฟกเตอร์โครงสร้างแฟกเตอร์โครงสร้างเป็นจำนวนเชิงซ้อนที่มีข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับทั้งแอมพลิจูดและเฟสของคลื่นเพื่อให้ได้แผนที่ความหนาแน่นอิเล็กตรอน ที่ตีความได้ จำเป็นต้องทราบทั้งแอมพลิจูดและเฟส (แผนที่ความหนาแน่นอิเล็กตรอนช่วยให้นักผลึกศาสตร์สร้างแบบจำลองเริ่มต้นของโมเลกุลได้) ไม่สามารถบันทึกเฟสได้โดยตรงในระหว่างการทดลองการเลี้ยวเบน: นี่คือสิ่งที่เรียกว่าปัญหาเฟสการประมาณค่าเฟสเริ่มต้นสามารถทำได้หลายวิธี:

• การกำหนดเฟสแบบ Ab initioหรือวิธีโดยตรง  – วิธีนี้มักเป็นวิธีที่เลือกใช้สำหรับโมเลกุลขนาดเล็ก (<1000 อะตอมที่ไม่ใช่ไฮโดรเจน) และได้ถูกนำมาใช้ประสบความสำเร็จในการแก้ปัญหาเฟสสำหรับโปรตีนขนาดเล็ก หากความละเอียดของข้อมูลดีกว่า 1.4 Å (140pm)วิธีโดยตรงเพื่อรับข้อมูลเฟสได้ โดยใช้ประโยชน์จากความสัมพันธ์ของเฟสที่ทราบระหว่างกลุ่มการสะท้อนบางกลุ่ม ^{[ 118 ] [ 119 ]} 
• การแทนที่โมเลกุล  – หากทราบโครงสร้างที่เกี่ยวข้อง สามารถใช้เป็นแบบจำลองการค้นหาในการแทนที่โมเลกุลเพื่อกำหนดทิศทางและตำแหน่งของโมเลกุลภายในเซลล์หน่วย เฟสที่ได้ด้วยวิธีนี้สามารถใช้สร้างแผนที่ความหนาแน่นอิเล็กตรอนได้ ^{[ 120 ]}
• การกระเจิงของรังสีเอกซ์แบบผิดปกติ ( MADหรือSAD phasing ) – สามารถสแกนความยาวคลื่นของรังสีเอกซ์ผ่านขอบการดูดกลืน ^{[ a ]}ของอะตอม ซึ่งจะเปลี่ยนการกระเจิงในลักษณะที่ทราบได้ โดยการบันทึกชุดการสะท้อนที่สมบูรณ์ที่ความยาวคลื่นสามค่าที่แตกต่างกัน (ต่ำกว่ามาก สูงกว่ามาก และตรงกลางของขอบการดูดกลืน) จะสามารถหาโครงสร้างย่อยของอะตอมที่เกิดการเลี้ยวเบนแบบผิดปกติ และด้วยเหตุนี้จึงสามารถหาโครงสร้างของโมเลกุลทั้งหมดได้ วิธีที่นิยมที่สุดในการรวมอะตอมที่เกิดการกระเจิงแบบผิดปกติเข้ากับโปรตีนคือการแสดงออกของโปรตีนในเมไทโอนีนออโซโทรฟ (โฮสต์ที่ไม่สามารถสังเคราะห์เมไทโอนีนได้) ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่อุดมไปด้วยซีลีโนเมไทโอนีน ซึ่งมี อะตอม ของซีลีเนียมจากนั้นสามารถทำการทดลองการกระจายตัวแบบผิดปกติหลายความยาวคลื่น (MAD) รอบขอบการดูดกลืน ซึ่งควรจะให้ตำแหน่งของหมู่เมไทโอนีนใดๆ ภายในโปรตีน ทำให้ได้เฟสเริ่มต้น ^{[ 121 ]}
• Heavy atom methods (multiple isomorphous replacement) – If electron-dense metal atoms can be introduced into the crystal, direct methods or Patterson-space methods can be used to determine their location and to obtain initial phases. Such heavy atoms can be introduced either by soaking the crystal in a heavy atom-containing solution, or by co-crystallization (growing the crystals in the presence of a heavy atom). As in multi-wavelength anomalous dispersion phasing, the changes in the scattering amplitudes can be interpreted to yield the phases. Although this is the original method by which protein crystal structures were solved, it has largely been superseded by multi-wavelength anomalous dispersion phasing with selenomethionine.^[120]

Having obtained initial phases, an initial model can be built. The atomic positions in the model and their respective Debye-Waller factors (or B-factors, accounting for the thermal motion of the atom) can be refined to fit the observed diffraction data, ideally yielding a better set of phases. A new model can then be fit to the new electron density map and successive rounds of refinement are carried out. This iterative process continues until the correlation between the diffraction data and the model is maximized. The agreement is measured by an R-factor defined as

${\displaystyle R={\frac {\sum _{\text{all reflections}}\left|F_{\text{obs}}-F_{\text{calc}}\right|}{\sum _{\text{all reflections}}\left|F_{\text{obs}}\right|}},}$

โดยที่Fคือแฟกเตอร์โครงสร้างเกณฑ์คุณภาพที่คล้ายกันคือR ซึ่งคำนวณจากชุดย่อย (~10%) ของการสะท้อนแสงที่ไม่ได้รวมอยู่ในการปรับปรุงโครงสร้าง ปัจจัย R ทั้งสอง ขึ้นอยู่กับความละเอียดของข้อมูล โดยทั่วไปแล้วR ควรมีค่าประมาณความละเอียดในหน่วยอังสตรอมหารด้วย 10 ดังนั้นชุดข้อมูลที่ มีความละเอียด 2 Å ควรให้ค่าR สุดท้าย ประมาณ 0.2 คุณลักษณะของพันธะเคมี เช่น สเตอริโอเคมี พันธะไฮโดรเจน และการกระจายของความยาวพันธะและมุม เป็นมาตรวัดเสริมของคุณภาพแบบจำลอง ในการสร้างแบบจำลองแบบวนซ้ำ มักจะพบอคติเฟสหรืออคติแบบจำลอง เนื่องจากค่าประมาณเฟสมาจากแบบจำลอง แผนที่ที่คำนวณแต่ละรอบจึงมักแสดงความหนาแน่นในทุกที่ที่แบบจำลองมีความหนาแน่น โดยไม่คำนึงว่าจะมีความหนาแน่นจริงหรือไม่ ปัญหานี้สามารถบรรเทาได้ด้วยการถ่วงน้ำหนักความน่าจะเป็นสูงสุดและการตรวจสอบโดยใช้แผนที่ละเว้น^{[ 124 ]}

อาจเป็นไปไม่ได้ที่จะสังเกตอะตอมทุกตัวในหน่วยอสมมาตร ในหลายกรณีความไม่เป็นระเบียบทางผลึกศาสตร์ทำให้แผนที่ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนเบลอ อะตอมที่มีการกระเจิงแสงอ่อนๆ เช่น ไฮโดรเจน มักจะมองไม่เห็น นอกจากนี้ ยังเป็นไปได้ที่อะตอมเดียวจะปรากฏหลายครั้งในแผนที่ความหนาแน่นของอิเล็กตรอน เช่น หากหมู่ข้างเคียงของโปรตีนมีโครงสร้างที่อนุญาตได้หลายแบบ (<4) ในกรณีอื่นๆ นักผลึกศาสตร์อาจตรวจพบว่าโครงสร้างพันธะโควาเลนต์ที่อนุมานได้สำหรับโมเลกุลนั้นไม่ถูกต้องหรือเปลี่ยนแปลงไป ตัวอย่างเช่น โปรตีนอาจถูกตัดหรือได้รับการดัดแปลงหลังการแปลรหัสซึ่งไม่ได้รับการตรวจพบก่อนการตกผลึก

ความท้าทายทั่วไปในการปรับปรุงโครงสร้างผลึกเกิดจากความไม่เป็นระเบียบทางผลึกศาสตร์ ความไม่เป็นระเบียบสามารถเกิดขึ้นได้หลายรูปแบบ แต่โดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับการอยู่ร่วมกันของสปีชีส์หรือคอนฟอร์เมชันสองชนิดขึ้นไป การไม่รู้จักความไม่เป็นระเบียบส่งผลให้เกิดการตีความที่ผิดพลาด ข้อผิดพลาดจากการสร้างแบบจำลองความไม่เป็นระเบียบที่ไม่เหมาะสมแสดงให้เห็นได้จากสมมติฐานที่ลดทอนของ ไอโซเมริซึม การยืดพันธะ^{[ 125 ]} ความไม่เป็นระเบียบถูกสร้างแบบจำลองโดยสัมพันธ์กับจำนวนประชากรสัมพัทธ์ของส่วนประกอบ ซึ่งมักจะมีเพียงสองส่วน และเอกลักษณ์ของส่วนประกอบเหล่านั้น ในโครงสร้างของโมเลกุลขนาดใหญ่และไอออน ตัวทำละลายและไอออนตรงข้ามมักไม่เป็นระเบียบ

ปัจจุบันการใช้ระเบียบวิธีคำนวณในการวิเคราะห์ข้อมูลการเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์ของผงวัสดุเป็นที่แพร่หลายมากขึ้น โดยทั่วไปจะเปรียบเทียบข้อมูลจากการทดลองกับไดอะแกรมการเลี้ยวเบนที่จำลองขึ้นจากโครงสร้างแบบจำลอง โดยคำนึงถึงพารามิเตอร์ของเครื่องมือ และปรับปรุงพารามิเตอร์โครงสร้างหรือโครงสร้างจุลภาคของแบบจำลองโดยใช้อัลกอริทึมการลดค่าต่ำสุดแบบกำลังสองน้อยที่สุด เครื่องมือส่วนใหญ่ที่มีอยู่ซึ่งอนุญาตให้ระบุเฟสและการปรับปรุงโครงสร้าง ^นั้นใช้พื้นฐานจากวิธี Rietveld [ ^{126 ] [ 127 ]}โดยบางส่วนเป็นซอฟต์แวร์แบบเปิดและฟรี เช่น FullProf Suite ^{[ 128 ] [ 129 ]} Jana2006 ^{[ 130 ]} MAUD ^{[ 131 ] [ 132 ] [ 133 ]} Rietan ^{[ 134 ]} GSAS ^{[ 135 ]}เป็นต้น ในขณะที่บางส่วนมีให้ใช้งานภายใต้ใบอนุญาตเชิงพาณิชย์ เช่น Diffrac.Suite TOPAS ^{[ 136 ]} Match! ^{[ 137 ]}เป็นต้น เครื่องมือเหล่านี้ส่วนใหญ่ยังอนุญาตให้ ทำการปรับปรุง Le Bail (เรียกอีกอย่างว่าการจับคู่โปรไฟล์) นั่นคือ การปรับปรุงพารามิเตอร์ของเซลล์โดยอิงจากตำแหน่งยอด Bragg และโปรไฟล์ยอด โดยไม่คำนึงถึงโครงสร้างผลึกวิทยาด้วยตัวมันเอง เครื่องมือรุ่นใหม่กว่าช่วยให้สามารถปรับปรุงข้อมูลทั้งโครงสร้างและโครงสร้างจุลภาคได้ เช่น โปรแกรม FAULTS ที่รวมอยู่ใน FullProf Suite ^{[ 138 ]}ซึ่งช่วยให้สามารถปรับปรุงโครงสร้างที่มีข้อบกพร่องในระนาบ (เช่น ข้อบกพร่องในการเรียงซ้อน การเกิดแฝด การเจริญเติบโตแทรกซ้อน)

เมื่อแบบจำลองโครงสร้างของโมเลกุลเสร็จสมบูรณ์แล้ว มักจะมีการบันทึกไว้ในฐานข้อมูลทางผลึกศาสตร์เช่นฐานข้อมูลโครงสร้างเคมบริดจ์ (สำหรับโมเลกุลขนาดเล็ก) ฐานข้อมูลโครงสร้างผลึกอนินทรีย์ (ICSD) (สำหรับสารประกอบอนินทรีย์) หรือธนาคารข้อมูลโปรตีน (สำหรับโปรตีนและบางครั้งกรดนิวคลีอิก) โครงสร้างจำนวนมากที่ได้จากโครงการเชิงพาณิชย์ส่วนตัวในการตกผลึกโปรตีนที่มีความสำคัญทางการแพทย์นั้น ไม่ได้ถูกบันทึกไว้ในฐานข้อมูลทางผลึกศาสตร์สาธารณะ