ในทางชีววิทยาการตั้งโปรแกรมใหม่หมายถึงการลบและการปรับเปลี่ยน เครื่องหมาย เอพิเจเนติกเช่นเมทิลเลชันของ DNAในระหว่างการพัฒนาของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหรือในการเพาะเลี้ยงเซลล์^{[ 1 ]}การควบคุมดังกล่าวมักเกี่ยวข้องกับการดัดแปลงโคเวเลนต์ทางเลือกของฮิสโตนด้วย

การปรับเปลี่ยนโปรแกรมทางพันธุกรรมซึ่งมีขนาดใหญ่ (10% ถึง 100% ของเครื่องหมายทางพันธุกรรม) และเกิดขึ้นอย่างรวดเร็ว (ภายในไม่กี่ชั่วโมงถึงไม่กี่วัน) เกิดขึ้นในสามช่วงชีวิตของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เกือบ 100% ของเครื่องหมายทางพันธุกรรมถูกปรับเปลี่ยนโปรแกรมในสองช่วงเวลาสั้นๆ ในช่วงต้นของการพัฒนาหลังจากการปฏิสนธิของไข่กับอสุจินอกจากนี้ เกือบ 10% ของการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอในเซลล์ประสาทของฮิปโปแคมปัสสามารถเปลี่ยนแปลงได้อย่างรวดเร็วในระหว่างการสร้างความทรงจำเกี่ยวกับความกลัวที่รุนแรง

หลังจากการปฏิสนธิในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม รูปแบบ การเติมหมู่เมทิลในดีเอ็นเอส่วนใหญ่จะถูกลบออกไป แล้วจึงสร้างขึ้นใหม่ในช่วงต้นของการพัฒนาตัวอ่อน การเติมหมู่เมทิลจากพ่อแม่เกือบทั้งหมดจะถูกลบออกไป ครั้งแรกในช่วงต้นของการเกิดตัวอ่อนและอีกครั้งในกระบวนการสร้างเซลล์สืบพันธุ์ โดยมีการลดหมู่เมทิลและเพิ่มหมู่เมทิลใหม่ในแต่ละครั้ง การลดหมู่เมทิลในช่วงต้นของการเกิดตัวอ่อนเกิดขึ้นในช่วงก่อนการฝังตัว หลังจากที่อสุจิปฏิสนธิกับไข่เพื่อสร้างไซโกตการลดหมู่เมทิลในดีเอ็นเอของพ่อ จะเกิดขึ้น อย่างรวดเร็ว และการลดหมู่เมทิลในดีเอ็นเอของแม่จะเกิดขึ้นอย่างช้าๆ จนกระทั่งเกิด โมรูลาซึ่งแทบไม่มีหมู่เมทิลเลย หลังจากที่บลาสโตซิสต์เกิดขึ้น การเติมหมู่ เมทิลจึงจะเริ่มต้นขึ้น และเมื่อเกิดอีพิบลาสต์ การเติมหมู่เมทิลก็จะเกิดขึ้นอย่างต่อเนื่องจนถึงระยะการฝังตัวของตัวอ่อน อีกช่วงหนึ่งของการลดหมู่เมทิลอย่างรวดเร็วและเกือบสมบูรณ์เกิดขึ้นในช่วงการสร้างเซลล์สืบพันธุ์ภายในเซลล์สืบพันธุ์ ดั้งเดิม (PGCs) นอกเหนือจาก PGCs แล้ว ในระยะหลังการฝังตัว รูปแบบการเมทิลเลชั่นในเซลล์ร่างกายจะมีความเฉพาะเจาะจงตามระยะและเนื้อเยื่อ โดยมีการเปลี่ยนแปลงที่คาดว่าจะกำหนด ชนิดของเซลล์แต่ละชนิดและคงอยู่อย่างเสถียรเป็นเวลานาน^{[ 2 ]}

จีโนมของสเปิร์ม หนู มี การเติมหมู่เมทิลที่ตำแหน่ง CpG ในดีเอ็นเอประมาณ 80–90% คิดเป็นจำนวนประมาณ 20 ล้านตำแหน่ง หลังจากการปฏิสนธิโครโมโซมของพ่อจะถูกกำจัดหมู่เมทิลออก เกือบทั้งหมด ภายในหกชั่วโมงด้วยกระบวนการที่เกิดขึ้นอย่างรวดเร็วก่อนการจำลองดีเอ็นเอ (เส้นสีน้ำเงินในรูป) ในเซลล์ไข่ ที่เจริญเต็มที่ ประมาณ 40% ของตำแหน่ง CpG จะถูกเติมหมู่เมทิล การกำจัดหมู่เมทิลออกจากโครโมโซมของแม่ส่วนใหญ่เกิดขึ้นจากการปิดกั้นเอนไซม์ ที่ทำหน้าที่เติมหมู่เมทิล ไม่ให้ทำงานกับดีเอ็นเอที่มาจากแม่ และจากการเจือจางดีเอ็นเอของแม่ที่ถูกเติมหมู่เมทิลในระหว่างการจำลอง (เส้นสีแดงในรูป) เซลล์โมรูลา (ในระยะ 16 เซลล์) มี การเติมหมู่เมทิลในดีเอ็นเอเพียงเล็กน้อย(เส้นสีดำในรูป) การเมทิลเลชันเริ่มเพิ่มขึ้นในวันที่ 3.5 หลังการปฏิสนธิในบลาสโตซิสต์และมีการเมทิลเลชันเพิ่มขึ้นอย่างมากในวันที่ 4.5 ถึง 5.5 ในเอพิบลาสต์โดยเพิ่มขึ้นจาก 12% เป็น 62% และถึงระดับสูงสุดหลังการฝังตัวในมดลูก^{[ 3 ]} ในวันที่เจ็ดหลังการปฏิสนธิ เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิม (PGC) ที่เกิดขึ้นใหม่ ใน ตัวอ่อน ที่ฝังตัว จะแยกตัวออกจากเซลล์ร่างกาย ที่เหลืออยู่ ณ จุดนี้ PGC จะมีระดับการเมทิลเลชันใกล้เคียงกับเซลล์ร่างกาย

เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิม (PGC) ที่เพิ่งก่อตัวขึ้นในตัวอ่อนที่ฝังตัวจะวิวัฒนาการมาจากเซลล์ร่างกาย ณ จุดนี้ PGC มีระดับเมทิลเลชั่นสูง เซลล์เหล่านี้จะอพยพจากเอพิบลาสต์ไปยังสันรังไข่ขณะนี้เซลล์กำลังเพิ่มจำนวนอย่างรวดเร็วและเริ่มกระบวนการดีเมทิลเลชั่นเป็นสองระลอก ในระลอกแรก การดีเมทิลเลชั่นเกิดขึ้นจากการเจือจางแบบจำลอง แต่ในระลอกที่สอง การดีเมทิลเลชั่นเกิดขึ้นจากกระบวนการที่กระทำอย่างแข็งขัน ระลอกที่สองนำไปสู่การดีเมทิลเลชั่นของตำแหน่ง เฉพาะ ณ จุดนี้ จีโนมของ PGC แสดงระดับเมทิลเลชั่นของ DNA ต่ำที่สุดในบรรดาเซลล์ทั้งหมดในวงจรชีวิต [ในวันที่ 13.5 ของตัวอ่อน (E13.5) ดูรูปที่สองในส่วนนี้] ^{[ 4 ]}

หลังจากการปฏิสนธิ เซลล์บางส่วนของเอ็มบริโอที่เกิดขึ้นใหม่จะเคลื่อนที่ไปยังสันเนื้องงอกและจะกลายเป็นเซลล์สืบพันธุ์ (อสุจิและไข่) ของรุ่นต่อไป เนื่องจากปรากฏการณ์ การประทับตราทางพันธุกรรม ( genomic imprinting ) จีโนมของแม่และพ่อจะถูกทำเครื่องหมายแตกต่างกันและต้องได้รับการตั้งโปรแกรมใหม่ให้ถูกต้องทุกครั้งที่ผ่านเข้าสู่เซลล์สืบพันธุ์ ดังนั้น ในกระบวนการสร้างเซลล์ สืบพันธุ์ เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมจะต้องลบรูปแบบ การเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอจากทั้งพ่อและแม่ดั้งเดิมออก และสร้างรูปแบบใหม่ขึ้นโดยอิงตามเพศของผู้ถ่ายทอด

หลังจากปฏิสนธิแล้ว จีโนมของพ่อและแม่จะถูกกำจัดเมทิลเลชันเพื่อลบลายเซ็นเอพิเจเนติกส์และได้รับศักยภาพในการพัฒนาไปเป็นเซลล์ทุกชนิด ณ จุดนี้มีความไม่สมมาตรเกิดขึ้น คือ นิวเคลียสของตัวผู้จะผ่านกระบวนการกำจัดเมทิลเลชันอย่างรวดเร็วและกระตือรือร้น ในขณะที่นิวเคลียสของตัวเมียจะถูกกำจัดเมทิลเลชันแบบเฉื่อยชาในระหว่างการแบ่งเซลล์อย่างต่อเนื่อง กระบวนการกำจัดเมทิลเลชันของ DNAเกี่ยวข้องกับการซ่อมแซมการตัดฐานและอาจรวมถึงกลไกการซ่อมแซม DNA อื่นๆ ด้วย^{[ 5 ]} แม้ว่ากระบวนการนี้จะเกิดขึ้นทั่วทั้งเซลล์ แต่ก็มีลำดับบางส่วนที่หลีกเลี่ยงกระบวนการนี้ เช่นบริเวณที่มีเมทิลเลชันแตกต่างกัน (DMRS) ที่เกี่ยวข้องกับยีนที่ถูกประทับตรา เรโทรทรานสโพซอนและเฮเทอโร โครมาติน เซนโทรเมียร์ จำเป็นต้องมีการเติมเมทิลเลชันอีกครั้งเพื่อทำให้ตัวอ่อนพัฒนาไปเป็นสิ่งมีชีวิตที่สมบูรณ์^{[ 6 ]}

การจัดการตัวอ่อนก่อนการฝังตัว ในหลอดทดลองแสดงให้เห็นว่าสามารถรบกวนรูปแบบการเมทิลเลชั่นที่ตำแหน่งที่มีการประทับตรา^{[ 7 ]}และมีบทบาทสำคัญในสัตว์โคลน^{[ 8 ]}

Learning and memory have levels of permanence, differing from other mental processes such as thought, language, and consciousness, which are temporary in nature. Learning and memory can be either accumulated slowly (multiplication tables) or rapidly (touching a hot stove), but once attained, can be recalled into conscious use for a long time. Rats subjected to one instance of contextual fear conditioning create an especially strong long-term memory. At 24 h after training, 9.17% of the genes in the rat genomes of hippocampus neurons were found to be differentially methylated. This included more than 2,000 differentially methylated genes at 24 hours after training, with over 500 genes being demethylated.^[9] The hippocampus region of the brain is where contextual fear memories are first stored (see figure of the brain, this section), but this storage is transient and does not remain in the hippocampus. In rats contextual fear conditioning is abolished when the hippocampus is subjected to hippocampectomy just 1 day after conditioning, but rats retain a considerable amount of contextual fear when a long delay (28 days) is imposed between the time of conditioning and the time of hippocampectomy.^[10]

Three molecular stages are required for reprogramming the DNA methylome. Stage 1: Recruitment. The enzymes needed for reprogramming are recruited to genome sites that require demethylation or methylation. Stage 2: Implementation. The initial enzymatic reactions take place. In the case of methylation, this is a short step that results in the methylation of cytosine to 5-methylcytosine. Stage 3: Base excision DNA repair. The intermediate products of demethylation are catalysed by specific enzymes of the base excision DNA repair pathway that finally restore cystosine in the DNA sequence.

รูปในส่วนนี้แสดงบทบาทสำคัญของเอนไซม์เมทิลไซโตซีนไดออกซิเจเนส (TET)ในกระบวนการดีเมทิลเลชันของ 5-เมทิลไซโตซีนเพื่อสร้างไซโตซีน^{[ 12 ]} ดังที่ได้ทบทวนไว้ในปี 2018 ^{[ 12 ]} 5mC มักจะถูกออกซิไดซ์โดยเอนไซม์ไดออกซิเจเนส TET ในขั้นต้นเพื่อสร้าง5-ไฮดรอกซีเมทิลไซโตซีน (5hmC) ในขั้นตอนต่อมา (ดูรูป) เอนไซม์ TET จะทำการไฮดรอกซิเลชัน 5hmC ต่อไปเพื่อสร้าง5-ฟอร์มิลไซโตซีน (5fC) และ5-คาร์บอกซิลไซโตซีน (5caC) ไทมีน-ดีเอ็นเอไกลโคซิเลส (TDG) จะจดจำเบสตัวกลาง 5fC และ 5caC และตัดพันธะไกลโคไซด์ ออก ส่งผลให้เกิดไซต์อะไพริมิดินิก (ไซต์ AP) ในวิถีการกำจัดหมู่เอมีนแบบออกซิเดชันทางเลือก 5hmC สามารถถูกกำจัดหมู่เอมีนแบบออกซิเดชันโดย เอนไซม์ APOBEC (AID/APOBEC) เพื่อสร้าง 5-ไฮดรอกซีเมทิลยูราซิล (5hmU) หรือ 5mC สามารถถูกแปลงเป็นไทมีน (Thy) ได้ 5hmU สามารถถูกตัดโดย TDG, SMUG1 , NEIL1หรือMBD4จากนั้นตำแหน่ง AP และความไม่ตรงกันของ T:G จะได้รับการซ่อมแซมโดยเอนไซม์ซ่อมแซมการตัดฐาน (BER) เพื่อให้ได้ไซโตซีน (Cyt)

ไอโซฟอร์มของเอนไซม์ TETประกอบด้วยไอโซฟอร์ม TET1 อย่างน้อย 2 ไอโซฟอร์ม, TET2 หนึ่งไอโซฟอร์ม และ TET3สามไอโซฟอร์ม[ ^{13 ] [ 14 ] ไอ}โซฟอร์ม TET1 แบบเต็มความยาวมาตรฐานดูเหมือนจะจำกัดอยู่เฉพาะในตัวอ่อนระยะแรก เซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อน และเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิม (PGCs) ไอโซฟอร์ม TET1 ที่เด่นในเนื้อเยื่อร่างกายส่วนใหญ่ อย่างน้อยในหนู เกิดจาก การใช้ โปรโมเตอร์ทางเลือกซึ่งทำให้เกิดทรานสคริปต์สั้นและโปรตีนที่ถูกตัดทอนซึ่งเรียกว่า TET1s ไอโซฟอร์มของ TET3 ได้แก่ รูปแบบเต็มความยาว TET3FL รูปแบบสไปลซ์แบบสั้น TET3s และรูปแบบที่เกิดขึ้นในโอโอไซต์และเซลล์ประสาทซึ่งเรียกว่า TET3o TET3o ถูกสร้างขึ้นโดยการใช้โปรโมเตอร์ทางเลือกและมีเอ็ กซอน N-terminal แรกเพิ่มเติมที่เข้ารหัส กรดอะมิโน 11 ตัว TET3o พบเฉพาะในเซลล์ไข่และเซลล์ประสาทเท่านั้น และไม่แสดงออกในเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนหรือเซลล์ชนิดอื่น ๆ หรือเนื้อเยื่อของหนูโตเต็มวัยที่ทำการทดสอบ ในขณะที่การแสดงออกของ TET1 แทบจะไม่สามารถตรวจพบได้ในเซลล์ไข่และไซโกต และ TET2 แสดงออกในระดับปานกลางเท่านั้น แต่ TET3o ซึ่งเป็นตัวแปรของ TET3 แสดงระดับการแสดงออกที่สูงมากในเซลล์ไข่และไซโกต แต่แทบจะไม่มีเลยในระยะ 2 เซลล์ เป็นไปได้ว่า TET3o ซึ่งมีระดับสูงในเซลล์ประสาท เซลล์ไข่ และไซโกตในระยะ 1 เซลล์ เป็นเอนไซม์ TET หลักที่ถูกนำมาใช้เมื่อเกิดการกำจัดหมู่เมทิลอย่างรวดเร็วในปริมาณมากในเซลล์เหล่านี้

เอนไซม์TETไม่ได้จับกับ5-เมทิลไซโตซีน โดยเฉพาะ ยกเว้นเมื่อถูกดึงดูดเข้ามา หากไม่มีการดึงดูดหรือการกำหนดเป้าหมาย TET1 จะจับกับโปรโมเตอร์ CG สูงและเกาะ CpG (CGIs) ทั่วทั้งจีโนมเป็นหลักโดยโดเมน CXXC ที่สามารถจดจำCGIs ที่ไม่มีการเติมเมทิลได้^{[ 15 ]} TET2 ไม่มีความสัมพันธ์กับ 5-เมทิลไซโตซีนใน DNA ^{[ 16 ]}โดเมน CXXC ของ TET3 แบบเต็มความยาว ซึ่งเป็นรูปแบบที่เด่นที่แสดงออกในเซลล์ประสาท จะจับกับ CpG ที่ C ถูกแปลงเป็น 5-คาร์บอกซีไซโตซีน (5caC) ได้อย่างแข็งแรงที่สุด อย่างไรก็ตาม มันยังจับกับCpG ที่ไม่มีการเติมเมทิลด้วย^{[ 14 ]}

เพื่อให้เอนไซม์ TETเริ่มกระบวนการดีเมทิลเลชัน เอนไซม์นั้นจะต้องถูกดึงดูดไปยังตำแหน่ง CpG ที่ถูกเมทิลเลชันใน DNA ก่อน โปรตีนสองชนิดที่แสดงให้เห็น ^ว่าสามารถดึงดูดเอนไซม์ TET ไปยังไซโตซีนที่ถูกเมทิลเลชันใน DNA ได้แก่OGG1 (ดูรูปการเริ่มต้นการดีเมทิลเลชันของ DNA) ^{[ 17 ]}และEGR1 [ ^{18 ]}

ออก โซกัวนีนไกลโคซิเลส (OGG1) ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาขั้นตอนแรกในการซ่อมแซมเบสที่เสียหายจากการออกซิเดชัน8-OHdG OGG1 ค้นหา 8-OHdG โดยการเลื่อนไปตาม DNA เชิงเส้นที่ 1,000 คู่เบสใน 0.1 วินาที^{[ 19 ]} OGG1 ค้นหา 8-OHdG ได้อย่างรวดเร็วมาก โปรตีน OGG1 จับกับ DNA ที่เสียหายจากการออกซิเดชันโดยใช้เวลาครึ่งหนึ่งสูงสุดประมาณ 6 วินาที^{[ 20 ]} เมื่อ OGG1 พบ 8-OHdG มันจะเปลี่ยนโครงสร้างและสร้างสารเชิงซ้อนกับ 8-OHdG ในช่องจับของ OGG1 ^{[ 21 ]} OGG1 ไม่ได้ดำเนินการกำจัด 8-OHdG ทันที การกำจัด 8-OHdG ครึ่งหนึ่งสูงสุดใช้เวลาประมาณ 30 นาทีในเซลล์ HeLa ในหลอดทดลอง [ ^{22 ]}หรือประมาณ 11 นาทีในตับของหนู ที่ ^ได้รับรังสี^{[ 23 ]} การออกซิเดชันของ DNA โดยออกซิเจนที่ว่องไวจะเกิดขึ้นที่กัวนีนในตำแหน่ง CpG ที่ถูกเมทิลเลชันเป็นหลัก เนื่องจากศักยภาพการแตกตัวเป็นไอออนของเบสกัวนีนที่อยู่ติดกับ 5-เมทิลไซโตซีน ลดลง ^{[ 24 ]} TET1 จับ (ถูกดึงดูดไปยัง) OGG1 ที่จับกับ 8-OHdG (ดูรูป) ^{[ 17 ]} ซึ่งน่าจะทำให้ TET1 สามารถกำจัดเมทิลออกจากไซโตซีนที่ถูกเมทิลเลชันที่อยู่ติดกันได้ เมื่อเซลล์เยื่อบุผิวเต้านม ของมนุษย์ (MCF-10A) ได้รับการบำบัดด้วย H ₂ O ₂ 8-OHdG ใน DNA จะเพิ่มขึ้น 3.5 เท่า และทำให้เกิดการกำจัดเมทิลออกจาก 5-เมทิลไซโตซีนในวงกว้างจนเหลือประมาณ 20% ของระดับเริ่มต้นใน DNA ^{[ 17 ]}

ยีนโปรตีนตอบสนองการเจริญเติบโตในระยะเริ่มต้น 1 ( EGR1 ) เป็นยีนที่แสดงออกอย่างรวดเร็ว (IEG) ลักษณะเด่นของ IEG คือการควบคุมระดับ mRNA อย่างรวดเร็วและชั่วคราวภายในไม่กี่นาที โดยไม่ขึ้นกับการสังเคราะห์โปรตีน^{[ 25 ]} EGR1 สามารถถูกกระตุ้นได้อย่างรวดเร็วโดยกิจกรรมของเซลล์ประสาท^{[ 26 ]} ในวัยผู้ใหญ่ EGR1 จะแสดงออกอย่างกว้างขวางทั่วสมอง โดยรักษาระดับการแสดงออกพื้นฐานในหลายพื้นที่สำคัญของสมอง รวมถึง คอร์เทกซ์พรี ฟ รอนทั ลส่วนกลาง สไตรอาตัมฮิปโปแคมปัส และอะมิกดาลา [ ^{25 ] การ} แสดงออกนี้เชื่อมโยงกับการควบคุมการรับรู้ การตอบสนองทางอารมณ์ พฤติกรรมทางสังคม และความไวต่อรางวัล^{[ 25 ]} EGR1 จับกับ DNA ที่ตำแหน่งที่มีโมทีฟ 5′-GCGTGGGCG-3′ และ 5'-GCGGGGGCGG-3′ และโมทีฟเหล่านี้ส่วนใหญ่อยู่ในบริเวณโปรโมเตอร์ของยีน^{[ 26 ]} ไอโซฟอร์มสั้น TET1s ถูกแสดงออกในสมอง EGR1 และ TET1s สร้างคอมเพล็กซ์โดยอาศัย บริเวณ ปลาย Cของโปรตีนทั้งสอง โดยไม่ขึ้นกับการเชื่อมโยงกับ DNA ^{[ 26 ]} EGR1 ดึงดูด TET1s ไปยังบริเวณจีโนมที่อยู่รอบ ๆ ตำแหน่งการจับของ EGR1 ^{[ 26 ]}ในกรณีที่มี EGR1 อยู่ TET1s สามารถทำการกำจัดหมู่เมทิลเฉพาะตำแหน่งและกระตุ้นการแสดงออกของยีนปลายน้ำที่ถูกควบคุมโดย EGR1 ได้^{[ 26 ]}

การวิจัยเกี่ยวกับการสร้างโปรแกรมใหม่ในช่วงแรกเกี่ยวข้องกับการใช้การเหนี่ยวนำด้วยฮอร์โมนเพื่อแยกเซลล์ให้เป็นรูปแบบอื่น ในปี 1960 นักชีววิทยาพืชMary Clutterได้แสดงให้เห็นว่าเนื้อเยื่อหลอดเลือดใน ต้น ยาสูบสามารถเปลี่ยนแปลงได้ด้วยวิธีนี้^{[ 27 ]}เธอประกาศในปี 1961 ว่าเธอได้ใช้กระบวนการเดียวกันนี้ในการเปลี่ยน เซลล์ โฟลเอ็มให้เป็นเซลล์ไซเล็ม^{[ 28 ]}บุคคลแรกที่ประสบความสำเร็จในการสาธิตการสร้างโปรแกรมใหม่ในเซลล์สัตว์คือJohn Gurdonซึ่งในปี 1962 ได้แสดงให้เห็นว่าเซลล์ร่างกายที่แตกต่างกันสามารถถูกสร้างโปรแกรมใหม่กลับไปเป็นสภาวะตัวอ่อนได้ เมื่อเขาสามารถสร้างลูกอ๊อดที่ว่ายน้ำได้หลังจากถ่ายโอนเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ที่แตกต่างกันเข้าไปในไข่กบที่ถูกเอาแกนกลางออก^{[ 29 ]} ด้วยความสำเร็จนี้ เขาได้รับ รางวัลโนเบลสาขาการแพทย์ประจำปี 2012 ร่วมกับShinya Yamanaka ^{[ 30 ]} Yamanaka เป็นคนแรกที่แสดงให้เห็น (ในปี 2006) ว่ากระบวนการถ่ายโอนนิวเคลียสของเซลล์ร่างกายหรือกระบวนการรีโปรแกรมเซลล์ไข่ (ดูด้านล่าง) ที่ Gurdon ค้นพบนั้น สามารถจำลองได้ (ในหนู) โดยใช้ปัจจัยที่กำหนด ( Oct4 , Sox2 , Klf4และc-Myc ) เพื่อสร้างเซลล์ต้นกำเนิดที่มีศักยภาพหลายอย่าง (iPSCs) ^{[ 31 ]}มีการใช้ยีนชุดอื่นๆ ด้วยเช่นกัน รวมถึง LIN25 ^{[ 32 ]}และโปรตีน Homeobox NANOG ^{[ 32 ] [ 33 ]}

จากการค้นพบว่าชะตากรรม ของเซลล์สามารถเปลี่ยนแปลงได้ คำถามคือลำดับเหตุการณ์ใดที่เกิดขึ้นซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์กำลังได้รับการตั้งโปรแกรมใหม่ เนื่องจากผลิตภัณฑ์สุดท้ายของการตั้งโปรแกรม iPSC ใหม่นั้นมีความคล้ายคลึงกันในด้านสัณฐานวิทยาการแพร่กระจายการแสดงออกของยีน ความสามารถในการ เป็นพหุศักยภาพและ กิจกรรมของเทโลเมอเร สจึงมีการใช้เครื่องหมายทางพันธุกรรมและสัณฐานวิทยาเป็นวิธีในการกำหนดว่าการตั้งโปรแกรมใหม่เกิดขึ้นในระยะใด^{[ 34 ]}การตั้งโปรแกรมใหม่ถูกกำหนดเป็นสามระยะ ได้แก่ การเริ่มต้น การเจริญเติบโต และการทำให้เสถียร^{[ 35 ]}

ระยะเริ่มต้นเกี่ยวข้องกับการควบคุมการแสดงออกของยีนเฉพาะชนิดเซลล์และการควบคุมการแสดงออกของยีนพหุศักยภาพ^{[ 35 ]}เมื่อเซลล์เคลื่อนไปสู่ภาวะพหุศักยภาพ กิจกรรม ของเทโลเมอเรสจะถูกกระตุ้นอีกครั้งเพื่อขยายเทโลเมียร์รูปร่างของเซลล์สามารถส่งผลโดยตรงต่อกระบวนการรีโปรแกรม เนื่องจากเซลล์กำลังปรับเปลี่ยนตัวเองเพื่อเตรียมพร้อมสำหรับการแสดงออกของยีนพหุศักยภาพ^{[ 36 ]}ตัวบ่งชี้หลักที่แสดงว่าระยะเริ่มต้นเสร็จสมบูรณ์แล้วคือการแสดงออกของยีนแรกที่เกี่ยวข้องกับพหุศักยภาพ ซึ่งรวมถึงการแสดงออกของOct-4หรือโปรตีน Homeobox NANOGในขณะที่เกิดการเปลี่ยนผ่านจากเนื้อเยื่อเกี่ยวพันเป็นเนื้อเยื่อบุผิว (MET) และการสูญเสียอะพอพโทซิสและภาวะชราภาพ^{[ 37 ]}

หากเซลล์ถูกตั้งโปรแกรมใหม่โดยตรงจากเซลล์ร่างกาย หนึ่ง ไปยังอีกเซลล์หนึ่ง ยีนที่เกี่ยวข้องกับเซลล์แต่ละประเภทจะเริ่มถูกควบคุมขึ้นและลงตามลำดับ^{[ 35 ]}ซึ่งอาจเกิดขึ้นได้ทั้งจากการตั้งโปรแกรมเซลล์ใหม่โดยตรงหรือการสร้างตัวกลาง เช่น iPSC และการแยกตัวเป็นเซลล์ประเภทที่ต้องการ^{[ 37 ]}

ระยะเริ่มต้นจะเสร็จสมบูรณ์ผ่านหนึ่งในสามเส้นทาง ได้แก่ การถ่าย โอนนิวเคลียสการหลอมรวมเซลล์หรือปัจจัยที่กำหนด ( ไมโครอาร์เอ็นเอ ปัจจัยการถอดรหัส เครื่องหมายเอพิเจเนติก และโมเลกุลขนาดเล็กอื่นๆ) ^{[ 32 ] [ 37 ]}

โอโอไซต์สามารถตั้งโปรแกรมนิวเคลียสของผู้ใหญ่ใหม่ให้กลับไปเป็นสภาวะตัวอ่อนได้หลังจากการถ่ายโอนนิวเคลียสของเซลล์ร่างกายเพื่อให้สามารถพัฒนาสิ่งมีชีวิตใหม่จากเซลล์ดังกล่าวได้^{[ 38 ]}

การตั้งโปรแกรมใหม่นั้นแตกต่างจากการพัฒนาเอพิไทป์โซมาติก [ ^{39 ]}เนื่องจากเอพิไทป์โซมาติกอาจเปลี่ยนแปลงได้หลังจากที่สิ่งมีชีวิตพ้นระยะพัฒนาการของชีวิตไปแล้ว^{[ 40 ]} ในระหว่างการถ่ายโอนนิวเคลียสของเซลล์โซมาติก โอโอไซต์จะปิดยีนเฉพาะเนื้อเยื่อในนิวเคลียสของเซลล์โซมาติกและเปิดยีนเฉพาะตัวอ่อนอีกครั้ง กระบวนการนี้ได้รับการแสดงให้เห็นผ่านการโคลนนิ่ง ดังที่เห็นได้จาก^จอห์น เกอร์ดอนกับลูกอ๊อด^{[ 29 ]}และแกะดอลลี่ [ ^{41 ] ที่}น่าสังเกตคือ เหตุการณ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าชะตากรรมของเซลล์เป็นกระบวนการที่ย้อนกลับได้

^{[ 37 ]}การรวมเซลล์ใช้เพื่อสร้างเซลล์ที่มีนิวเคลียสหลายอันเรียกว่าเฮเทอโรคาริออน[ ^{37 ] เซลล์}ที่รวมกันทำให้ยีนที่ถูกปิดการทำงานสามารถกลับมาทำงานและแสดงออกได้ เมื่อยีนกลับมาทำงาน เซลล์ก็สามารถเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ชนิดอื่นได้อีกครั้ง มีบางกรณีที่ปัจจัยการถอดรหัส เช่น ปัจจัยยามานากะ ยังคงจำเป็นเพื่อช่วยในการปรับเปลี่ยนโปรแกรมของเซลล์เฮเทอโรคาริออน ^{[ 42 ]}

แตกต่างจากการถ่ายโอนนิวเคลียร์และการหลอมรวมเซลล์ ปัจจัยที่กำหนดไม่จำเป็นต้องใช้จีโนมทั้งหมด แต่ต้องการเพียงปัจจัยการสร้างโปรแกรมใหม่เท่านั้น ปัจจัยการสร้างโปรแกรมใหม่เหล่านี้รวมถึงไมโครอาร์เอ็นเอ ปัจจัยการถอดรหัส เครื่องหมายเอพิเจเนติก และโมเลกุลขนาดเล็กอื่นๆ^{[ 37 ]}ปัจจัยการถอดรหัสเดิมที่นำไปสู่การพัฒนา iPSC ซึ่งค้นพบโดย Yamanaka ได้แก่Oct4 , Sox2 , Klf4และc-Myc (ปัจจัย OSKM) ^{[ 31 ] [ 34 ]}แม้ว่าปัจจัย OSKM จะแสดงให้เห็นว่าสามารถกระตุ้นและช่วยในการเกิดพหุศักยภาพได้ แต่ปัจจัยการถอดรหัสอื่นๆ เช่นโปรตีน Homeobox NANOG [ ^{43 ] LIN25} [ ^{32 ] TRA} -1-60 ^{[ 43 ]}และ C/EBPα ^{[ 44 ]}ก็ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของการสร้างโปรแกรมใหม่ การใช้ไมโครอาร์เอ็นเอและกระบวนการที่ขับเคลื่อนด้วยโมเลกุลขนาดเล็กอื่นๆ ได้ถูกนำมาใช้เป็นวิธีการเพิ่มประสิทธิภาพของการแยกความแตกต่างจากเซลล์ร่างกายไปสู่พหุศักยภาพ^{[ 37 ]}

ระยะการเจริญเติบโตเริ่มต้นเมื่อสิ้นสุดระยะเริ่มต้น เมื่อยีนพหุศักยภาพแรกถูกแสดงออก^{[ 35 ]}เซลล์กำลังเตรียมตัวให้เป็นอิสระจากปัจจัยที่กำหนดไว้ ซึ่งเริ่มต้นกระบวนการรีโปรแกรม ยีนแรกที่ตรวจพบใน iPSC คือOct4 โปรตีนโฮมีโอโบกซ์ NANOGและ Esrrb ตามมาด้วยSox2 ในภายหลัง ^[ 37 ^]ในระยะต่อมาของการเจริญเติบโต การปิดกั้น ทรานส์ยีนเป็นการเริ่มต้นที่เซลล์เป็นอิสระจากปัจจัยการถอดรหัส ที่ ^ถูก เหนี่ยวนำ เมื่อเซลล์เป็นอิสระแล้ว ระยะการเจริญเติบโตจะสิ้นสุดลงและระยะการทำให้เสถียรจะเริ่มต้นขึ้น

เนื่องจากประสิทธิภาพการรีโปรแกรมได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นกระบวนการที่แปรผันและมีประสิทธิภาพต่ำ เซลล์บางส่วนจึงไม่สามารถผ่านขั้นตอนการเจริญเติบโตและบรรลุความสามารถในการสร้าง เซลล์หลายชนิด ได้^{[ 44 ]}เซลล์บางส่วนที่ผ่านกระบวนการรีโปรแกรมยังคงอยู่ภายใต้ภาวะอะพอพโทซิสในช่วงเริ่มต้นของขั้นตอนการเจริญเติบโตเนื่องจากความเครียดจากออกซิเดชันที่เกิดจากความเครียดของการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีน การใช้ไมโครอาร์เอ็นเอ โปรตีน และการผสมผสานที่แตกต่างกันของปัจจัย OSKM เริ่มนำไปสู่อัตราประสิทธิภาพการรีโปรแกรมที่สูงขึ้น

ระยะการทำให้เสถียรหมายถึงกระบวนการในเซลล์ที่เกิดขึ้นหลังจากเซลล์บรรลุภาวะพหุศักยภาพเครื่องหมายทางพันธุกรรมอย่างหนึ่งคือการแสดงออกของSox2และการเปิดใช้งานโครโมโซม X อีก ครั้ง ในขณะที่การเปลี่ยนแปลงทางเอพิเจเนติกส์รวมถึงเทโลเมอเรสที่ขยายเทโลเมียร์^{[ 32 ]}และการสูญเสียความทรงจำทางเอพิเจเนติกส์ของเซลล์^{[ 35 ]}ความทรงจำทางเอพิเจเนติกส์ของเซลล์จะถูกรีเซ็ตโดยการเปลี่ยนแปลงในการเมทิลเลชั่นของ DNA ^{[ 45 ]}โดยใช้เอนไซม์ไซทิดีนดีอะมีเนสที่เหนี่ยวนำโดยการกระตุ้น (AID) เอนไซม์ TET (TET) และDNA เมทิลทรานสเฟอเรส (DMNTs) เริ่มต้นในระยะการเจริญเติบโตและเข้าสู่ระยะการทำให้เสถียร^{[ 35 ]}เมื่อความทรงจำทางเอพิเจเนติกส์ของเซลล์หายไป ความเป็นไปได้ของการแยกแยะไปเป็นชั้นเนื้อเยื่อต้นกำเนิดทั้งสามชั้นก็จะเกิดขึ้น^{[ 34 ]}เซลล์นี้ถือว่าเป็นเซลล์ที่ได้รับการตั้งโปรแกรมใหม่อย่างสมบูรณ์ เนื่องจากสามารถส่งต่อได้โดยไม่กลับไปเป็นเซลล์ร่างกายชนิดเดิม^{[ 37 ]}

การสร้างเซลล์ต้น กำเนิดใหม่สามารถกระตุ้นได้โดยวิธีการประดิษฐ์ผ่านการนำปัจจัยภายนอกเข้ามา ซึ่งโดยปกติจะเป็นปัจจัยการถอดรหัสในบริบทนี้ มักหมายถึงการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดแบบเหนี่ยวนำจากเซลล์ที่เจริญเต็มที่ เช่นไฟโบรบลาสต์ใน ผู้ใหญ่ วิธีนี้ช่วยให้สามารถผลิตเซลล์ต้นกำเนิดสำหรับการวิจัยทางการแพทย์เช่น การวิจัยเกี่ยวกับการบำบัดด้วยเซลล์ต้นกำเนิดโดยไม่ต้องใช้ตัวอ่อน โดยดำเนินการโดยการถ่ายทอดยีนที่เกี่ยวข้องกับเซลล์ต้นกำเนิดเข้าไปในเซลล์ที่เจริญเต็มที่โดยใช้เวกเตอร์ไวรัสเช่นเรโทรไวรัส

หนึ่งในปัจจัยที่เปลี่ยนแปลงเซลล์กลุ่มแรกๆ ที่ถูกค้นพบคือ ปัจจัยที่เปลี่ยนแปลงเซลล์ในไมโอบลาสต์ โดย การแสดงออกของ ดีเอ็นเอเสริม (cDNA) ที่เข้ารหัสMyoDจะเปลี่ยนไฟโบรบลาสต์ ให้กลาย เป็นไมโอบลาสต์ ปัจจัยที่เปลี่ยนแปลงเซลล์อีกตัวหนึ่งที่เปลี่ยนเซลล์น้ำเหลือง ให้กลาย เป็นเซลล์ไมอีลอยด์ โดยตรง คือ C/EBPα MyoD และ C/EBPα เป็นเพียงตัวอย่างของปัจจัยเดี่ยวๆ จำนวนน้อยที่สามารถเปลี่ยนแปลงเซลล์ได้ บ่อยครั้งที่ปัจจัยการถอดรหัสหลายตัวทำงานร่วมกันเพื่อปรับเปลี่ยนโปรแกรมของเซลล์

ปัจจัย OSKM ( Oct4 , Sox2 , Klf4และc-Myc ) ถูกค้นพบครั้งแรกโดย Yamanaka ในปี 2549 โดยการเหนี่ยวนำไฟโบรบลาสต์ของหนูให้กลายเป็นเซลล์ต้นกำเนิดที่มีศักยภาพหลายอย่าง (iPSCs) ^{[ 31 ]}ภายในปีถัดมา ปัจจัยเหล่านี้ถูกนำมาใช้เพื่อเหนี่ยวนำไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ให้กลายเป็น iPSCs ^{[ 34 ]}

Oct4เป็นส่วนหนึ่งของยีนควบคุมหลักที่จำเป็นสำหรับความสามารถในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ชนิดต่างๆ ดังที่พบได้ทั้งในเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนและเนื้องอก^{[ 46 ]}การใช้ Oct4 แม้เพียงเล็กน้อยก็ช่วยให้เริ่มการแยกตัวเป็นเซลล์ชนิดต่างๆ ได้ Oct4 ทำงานร่วมกับ Sox2 เพื่อการแสดงออกของFGF4ซึ่งอาจช่วยในการแยกตัว

Sox2เป็นยีนที่ใช้ในการรักษาความสามารถในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ชนิดต่างๆ ในเซลล์ต้นกำเนิด Oct4 และ Sox2 ทำงานร่วมกันเพื่อควบคุมยีนหลายร้อยยีนที่ใช้ในความสามารถในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ชนิดต่างๆ^{[ 46 ]}อย่างไรก็ตาม Sox2 ไม่ใช่สมาชิกในตระกูล Sox เพียงตัวเดียวที่อาจมีส่วนร่วมในการควบคุมยีนร่วมกับ Oct4 –  Sox4 , Sox11และSox15 ก็มีส่วนร่วมด้วยเช่น กัน เนื่องจากโปรตีน Sox มีความซ้ำซ้อนตลอดทั้งจีโนม ของเซลล์ต้นกำเนิด

Klf4เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่ใช้ในการเพิ่มจำนวนการแบ่งแยกการตาย ของเซลล์ และ การปรับเปลี่ยนโปรแกรม ของเซลล์ร่างกายเมื่อถูกนำไปใช้ในการปรับเปลี่ยนโปรแกรมของเซลล์ Klf4 จะป้องกันการแบ่งเซลล์ของเซลล์ที่เสียหายโดยใช้ความสามารถในการทำให้เกิดการตายของเซลล์ และช่วยในกิจกรรมของเอนไซม์ฮิสโตนอะเซทิลทรานสเฟอเรส^{[ 34 ]}

c-Mycยังเป็นที่รู้จักในฐานะออนโคยีนและในบางสภาวะอาจก่อให้เกิดมะเร็งได้^{[ 47 ]}ในการปรับโปรแกรมเซลล์ c-Myc ถูกใช้เพื่อความก้าวหน้าของวงจรเซลล์อะพอพโทซิสและการเปลี่ยนแปลงของเซลล์เพื่อการแยกความแตกต่างเพิ่มเติม เนื่องจาก คุณสมบัติ ออนโคยีนของ c-Myc หลักฐานบ่งชี้ว่าการแสดงออกเฉพาะ Oct4, Sox2 และ Klf4 (OSK) และการรวมเข้ากับการบำบัดยีนTERT เป็นวิธีการที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพมากกว่าสำหรับ การปรับโปรแกรม ในร่างกายเพื่อชะลอความแก่^{[ 48 ]}

โปรตีนโฮมีโอโบกซ์ NANOG (NANOG) เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่ใช้เพื่อช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการสร้าง iPSC โดยการรักษา ความสามารถ ในการเป็นพหุศักยภาพ^{[ 49 ]}และยับยั้งปัจจัยการกำหนดเซลล์^{[ 50 ]} NANOG ทำงานโดยการส่งเสริมการ เข้าถึง โครมาตินผ่านการยับยั้ง เครื่องหมาย ฮิสโตนเช่นH3K27me3 NANOG ช่วยในการดึงดูดOct4 , Sox2และ Esrrb ที่ใช้ในการถอดรหัสในขณะเดียวกันก็ดึงดูดยีนที่เกี่ยวข้องกับ Brahma-1 (BRG1) เพื่อการเข้าถึง โครมาติน

CEBPAเป็นปัจจัยที่ใช้กันทั่วไปในการปรับเปลี่ยนโปรแกรมเซลล์ ไม่เพียงแต่ให้เป็น iPSC เท่านั้น แต่ยังรวมถึงเซลล์อื่นๆ ด้วย C/EBPα แสดงให้เห็นว่าเป็นปัจจัยทรานส์แอคทีฟเดี่ยวในระหว่างการปรับเปลี่ยนโปรแกรมเซลล์ลิมโฟไซต์โดยตรงให้เป็นเซลล์ไมอีลอยด์^{[ 44 ]} C/EBPα ถือเป็น 'ผู้บุกเบิก' เพื่อช่วยเตรียมเซลล์สำหรับการรับปัจจัย OSKM และเหตุการณ์การถอดรหัสเฉพาะ^{[ 43 ]}นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่า C/EBPα ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของเหตุการณ์การปรับเปลี่ยนโปรแกรม^{[ 35 ]}

คุณสมบัติของเซลล์ที่ได้รับหลังจากการรีโปรแกรมอาจแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกลุ่ม iPSC ^{[ 51 ]} ปัจจัยที่นำไปสู่ความแปรปรวนในประสิทธิภาพของการรีโปรแกรมและคุณสมบัติการทำงานของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย ได้แก่ พื้นฐานทางพันธุกรรม แหล่งที่มาของเนื้อเยื่อ สัดส่วนของปัจจัยการรีโปรแกรม และความเครียดที่เกี่ยวข้องกับการเพาะเลี้ยงเซลล์^{[ 51 ]}

• เซลล์ต้นกำเนิดที่ถูกเหนี่ยวนำ
• การแก้ไขเอพิเจโนม