การแทรกแซงของอาร์เอ็นเอ ( RNA interference หรือ RNAi ) เป็นกระบวนการทางชีวภาพที่ โมเลกุล อาร์เอ็นเอมีส่วนเกี่ยวข้องในการยับยั้งการแสดงออกของยีน อย่างจำเพาะเจาะจง โดยใช้อาร์เอ็นเอแบบสองสายผ่านการยับยั้งการแปลหรือการถอดรหัส ในอดีต RNAi เป็นที่รู้จักกันในชื่ออื่นๆ เช่นการยับยั้งร่วม (co-suppression) การปิดการทำงานของยีนหลังการถอดรหัส ( post-transcriptional gene silencingหรือ PTGS) และการดับ (quelling ) การศึกษาอย่างละเอียดของกระบวนการที่ดูเหมือนแตกต่างกันเหล่านี้ได้ชี้ให้เห็นว่าแท้จริงแล้วปรากฏการณ์เหล่านี้คือ RNAi แอนดรูว์ ไฟร์และเครก เมลโล ได้รับ รางวัลโนเบลสาขาสรีรวิทยาหรือการแพทย์ประจำปี 2006 จากผล งานวิจัยเกี่ยวกับ RNAi ในหนอนตัวกลมCaenorhabditis elegansซึ่งตีพิมพ์ในปี 1998 นับตั้งแต่การค้นพบ RNAi และศักยภาพในการควบคุมของมัน ก็เป็นที่ชัดเจนว่า RNAi มีศักยภาพมหาศาลในการยับยั้งยีนที่ต้องการ ปัจจุบัน RNAi เป็นที่รู้จักกันดีว่ามีความแม่นยำ มีประสิทธิภาพ เสถียร และดีกว่าการบำบัดด้วยแอนติเซนส์ (antisense therapy)ในการยับยั้งยีน^{[ 1 ]} RNA แอนติเซนส์ที่ผลิตภายในเซลล์โดยเวกเตอร์การแสดงออกอาจได้รับการพัฒนาและนำไปใช้ประโยชน์ในฐานะตัวแทนการรักษาแบบใหม่^{[ 2 ]}

โมเลกุล กรดไรโบนิวคลีอิก (RNA) ขนาดเล็กสองชนิด ได้แก่ ไมโครอาร์เอ็นเอ (miRNA) และอาร์เอ็นเอแทรกแซงขนาดเล็ก (siRNA) เป็นองค์ประกอบสำคัญในวิถีการทำงานของ RNAi เมื่อ mRNA ถูกย่อยสลาย การยับยั้งหลังการถอดรหัสจะเกิดขึ้นเนื่องจากการสังเคราะห์โปรตีนถูกป้องกัน การถอดรหัสสามารถถูกยับยั้งได้ผ่านกลไกการยับยั้งก่อนการถอดรหัสของ RNAi ซึ่งเอนไซม์เชิงซ้อนจะเร่งปฏิกิริยาการเติมหมู่เมทิลลงในดีเอ็นเอในตำแหน่งจีโนมที่เข้าคู่กับ siRNA หรือ miRNA ที่จับกันอยู่ RNAi มีบทบาทสำคัญในการปกป้องเซลล์จาก ลำดับ นิวคลีโอ ไทด์ที่เป็นปรสิต (เช่นไวรัสหรือทรานสโพซอน ) และยังมีอิทธิพลต่อการพัฒนาของสิ่งมีชีวิตด้วย

วิถี RNAi เป็นกระบวนการที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติในยูคาริโอต หลายชนิด กระบวนการ นี้เริ่มต้นโดยเอนไซม์Dicerซึ่งตัดโมเลกุลRNA สองสาย ยาว (dsRNA) ออกเป็นชิ้นส่วน siRNA สองสายสั้นๆ ที่มีความยาวประมาณ 21 ถึง 23 นิ วคลีโอไทด์แต่ละ siRNA จะคลายตัวออกเป็น RNA สายเดี่ยวสองสาย (ssRNA) คือสายผู้โดยสาร (sense strand) และสายนำทาง (antisense strand) จากนั้นสายผู้โดยสารจะถูกตัดโดยโปรตีนArgonaute 2 (Ago2) สายผู้โดยสารจะถูกย่อยสลาย และสายนำทางจะถูกรวมเข้ากับคอมเพล็กซ์การยับยั้งด้วย RNA (RISC) จากนั้น RISC จะจับและย่อยสลาย mRNA เป้าหมาย โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กระบวนการนี้จะเกิดขึ้นเมื่อสายนำทางจับคู่กับลำดับที่เสริมกันในโมเลกุล mRNA และกระตุ้นการตัดโดย Ago2 ซึ่งเป็นส่วนประกอบเร่งปฏิกิริยาของ RISC ในสิ่งมีชีวิตบางชนิด กระบวนการนี้จะแพร่กระจายไปทั่วระบบ แม้ว่าความเข้มข้นโมลาร์ของ siRNA ในตอนแรกจะมีจำกัดก็ตาม^{[ 3 ]}

RNAi เป็นเครื่องมือวิจัยที่มีคุณค่าทั้งในเซลล์เพาะเลี้ยงและในสิ่งมีชีวิตเนื่องจาก dsRNA สังเคราะห์ที่นำเข้าสู่เซลล์สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดการยับยั้งยีนที่สนใจได้อย่างเลือกสรรและมีประสิทธิภาพ RNAi อาจใช้สำหรับการคัดกรองขนาดใหญ่ที่ปิดการทำงานของแต่ละยีน (และโปรตีนที่ยีนนั้นสร้างขึ้น) ในเซลล์อย่างเป็นระบบ ซึ่งสามารถช่วยระบุส่วนประกอบที่จำเป็นสำหรับกระบวนการของเซลล์หรือเหตุการณ์เฉพาะ เช่นการแบ่งเซลล์เส้นทางนี้ยังใช้เป็นเครื่องมือที่ใช้งานได้จริงสำหรับอาหารยาและ ยา ฆ่าแมลง^{[ 4 ]}

RNAi เป็นกระบวนการ ปิดการทำงานของยีนที่ขึ้นอยู่กับ RNA ซึ่งถูกควบคุมโดยRISCและเริ่มต้นโดยโมเลกุล RNA สองสายสั้นๆ ในไซโตพลาสซึมของเซลล์ ซึ่งจะทำปฏิกิริยากับส่วนประกอบเร่งปฏิกิริยาของ RISC คือArgonaute ^{[ 6 ]}เมื่อ dsRNA เป็น dsRNA ภายนอก (มาจากการติดเชื้อไวรัสที่มีจีโนม RNA หรือการจัดการในห้องปฏิบัติการ) RNA จะถูกนำเข้าสู่ไซโตพลาสซึม โดยตรง และถูกตัดเป็นชิ้นส่วนสั้นๆ โดย Dicer dsRNA ที่เริ่มต้นอาจเป็น dsRNA ภายใน (มีต้นกำเนิดในเซลล์) เช่น pre-microRNA ที่แสดงออกจากยีนที่เข้ารหัส RNAในจีโนม สารถอดรหัสหลักจากยีนดังกล่าวจะถูกประมวลผลก่อนเพื่อสร้าง โครงสร้าง ก้านห่วง ลักษณะเฉพาะ ของ pre-miRNA ในนิวเคลียสจากนั้นจึงส่งออกไปยังไซโตพลาสซึม ดังนั้น เส้นทาง dsRNA สองเส้นทาง คือ ภายนอกและภายใน จึงมาบรรจบกันที่ RISC ^{[ 7 ]}

dsRNA จากภายนอกเริ่มต้น RNAi โดยการกระตุ้น โปรตีน ไรโบเอนไซม์ Dicer ^{[ 8 ]}ซึ่งจับและตัด dsRNA ในพืช หรือ short hairpin RNA (shRNA) ในมนุษย์ เพื่อสร้างชิ้นส่วนสองสายที่มีความยาว 20–25 คู่เบสโดยมีส่วนยื่น 2 นิวคลีโอไทด์ที่ปลาย 3′ ^{[ 9 ]} การศึกษา ทางชีวสารสนเทศเกี่ยวกับจีโนมของสิ่งมีชีวิตหลายชนิดชี้ให้เห็นว่าความยาวนี้จะเพิ่มความจำเพาะของยีนเป้าหมายให้สูงสุดและลดผลกระทบที่ไม่จำเพาะให้น้อยที่สุด^{[ 10 ]}ชิ้นส่วนสองสายสั้นๆ เหล่านี้เรียกว่าsiRNAจากนั้น siRNA เหล่านี้จะถูกแยกออกเป็นสายเดี่ยวและรวมเข้ากับ RISC ที่ทำงานอยู่โดย RISC-Loading Complex (RLC) RLC ประกอบด้วย Dicer-2 และ R2D2 และมีความสำคัญอย่างยิ่งในการรวม Ago2 และ RISC เข้าด้วยกัน^{[ 11 ]}ปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับโปรตีนที่จับกับ TATA 11 (TAF11) ประกอบ RLC โดยอำนวยความสะดวกในการเกิดเทตราเมอไรเซชันของ Dcr-2-R2D2 ซึ่งเพิ่มความสัมพันธ์ในการจับกับ siRNA ขึ้น 10 เท่า การเชื่อมโยงกับ TAF11 จะเปลี่ยนคอมเพล็กซ์ R2-D2-Initiator (RDI) ให้เป็น RLC ^{[ 12 ]} R2D2 มีโดเมนจับ RNA สองสายแบบเรียงต่อกันเพื่อจดจำปลายที่เสถียรทางอุณหพลศาสตร์ของ siRNA duplexes ในขณะที่ Dicer-2 จดจำปลายอีกด้านที่ไม่เสถียร การโหลดไม่สมมาตร: โดเมน MID ของ Ago2 จดจำปลายที่เสถียรทางอุณหพลศาสตร์ของ siRNA ดังนั้น สาย "ผู้โดยสาร" (sense) ที่ปลาย 5′ ถูกทิ้งโดย MID จะถูกขับออกไป ในขณะที่สาย "ไกด์" (antisense) ที่เก็บไว้จะทำงานร่วมกับ AGO เพื่อสร้าง RISC ^{[ 11 ]}

หลังจากรวมเข้ากับ RISC แล้ว siRNA จะจับคู่เบสกับ mRNA เป้าหมายและตัดมัน ทำให้ไม่สามารถนำไปใช้เป็นแม่แบบการแปลได้^{[ 13 ]}แตกต่างจาก siRNA คอมเพล็กซ์ RISC ที่บรรจุ miRNA จะสแกน mRNA ในไซโตพลาสซึมเพื่อหาความสมบูรณ์แบบที่เป็นไปได้ แทนที่จะตัดทำลาย (โดย Ago2) miRNA จะกำหนดเป้าหมายไปที่บริเวณ 3′ untranslated region (UTR) ของ mRNA ซึ่งโดยทั่วไปจะจับกันด้วยความสมบูรณ์แบบที่ไม่สมบูรณ์ จึงปิดกั้นการเข้าถึงของไรโบโซมสำหรับการแปล^{[ 14 ]}

dsRNA ภายนอกจะถูกตรวจจับและจับโดยโปรตีนตัวกระตุ้น ซึ่งรู้จักกันในชื่อ RDE-4 ในC. elegansและ R2D2 ในDrosophilaซึ่งกระตุ้นการทำงานของ Dicer ^{[ 15 ]}กลไกที่ทำให้เกิดความจำเพาะของความยาวนี้ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด และโปรตีนนี้จะจับเฉพาะ dsRNA ที่ยาวเท่านั้น^{[ 15 ]}

ในC. elegansการตอบสนองการเริ่มต้นนี้จะถูกขยายผ่านการสังเคราะห์ประชากรของ siRNA 'รอง' ซึ่ง siRNA เริ่มต้นหรือ 'หลัก' ที่ผลิตโดย Dicer จะถูกใช้เป็นแม่แบบ^{[ 16 ]} siRNA 'รอง' เหล่านี้มีโครงสร้างที่แตกต่างจาก siRNA ที่ผลิตโดย Dicer และดูเหมือนว่าจะถูกผลิตโดยRNA-dependent RNA polymerase (RdRP) ^{[ 17 ]}

ไมโครอาร์เอ็นเอ (miRNAs) เป็นอาร์เอ็นเอที่ไม่เข้ารหัส ซึ่ง ถูกเข้ารหัสในจีโน ม และช่วยควบคุมการแสดงออกของยีนโดยเฉพาะอย่างยิ่งในระหว่างการพัฒนา^{[ 18 ]}ปรากฏการณ์ของ RNAi ซึ่งนิยามอย่างกว้างๆ นั้นรวมถึงผลกระทบของการปิดกั้นยีนที่เกิดขึ้นเองภายในของ miRNAs เช่นเดียวกับการปิดกั้นที่ถูกกระตุ้นโดย dsRNA จากภายนอก miRNAs ที่เจริญเต็มที่นั้นมีโครงสร้างคล้ายกับsiRNAsที่ผลิตจาก dsRNA ภายนอก แต่ก่อนที่จะเจริญเต็มที่ miRNAs จะต้องผ่านการดัดแปลงหลังการถอดรหัส อย่างกว้างขวางก่อน miRNA จะถูกแสดงออกมาจากยีนที่เข้ารหัส RNA ที่ยาวกว่ามากในรูปของทรานสคริปต์หลักที่เรียกว่าpri-miRNAซึ่งจะถูกประมวลผลในนิวเคลียสของเซลล์ ให้เป็น โครงสร้างก้านห่วง 70 นิวคลีโอไทด์ ที่เรียกว่า pre-miRNAโดยคอมเพล็กซ์ไมโครโปรเซสเซอร์คอมเพล็กซ์นี้ประกอบด้วย เอนไซม์ RNase IIIที่เรียกว่าDroshaและโปรตีนที่จับกับ dsRNA ชื่อDGCR8ส่วน dsRNA ของ pre-miRNA นี้จะถูกจับและตัดโดย Dicer เพื่อสร้างโมเลกุล miRNA ที่สมบูรณ์ซึ่งสามารถรวมเข้ากับคอมเพล็กซ์ RISC ได้ ดังนั้น miRNA และ siRNA จึงใช้กลไกเซลล์ปลายทางเดียวกัน^{[ 19 ]}ในตอนแรก miRNA ที่เข้ารหัสโดยไวรัสได้รับการอธิบายในไวรัส Epstein–Barr (EBV) ^{[ 20 ]}หลังจากนั้น มีการอธิบาย microRNA ในไวรัสเพิ่มมากขึ้น VIRmiRNA เป็นแคตตาล็อกที่ครอบคลุม microRNA ของไวรัส เป้าหมาย และ miRNA ต้านไวรัส^{[ 21 ]} (ดูแหล่งข้อมูล VIRmiRNA เพิ่มเติมได้ที่: http://crdd.osdd.net/servers/virmirna/)

siRNA ที่ได้มาจากสารตั้งต้น dsRNA ยาวนั้นแตกต่างจาก miRNA ตรงที่ miRNA โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสัตว์ มักจะมีการจับคู่เบสที่ไม่สมบูรณ์กับเป้าหมายและยับยั้งการแปล mRNA ที่แตกต่างกันหลายชนิดที่มีลำดับคล้ายกัน ในทางตรงกันข้าม siRNA มักจะจับคู่เบสได้อย่างสมบูรณ์แบบและกระตุ้นการตัด mRNA เฉพาะในเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงเพียงเป้าหมายเดียวเท่านั้น^{[ 22 ]}ในDrosophilaและC. elegans miRNA และ siRNA จะถูกประมวลผลโดยโปรตีน Argonaute และเอนไซม์ Dicer ที่แตกต่างกัน^{[ 23 ] [ 24 ]}

บริเวณที่ไม่ถูกแปลรหัสสามส่วนหลัก (3′UTR) ของmRNAมักมีลำดับควบคุมที่ทำให้เกิด RNAi หลังการถอดรหัส บริเวณ 3′-UTR เหล่านี้มักมีทั้งตำแหน่งการจับของmiRNAและโปรตีนควบคุม โดยการจับกับตำแหน่งเฉพาะภายใน 3′-UTR miRNA สามารถลดการแสดงออกของยีนของ mRNA ต่างๆ ได้โดยการยับยั้งการแปลรหัสหรือทำให้เกิดการสลายตัวของทรานสคริปต์โดยตรง นอกจากนี้ 3′-UTR อาจมีบริเวณตัวยับยั้งที่จับกับโปรตีนยับยั้งซึ่งยับยั้งการแสดงออกของ mRNA

บริเวณ 3′-UTR มักมีองค์ประกอบตอบสนองต่อไมโครอาร์เอ็นเอ (MREs) MREs คือลำดับเบสที่ไมโครอาร์เอ็นเอจะจับกับ ซึ่งเป็นลวดลายที่พบได้ทั่วไปในบริเวณ 3′-UTR ในบรรดาลวดลายควบคุมทั้งหมดในบริเวณ 3′-UTR (เช่น บริเวณยับยั้งการแสดงออกของยีน) MREs คิดเป็นประมาณครึ่งหนึ่งของลวดลายทั้งหมด

ณ ปี 2023 เว็บไซต์miRBase ^{[ 25 ]}ซึ่งเป็นคลังข้อมูลลำดับ และคำอธิบายประกอบของ miRNA ได้แสดงรายการ 28,645 รายการใน 271 สปีชีส์ทางชีวภาพ ในจำนวนนี้ miRNA จำนวน 1,917 รายการอยู่ในตำแหน่ง miRNA ของมนุษย์ที่ได้รับการอธิบายไว้ มีการคาดการณ์ว่า miRNA จะมีmRNA เป้าหมายโดยเฉลี่ยประมาณสี่ร้อยรายการ (ส่งผลต่อการแสดงออกของยีนหลายร้อยยีน) ^{[ 26 ]} Friedman et al. ^{[ 26 ]}ประมาณการว่าตำแหน่งเป้าหมายของ miRNA มากกว่า 45,000 ตำแหน่งภายใน 3′UTR ของ mRNA ของมนุษย์ได้รับการอนุรักษ์ไว้เหนือระดับพื้นหลัง และยีนที่เข้ารหัสโปรตีนของมนุษย์มากกว่า 60% อยู่ภายใต้แรงกดดันในการคัดเลือกเพื่อรักษาการจับคู่กับ miRNA

การทดลองโดยตรงแสดงให้เห็นว่า miRNA เพียงตัวเดียวสามารถลดความเสถียรของ mRNA ที่ไม่ซ้ำกันหลายร้อยตัวได้^{[ 27 ]}การทดลองอื่นๆ แสดงให้เห็นว่า miRNA เพียงตัวเดียวอาจยับยั้งการผลิตโปรตีนได้หลายร้อยตัว แต่การยับยั้งนี้มักจะค่อนข้างอ่อน (น้อยกว่า 2 เท่า) ^{[ 28 ] [ 29 ]}

ผลกระทบของการควบคุมการแสดงออกของยีนโดย miRNA ที่ผิดปกติดูเหมือนจะมีความสำคัญในมะเร็ง^{[ 30 ]}ตัวอย่างเช่น ในมะเร็งทางเดินอาหาร มีการระบุ miRNA เก้าชนิด ที่มีการเปลี่ยนแปลง ทางเอพิเจเนติกส์และมีประสิทธิภาพในการลดการทำงานของเอนไซม์ซ่อมแซม DNA ^{[ 31 ]}

ผลกระทบของการควบคุมการแสดงออกของยีนที่ผิดปกติโดย miRNA ดูเหมือนจะมีความสำคัญในความผิดปกติทางจิตเวช เช่น โรคจิตเภท โรคอารมณ์สองขั้ว โรคซึมเศร้า โรคพาร์กินสัน โรคอัลไซเมอร์ และความผิดปกติในกลุ่มอาการออทิสติก^{[ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]}

dsRNA ภายนอกจะถูกตรวจจับและจับโดยโปรตีนตัวกระตุ้น ซึ่งรู้จักกันในชื่อ RDE-4 ในC. elegansและ R2D2 ในDrosophilaซึ่งกระตุ้นการทำงานของ Dicer ^{[ 15 ]}โปรตีนนี้จะจับเฉพาะ dsRNA ที่ยาวเท่านั้น แต่กลไกที่ทำให้เกิดความจำเพาะของความยาวนี้ยังไม่เป็นที่ทราบ^{[ 15 ]}จากนั้นโปรตีนที่จับกับ RNA นี้จะช่วยอำนวยความสะดวกในการถ่ายโอนsiRNA ที่ถูกตัด ไปยังคอมเพล็กซ์ RISC ^{[ 35 ]}

ในC. elegansการตอบสนองการเริ่มต้นนี้จะถูกขยายผ่านการสังเคราะห์ประชากรของ siRNA 'รอง' ซึ่ง siRNA เริ่มต้นหรือ 'หลัก' ที่ผลิตโดย Dicer จะถูกใช้เป็นแม่แบบ^{[ 16 ]} siRNA 'รอง' เหล่านี้มีโครงสร้างที่แตกต่างจาก siRNA ที่ผลิตโดย Dicer และดูเหมือนว่าจะถูกผลิตโดยRNA-dependent RNA polymerase (RdRP) ^{[ 17 ]}

ส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ของคอมเพล็กซ์การยับยั้งการทำงานของ RNA (RISC) คือเอนโดนิวคลีเอสที่เรียกว่าโปรตีน Argonaute ซึ่งจะตัดสาย mRNA เป้าหมายที่เสริมกับ siRNA ที่จับอยู่^{[ 6 ]}เนื่องจากชิ้นส่วนที่ผลิตโดย Dicer เป็นสายคู่ จึงสามารถสร้าง siRNA ที่ใช้งานได้ในทางทฤษฎี อย่างไรก็ตาม มีเพียงสายเดียวจากสองสายที่เรียกว่าสายนำทาง เท่านั้นที่ จับกับ Argonaute และควบคุมการยับยั้งการทำงานของยีน ส่วนสายต้านนำทางหรือสายผู้โดยสารจะถูกย่อยสลายในระหว่างการกระตุ้น RISC ^{[ 36 ]}แม้ว่าในตอนแรกจะเชื่อกันว่าเฮลิเคสที่ขึ้นอยู่กับATPเป็นตัวแยกสองสายนี้^{[ 37 ]}แต่กระบวนการนี้พิสูจน์แล้วว่าไม่ขึ้นอยู่กับ ATP และดำเนินการโดยส่วนประกอบโปรตีนของ RISC โดยตรง^{[ 3 ] [ 38 ]}อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์จลนศาสตร์ ในหลอดทดลองของ RNAi ในสภาวะที่มีและไม่มี ATP แสดงให้เห็นว่า ATP อาจจำเป็นสำหรับการคลายเกลียวและกำจัดสาย mRNA ที่ถูกตัดออกจากคอมเพล็กซ์ RISC หลังจากการเร่งปฏิกิริยา^{[ 39 ]}สายนำทางมักจะเป็นสายที่มีปลาย 5′จับคู่กับส่วนเติมเต็มได้ไม่เสถียรนัก^{[ 40 ]}แต่การเลือกสายจะไม่ได้รับผลกระทบจากทิศทางที่ Dicer ตัด dsRNA ก่อนการรวม RISC ^{[ 41 ]}ในทางกลับกัน โปรตีน R2D2 อาจทำหน้าที่เป็นปัจจัยที่ทำให้เกิดความแตกต่างโดยการจับกับปลาย 5′ ที่เสถียรกว่าของสายผู้โดยสาร^{[ 42 ]}

โครงสร้างพื้นฐานสำหรับการจับกันของ RNA กับโปรตีน Argonaute ได้รับการตรวจสอบโดยการใช้เทคนิคการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ของโดเมน การจับ ของ Argonaute ที่จับกับ RNA ในบริเวณนี้ ปลาย 5′ ที่ถูกฟอสฟอริเลตของสาย RNA จะเข้าไปในช่องพื้นผิวพื้นฐานที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ และสร้างการสัมผัสผ่านไอออนบวกสองประจุ (อะตอมที่มีประจุบวกสองประจุ) เช่นแมกนีเซียมและโดย การเรียงซ้อน แบบอะโรมาติก (กระบวนการที่ทำให้อะตอมมากกว่าหนึ่งอะตอมสามารถแบ่งปันอิเล็กตรอนโดยการส่งผ่านไปมา) ระหว่างนิวคลีโอไทด์ 5′ ใน siRNA กับ หมู่ ไทโรซีน ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ เชื่อกันว่าบริเวณนี้เป็นจุดเริ่มต้นสำหรับการจับกันของ siRNA กับเป้าหมาย mRNA ของมัน^{[ 43 ]}การวิเคราะห์ผลยับยั้งของการจับคู่ที่ไม่ตรงกันที่ปลาย 5' หรือ 3' ของสายนำทางแสดงให้เห็นว่าปลาย 5' ของสายนำทางน่าจะเป็นตัวที่รับผิดชอบในการจับคู่และจับกับ mRNA เป้าหมาย ในขณะที่ปลาย 3' รับผิดชอบในการจัดเรียง mRNA เป้าหมายทางกายภาพให้อยู่ในบริเวณ RISC ที่เอื้อต่อการตัด^{[ 39 ]}

ยังไม่เป็นที่เข้าใจว่าคอมเพล็กซ์ RISC ที่ถูกกระตุ้นจะค้นหา mRNA ที่เสริมกันภายในเซลล์ได้อย่างไร แม้ว่ากระบวนการตัดจะถูกเสนอให้เชื่อมโยงกับการแปลแต่การแปลเป้าหมาย mRNA นั้นไม่จำเป็นสำหรับการย่อยสลายที่เกิดจาก RNAi ^{[ 44 ]}อันที่จริง RNAi อาจมีประสิทธิภาพมากกว่าต่อเป้าหมาย mRNA ที่ไม่ได้รับการแปล^{[ 45 ]}โปรตีน Argonaute จะอยู่เฉพาะในบริเวณเฉพาะในไซโตพลาสซึมที่เรียกว่าP-bodies (หรือ cytoplasmic bodies หรือ GW bodies) ซึ่งเป็นบริเวณที่มีอัตราการสลายตัวของ mRNA สูง^{[ 46 ]}กิจกรรมของ miRNA ก็รวมกลุ่มกันอยู่ใน P-bodies เช่นกัน^{[ 47 ]}การรบกวน P-bodies จะลดประสิทธิภาพของ RNAi ซึ่งบ่งชี้ว่า P-bodies เป็นไซต์ที่สำคัญในกระบวนการ RNAi ^{[ 48 ]}

ส่วนประกอบของเส้นทาง RNAi ถูกนำมาใช้ในยูคาริโอตหลายชนิดในการรักษาการจัดระเบียบและโครงสร้างของ จีโน มการดัดแปลงฮิสโตนและการเหนี่ยวนำการก่อตัวของเฮเทอโรโครมา ติน ที่ เกี่ยวข้อง ทำหน้าที่ลดการแสดงออกของยีนก่อนการถอดรหัส^{[ 50 ]}กระบวนการนี้เรียกว่าการปิดกั้นการถอดรหัสที่เกิดจาก RNA (RITS) และดำเนินการโดยกลุ่มโปรตีนที่เรียกว่ากลุ่ม RITS ในยีสต์ฟิชชันกลุ่มนี้ประกอบด้วย Argonaute โปรตีน โครโมโดเมน Chp1 และโปรตีนที่เรียกว่า Tas3 ซึ่งมีหน้าที่ไม่เป็นที่รู้จัก^{[ 51 ]}ด้วยเหตุนี้ การเหนี่ยวนำและการแพร่กระจายของบริเวณเฮเทอโรโครมาตินจึงต้องอาศัยโปรตีน Argonaute และ RdRP ^{[ 52 ]}อันที่จริง การลบยีนเหล่านี้ในยีสต์ฟิชชันS. pombe ทำให้ การเมทิลเลชันของฮิสโตนและการก่อตัว ของเซนโทรเมีย ร์หยุด ชะงัก ^{[ 53 ]}ทำให้ระยะแอนาเฟส ช้าลงหรือหยุดชะงัก ระหว่างการแบ่งเซลล์^{[ 54 ]}ในบางกรณี พบว่ากระบวนการที่คล้ายคลึงกันซึ่งเกี่ยวข้องกับการดัดแปลงฮิสโตนสามารถกระตุ้นการถอดรหัสยีนได้^{[ 55 ]}

กลไกที่คอมเพล็กซ์ RITS ชักนำให้เกิดการก่อตัวและการจัดระเบียบของเฮเทอโรโครมาตินยังไม่เป็นที่เข้าใจดีนัก การศึกษาส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่บริเวณประเภทการผสมพันธุ์ในยีสต์ฟิชชัน ซึ่งอาจไม่เป็นตัวแทนของกิจกรรมในบริเวณจีโนม/สิ่งมีชีวิตอื่นๆ ในการบำรุงรักษาบริเวณเฮเทอโรโครมาตินที่มีอยู่ RITS จะสร้างคอมเพล็กซ์กับsiRNA ที่เสริมกับยีนในบริเวณนั้นและจับกับฮิสโตนที่ถูกเมทิลเลตในบริเวณนั้นอย่างมั่นคง โดยทำหน้าที่ร่วมกับการถอดรหัสเพื่อย่อยสลายทรานสคริปต์ pre-mRNA ที่เกิดขึ้นใหม่ซึ่งเริ่มต้นโดยRNA polymeraseการก่อตัวของบริเวณเฮเทอโรโครมาตินดังกล่าว แม้ว่าจะไม่ใช่การบำรุงรักษา ก็ขึ้นอยู่กับ Dicer ซึ่งสันนิษฐานได้ว่าเนื่องจาก Dicer จำเป็นต่อการสร้าง siRNA ชุดเริ่มต้นที่กำหนดเป้าหมายทรานสคริปต์ที่ตามมา^{[ 56 ]}การบำรุงรักษาเฮเทอโรโครมาตินได้รับการเสนอให้ทำงานเป็นวงจรป้อนกลับที่เสริมแรงตัวเอง เนื่องจาก siRNA ใหม่ถูกสร้างขึ้นจากทรานสคริปต์ที่เกิดขึ้นใหม่เป็นครั้งคราวโดย RdRP เพื่อรวมเข้ากับคอมเพล็กซ์ RITS ในบริเวณนั้น^{[ 57 ]}ความเกี่ยวข้องของการสังเกตจากบริเวณประเภทการผสมพันธุ์และเซนโทรเมียร์ของยีสต์ฟิชชันกับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมยังไม่ชัดเจน เนื่องจากการบำรุงรักษาเฮเทอโรโครมาตินในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอาจเป็นอิสระจากองค์ประกอบของเส้นทาง RNAi ^{[ 58 ]}

การแก้ไข RNAประเภทที่พบได้มากที่สุดในยูคาริโอตชั้นสูงจะเปลี่ยน นิวคลีโอไทด์ อะดีโนซีนเป็นอิโนซีนใน dsRNA ผ่านเอนไซม์อะดีโนซีนดีอะมีเนส (ADAR) ^{[ 59 ]}เดิมทีมีการเสนอในปี 2000 ว่าเส้นทางการแก้ไข RNAi และ A→I RNA อาจแข่งขันกันเพื่อใช้สารตั้งต้น dsRNA ร่วมกัน^{[ 60 ]} pre-miRNA บางส่วนมีการแก้ไข RNA แบบ A→I ^{[ 61 ] [ 62 ]}และกลไกนี้อาจควบคุมการประมวลผลและการแสดงออกของ miRNA ที่โตเต็มที่^{[ 62 ]}นอกจากนี้ ADAR ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอย่างน้อยหนึ่งชนิดสามารถกักเก็บsiRNAจากส่วนประกอบของเส้นทาง RNAi ได้^{[ 63 ]}การสนับสนุนเพิ่มเติมสำหรับแบบจำลองนี้มาจากการศึกษา สายพันธุ์ C. elegans ที่ไม่มี ADAR ซึ่งบ่งชี้ว่าการแก้ไข RNA แบบ A→I อาจต่อต้านการปิดกั้น RNAi ของยีนภายในและยีนที่ถูกถ่ายทอด^{[ 64 ]}

สิ่งมีชีวิตมีความสามารถในการรับ dsRNA จากภายนอกและนำไปใช้ในเส้นทาง RNAi แตกต่างกัน ผลของ RNAi อาจเป็นแบบทั่วระบบและถ่ายทอดทางพันธุกรรมได้ในพืชและC. elegansแม้ว่าจะไม่พบในDrosophilaหรือสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมก็ตาม ในพืช เชื่อกันว่า RNAi แพร่กระจายโดยการถ่ายโอนsiRNAระหว่างเซลล์ผ่านพลาสโมเดสมาตา (ช่องในผนังเซลล์ที่ช่วยให้การสื่อสารและการขนส่งเกิดขึ้นได้) ^{[ 37 ]}การถ่ายทอดทางพันธุกรรมมาจากการเมทิลเลชันของโปรโมเตอร์ที่ถูกกำหนดเป้าหมายโดย RNAi รูปแบบการเมทิลเลชันใหม่จะถูกคัดลอกในแต่ละรุ่นใหม่ของเซลล์^{[ 66 ]}ความแตกต่างโดยทั่วไประหว่างพืชและสัตว์อยู่ที่การกำหนดเป้าหมายของ miRNA ที่ผลิตขึ้นเองภายใน ในพืช miRNA มักจะสมบูรณ์หรือเกือบสมบูรณ์กับยีนเป้าหมายและกระตุ้นการตัด mRNA โดยตรงโดย RISC ในขณะที่ miRNA ของสัตว์มักจะมีลำดับที่แตกต่างกันมากขึ้นและกระตุ้นการยับยั้งการแปล^{[ 65 ]}ผลกระทบการแปลนี้อาจเกิดจากการยับยั้งการโต้ตอบของปัจจัยเริ่มต้น การแปลกับ หางโพลีอะดีนีนของmRNA ^{[ 67 ]}

โปรโตซัวยูคาริโอตบางชนิดเช่นLeishmania majorและTrypanosoma cruziขาดเส้นทาง RNAi โดยสิ้นเชิง^{[ 68 ] [ 69 ]}ส่วนประกอบส่วนใหญ่หรือทั้งหมดก็หายไปในเชื้อรา บางชนิด โดยเฉพาะอย่างยิ่งสิ่งมีชีวิตต้นแบบSaccharomyces cerevisiae [ ^{70 ] การ}มีอยู่ของ RNAi ในยีสต์ชนิดอื่นๆ เช่นSaccharomyces castelliiและCandida albicansแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่าการเหนี่ยวนำโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ RNAi สองชนิดจากS. castelliiช่วยอำนวยความสะดวกให้เกิด RNAi ในS. cerevisiae [ ^{71 ] การ} ที่แอสโค ไม ซีส และ เบซิ ดิโอไมซีสบางชนิดขาดเส้นทาง RNAi บ่งชี้ว่าโปรตีนที่จำเป็นสำหรับการปิดกั้น RNA ได้สูญหายไปโดยอิสระจากสายพันธุ์ เชื้อราหลายสายพันธุ์ อาจเนื่องมาจากวิวัฒนาการของเส้นทางใหม่ที่มีฟังก์ชันคล้ายกัน หรือเนื่องจากขาดความได้เปรียบเชิงเลือกในบางแหล่งที่อยู่^{[ 72 ]}

การแสดงออกของยีนในโปรคาริโอตได้รับอิทธิพลจากระบบที่ใช้ RNA ซึ่งคล้ายคลึงกับ RNAi ในบางแง่มุม โดยยีนที่เข้ารหัส RNA จะควบคุมปริมาณ mRNA หรือการแปลโดยการสร้าง RNA เสริมที่จับคู่กับ mRNA อย่างไรก็ตาม โดยทั่วไปแล้ว RNA ควบคุมเหล่านี้ไม่ถือว่าคล้ายคลึงกับ miRNA เนื่องจากเอนไซม์ Dicer ไม่เกี่ยวข้อง^{[ 73 ]}มีการเสนอแนะว่า ระบบ การรบกวน CRISPRในโปรคาริโอตนั้นคล้ายคลึงกับระบบ RNAi ของยูคาริโอต แม้ว่าจะไม่มีส่วนประกอบโปรตีนใดที่เป็นออร์โธล็อกัสก็ตาม^{[ 74 ]}

RNAi เป็นส่วนสำคัญของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อไวรัสและสารพันธุกรรม แปลกปลอมอื่นๆ โดยเฉพาะในพืช ซึ่งอาจป้องกันการแพร่กระจายของทรานสโพซอนได้^{[ 75 ]}พืชเช่นArabidopsis thaliana แสดงออกถึง โฮโมล็อกของ Dicer หลายตัวที่เชี่ยวชาญในการตอบสนองที่แตกต่างกันเมื่อพืชสัมผัสกับไวรัสชนิดต่างๆ^{[ 76 ]}แม้ก่อนที่เส้นทาง RNAi จะได้รับการเข้าใจอย่างถ่องแท้ ก็เป็นที่ทราบกันดีว่าการปิดกั้นยีนที่ถูกเหนี่ยวนำในพืชสามารถแพร่กระจายไปทั่วทั้งต้นในลักษณะที่เป็นระบบ และสามารถถ่ายทอดจากต้นตอไปยัง ต้น กิ่งผ่านการต่อกิ่งได้ [ ^{77 ] ปรากฏการณ์}นี้ได้รับการยอมรับว่าเป็นคุณลักษณะของระบบภูมิคุ้มกันของพืช ซึ่งช่วยให้พืชทั้งต้นตอบสนองต่อไวรัสได้หลังจากการเผชิญหน้าในเบื้องต้นเฉพาะที่^{[ 78 ]}เพื่อเป็นการตอบสนอง ไวรัสพืชหลายชนิดได้พัฒนากลไกที่ซับซ้อนเพื่อยับยั้งการตอบสนองของ RNAi ^{[ 79 ]}ซึ่งรวมถึงโปรตีนของไวรัสที่จับกับชิ้นส่วน RNA สองสายสั้นๆ ที่มีปลายยื่นเป็นสายเดี่ยว เช่น ชิ้นส่วนที่ผลิตโดย Dicer ^{[ 80 ]}จีโนมของพืชบางชนิดยังแสดงsiRNA ภายใน เพื่อตอบสนองต่อการติดเชื้อจากแบคทีเรีย บางชนิด [ ^{81 ]}ผลกระทบเหล่านี้อาจเป็นส่วนหนึ่งของการตอบสนองทั่วไปต่อเชื้อโรคที่ลดการทำงานของกระบวนการเผาผลาญใดๆ ในโฮสต์ที่ช่วยในกระบวนการติด^{เชื้อ[ 82 ]}

แม้ว่าโดยทั่วไปแล้วสัตว์จะแสดงเอนไซม์ Dicer ในรูปแบบต่างๆ น้อยกว่าพืช แต่ RNAi ในสัตว์บางชนิดก็สร้างการตอบสนองต่อไวรัสได้ ในแมลงหวี่ ทั้งวัยอ่อนและวัยผู้ใหญ่ RNAi มีความสำคัญในภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดต่อ ไวรัส และมีฤทธิ์ต่อต้านเชื้อโรค เช่นไวรัส Drosophila X ^{[ 83 ] [ 84 ]}บทบาทที่คล้ายกันในภูมิคุ้มกันอาจเกิดขึ้นในC. elegansเนื่องจากโปรตีน Argonaute ถูกควบคุมให้เพิ่มขึ้นเพื่อตอบสนองต่อไวรัส และหนอนที่แสดงออกมากเกินไปของส่วนประกอบของเส้นทาง RNAi จะต้านทานต่อการติดเชื้อไวรัสได้^{[ 85 ] [ 86 ]}

บทบาทของ RNAi ในภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ และมีข้อมูลค่อนข้างน้อย อย่างไรก็ตาม การมีอยู่ของไวรัสที่เข้ารหัสยีนที่สามารถยับยั้งการตอบสนองของ RNAi ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอาจเป็นหลักฐานสนับสนุนการตอบสนองภูมิคุ้มกันของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ขึ้นอยู่กับ RNAi ^{[ 87 ] [ 88 ]}แม้ว่าสมมติฐานนี้จะถูกท้าทายว่าไม่มีหลักฐานสนับสนุนที่ดี^{[ 89 ]} มีหลักฐานที่แสดงให้เห็นถึงการมีอยู่ของเส้นทาง RNAi ต้านไวรัสที่มีฟังก์ชันการทำงานในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม^{[ 90 ] [ 91 ]}

ฟังก์ชันอื่นๆ ของ RNAi ในไวรัสของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมยังมีอยู่ เช่น miRNA ที่แสดงออกโดยไวรัสเริมซึ่งอาจทำหน้าที่เป็น ตัวกระตุ้นการจัดระเบียบเฮเท อโรโครมาตินเพื่อควบคุมภาวะแฝงของไวรัส^{[ 92 ]}

ไมโครอาร์เอ็นเอที่แสดงออกภายในเซลล์ ซึ่งรวมถึงไมโครอาร์เอ็นเอ ทั้งใน ส่วนอินทรอนิกและอินเตอร์ จีนิก มีความสำคัญอย่างยิ่งในการยับยั้งการแปล ^{[ 65 ]}และในการควบคุมการพัฒนา โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเรื่องจังหวะเวลาของการสร้างรูปร่างและการรักษา สภาพเซลล์ ที่ไม่แตกต่างหรือแตกต่างไม่สมบูรณ์ เช่นเซลล์ต้นกำเนิด^{[ 93 ]}บทบาทของไมโครอาร์เอ็นเอที่แสดงออกภายในเซลล์ในการลดการแสดงออกของยีนได้รับการอธิบายครั้งแรกในC. elegansในปี 1993 ^{[ 94 ]}ในพืช ฟังก์ชันนี้ถูกค้นพบเมื่อพบว่า "ไมโครอาร์เอ็นเอ JAW" ของArabidopsisมีส่วนเกี่ยวข้องในการควบคุมยีนหลายตัวที่ควบคุมรูปร่างของพืช^{[ 95 ]}ในพืช ยีนส่วนใหญ่ที่ถูกควบคุมโดยไมโครอาร์เอ็นเอคือปัจจัยการถอดรหัส^{[ 96 ]}ดังนั้นกิจกรรมของไมโครอาร์เอ็นเอจึงกว้างขวางเป็นพิเศษและควบคุมเครือข่ายยีน ทั้งหมด ในระหว่างการพัฒนาโดยการปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีนควบคุมที่สำคัญ รวมถึงปัจจัยการถอดรหัสและโปรตีน F-boxด้วย^{[ 97 ]}ในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด รวมทั้งมนุษย์ ไมโครอาร์เอ็นเอมีความเชื่อมโยงกับการก่อตัวของเนื้องอกและการควบคุมวงจรเซลล์ ที่ผิดปกติ ในที่นี้ ไมโครอาร์เอ็นเอสามารถทำหน้าที่ได้ทั้งเป็นยีนก่อเนื้องอกและยีนยับยั้งเนื้องอก^{[ 98 ]}

จากการวิเคราะห์ทางวิวัฒนาการตามหลักความประหยัด บรรพบุรุษร่วมที่ใกล้ที่สุดของยูคาริโอต ทั้งหมด น่าจะมีวิถี RNAi ในระยะแรกอยู่แล้ว การไม่มีวิถีนี้ในยูคาริโอตบางชนิดถือเป็นลักษณะที่พัฒนาขึ้นมา^{[ 99 ]}ระบบ RNAi บรรพบุรุษนี้อาจประกอบด้วยโปรตีนที่คล้าย Dicer อย่างน้อยหนึ่งตัว, Argonaute หนึ่งตัว, โปรตีน PIWI หนึ่งตัว และRNA-dependent RNA polymerase ซึ่งอาจมีบทบาทในเซลล์อื่นๆ ด้วย การศึกษา จีโนมิกส์เชิงเปรียบเทียบขนาดใหญ่ยังแสดงให้เห็นว่ากลุ่มยูคาริโอ ตใน ปัจจุบันมีส่วนประกอบเหล่านี้อยู่แล้ว ซึ่งอาจมีความสัมพันธ์เชิงหน้าที่ใกล้ชิดกับระบบการย่อยสลาย RNA ทั่วไป เช่น เอ็กโซโซม^{[ 100 ]}การศึกษานี้ยังชี้ให้เห็นว่าตระกูลโปรตีน Argonaute ที่จับกับ RNA ซึ่งพบร่วมกันในยูคาริโอต อาร์เคียส่วนใหญ่ และแบคทีเรียอย่างน้อยบางชนิด (เช่นAquifex aeolicus ) มีความคล้ายคลึงกับและวิวัฒนาการมาจากส่วนประกอบของระบบ การเริ่มต้นการแปล

การลดการแสดงออก ของยีน (Gene knockdown)เป็นวิธีการที่ใช้ในการลดการแสดงออกของยีนเฉพาะของสิ่งมีชีวิต วิธีนี้ทำได้โดยใช้กระบวนการ RNAi ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ^{[ 6 ]}เทคนิคการลดการแสดงออกของยีนนี้ใช้โมเลกุล siRNA สองสายที่สังเคราะห์ขึ้นโดยมีลำดับที่เสริมกับยีนที่สนใจ กระบวนการ RNAi จะเริ่มต้นเมื่อ เอนไซม์ Dicerเริ่มประมวลผล siRNA ผลลัพธ์สุดท้ายของกระบวนการนี้นำไปสู่การย่อยสลาย mRNA และทำลายคำสั่งใดๆ ที่จำเป็นในการสร้างโปรตีนบางชนิด ด้วยวิธีนี้ นักวิจัยสามารถลด (แต่ไม่สามารถกำจัดได้อย่างสมบูรณ์) การแสดงออกของยีนเป้าหมาย การศึกษาผลกระทบของการลดการแสดงออกนี้อาจแสดงให้เห็นถึงบทบาททางสรีรวิทยาหรือผลกระทบของผลิตภัณฑ์ยีนเป้าหมาย^{[ 101 ] [ 102 ]}

ความพยายามอย่างกว้างขวางในชีววิทยาเชิงคำนวณได้มุ่งเน้นไปที่การออกแบบรีเอเจนต์ dsRNA ที่ประสบความสำเร็จซึ่งเพิ่มประสิทธิภาพการยับยั้งยีนให้สูงสุด แต่ลดผลกระทบ "นอกเป้าหมาย" ให้น้อยที่สุด ผลกระทบนอกเป้าหมายเกิดขึ้นเมื่อ RNA ที่นำเข้ามีลำดับเบสที่สามารถจับคู่กับและลดการแสดงออกของยีนหลายตัวได้ ปัญหาดังกล่าวเกิดขึ้นบ่อยขึ้นเมื่อ dsRNA มีลำดับซ้ำกัน จากการศึกษาจีโนมของมนุษย์C. elegansและS. pombeพบว่าประมาณ 10% ของsiRNA ที่เป็นไปได้ มีผลกระทบนอกเป้าหมายอย่างมาก^{[ 10 ]}มีการพัฒนาเครื่องมือซอฟต์แวร์จำนวนมากที่ใช้ขั้นตอนวิธีในการออกแบบ siRNA ทั่วไป^{[ 103 ] [ 104 ]}เฉพาะสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม^{[ 105 ]}และเฉพาะไวรัส^{[ 106 ]}ซึ่งจะถูกตรวจสอบโดยอัตโนมัติเพื่อหาปฏิกิริยาข้ามสายพันธุ์ที่เป็นไปได้

ขึ้นอยู่กับสิ่งมีชีวิตและระบบการทดลอง RNA ภายนอกอาจเป็นสายยาวที่ออกแบบมาเพื่อให้ถูกตัดโดย Dicer หรือ RNA สั้นๆ ที่ออกแบบมาเพื่อทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นของ siRNA ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมส่วนใหญ่จะใช้ RNA ที่สั้นกว่า เนื่องจากโมเลกุล RNA สองสายยาวจะกระตุ้น การตอบสนอง ของอินเตอร์เฟรอน ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ซึ่งเป็นรูปแบบของภูมิคุ้มกันโดย กำเนิด ที่ตอบสนองต่อสารพันธุกรรมจากภายนอกอย่างไม่จำเพาะเจาะจง^{[ 107 ]}เซลล์ไข่ของหนูและเซลล์จากตัวอ่อน ของหนูในระยะแรก ขาดปฏิกิริยานี้ต่อ dsRNA ภายนอก ดังนั้นจึงเป็นระบบแบบจำลองทั่วไปสำหรับการศึกษาผลกระทบของการลดการแสดงออกของยีนในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม^{[ 108 ]}เทคนิคห้องปฏิบัติการเฉพาะทางได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อปรับปรุงประโยชน์ของ RNAi ในระบบสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมโดยหลีกเลี่ยงการนำ siRNA เข้ามาโดยตรง เช่น โดยการถ่ายทอดแบบ เสถียร ด้วยพลาสมิดที่เข้ารหัสลำดับที่เหมาะสมซึ่งสามารถถอดรหัส siRNA ได้^{[ 109 ]} หรือโดยระบบเวกเตอร์ ไวรัสเลนติที่ซับซ้อนมากขึ้นซึ่งช่วยให้สามารถกระตุ้นหรือยับยั้งการถอดรหัสได้ ซึ่งเรียกว่าRNAi แบบมีเงื่อนไข^{[ 110 ] [ 111 ]}

เทคนิคการยับยั้งการทำงานของยีนโดยใช้ยา RNAi ได้แสดงให้เห็นถึงความสำเร็จในการศึกษาทางคลินิกแบบสุ่มควบคุม ยาเหล่านี้เป็นยาในกลุ่ม siRNA ที่กำลังเติบโต ซึ่งช่วยลดการแสดงออกของโปรตีนที่เข้ารหัสโดยยีนบางชนิด ปัจจุบัน ยา RNAi จำนวน 5 ชนิดได้รับการอนุมัติจากหน่วยงานกำกับดูแลในสหรัฐอเมริกาและยุโรป ได้แก่patisiran (2018), givosiran (2019), lumasiran (2020), inclisiran (2020 ในยุโรป โดยคาดว่าจะได้รับการอนุมัติในสหรัฐอเมริกาในปี 2021) และvutrisiran (2022) ^{[ 112 ] [ 113 ] [ 114 ] [ 115 ]}

แม้ว่ายาบำบัดด้วย RNAi ที่ได้รับการอนุมัติจากหน่วยงานกำกับดูแลในปัจจุบันทั้งหมดจะมุ่งเน้นไปที่โรคที่เกิดขึ้นในตับ แต่ยาเพิ่มเติมที่อยู่ระหว่างการวิจัยนั้นมุ่งเป้าไปที่โรคต่างๆ มากมาย รวมถึงโรคหัวใจและหลอดเลือด โรคเลือดออกง่าย โรคที่เกิดจากการใช้แอลกอฮอล์ในทางที่ผิด โรคซิสติกไฟโบรซิส โรคเกาต์ มะเร็ง และโรคตา

Patisiranเป็นยาชนิด siRNA สองสายตัวแรกที่ได้รับการอนุมัติในปี 2018 และพัฒนาโดยAlnylam Pharmaceuticals Patisiran ใช้กระบวนการ RNAi เพื่อยับยั้งยีนที่เข้ารหัส TTR (transthryetin) การกลายพันธุ์ในยีนนี้อาจทำให้โปรตีนที่ก่อให้เกิดโรคอะไมลอยโดซิส ATTR ทางพันธุกรรม เกิดการพับตัวผิดปกติ เพื่อให้ได้ผลการรักษา Patisiran จะถูกห่อหุ้มด้วย เยื่อหุ้ม อนุภาคไขมันขนาดนาโนที่ช่วยให้สามารถผ่านเข้าไปในไซโตพลาสซึมได้ เมื่อเข้าไปในเซลล์แล้ว siRNA จะเริ่มกระบวนการโดยเอนไซม์ Dicer Patisiran จะถูกบริหารโดยผู้เชี่ยวชาญด้านการดูแลสุขภาพผ่านการให้ยาทางหลอดเลือดดำ โดยปริมาณยาจะขึ้นอยู่กับน้ำหนักตัว คำเตือนและข้อควรระวัง ได้แก่ ความเสี่ยงของปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับการให้ยาทางหลอดเลือดดำ และระดับวิตามินเอในซีรั่มลดลง^{[ 116 ]}

ในปี 2019 องค์การอาหารและยา (FDA) และองค์การยาแห่งยุโรป (EMA) ได้อนุมัติgivosiran สำหรับการรักษาผู้ใหญ่ที่เป็นโรค porphyria ตับเฉียบพลัน (AHP) [ 117 ] นอกจากนี้ FDA ยังให้สถานะการบำบัดแบบก้าวหน้า (breakthrough therapy designation) สถานะการพิจารณาแบบเร่งด่วน (priority review designation) และสถานะยารักษาโรคหายาก( orphan drug designation ^{)แก่givosiran}สำหรับการรักษาโรคporphyria ตับเฉียบพลัน(AHP) ในเดือนพฤศจิกายน 2019 ^{[ 118 ]}ภายในปี 2020 givosiran ได้รับการอนุมัติจาก EMA ^{[ 119 ]} Givosiran เป็น siRNA ที่ทำลาย mRNA ของ aminolevulinic acid synthase 1 (ALAS1) ในตับ การทำลาย mRNA ของ ALAS1 จะช่วยป้องกันการสะสมของสารพิษ (ซึ่งเป็นสาเหตุของการโจมตีระบบประสาทและอวัยวะภายใน และโรค AHP) เช่นaminolevulinic acid (ALA) และporphobilinogen (PBG) ^{[ 120 ] [ 121 ] [ 122 ] [ 123 ]}เพื่ออำนวยความสะดวกในการเข้าสู่ไซโตพลาสซึม กิโวซิแรนใช้ลิแกนด์ GalNAcและเข้าสู่เซลล์ตับ ยาจะถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังโดยผู้เชี่ยวชาญด้านการดูแลสุขภาพ โดยปริมาณยาจะขึ้นอยู่กับน้ำหนักตัว คำเตือนและข้อควรระวัง ได้แก่ ความเสี่ยงต่อปฏิกิริยาภูมิแพ้รุนแรง พิษต่อตับ พิษต่อไต และปฏิกิริยาบริเวณที่ฉีด^{[ 124 ]}

ลูมาซิแรนได้รับการอนุมัติให้เป็นยาที่ใช้ siRNA ในปี 2020 สำหรับใช้ในสหภาพยุโรปและสหรัฐอเมริกา^{[ 125 ] [ 126 ]}ยานี้ใช้สำหรับการรักษา ภาวะ ไฮเปอร์ออกซาลิยูเรียชนิดที่ 1 (PH1) ในเด็กและผู้ใหญ่ ยานี้ออกแบบมาเพื่อลดการผลิตออกซาเลตในตับและระดับออกซาเลตในปัสสาวะผ่าน RNAi โดยการกำหนดเป้าหมายไปที่ mRNA ของไฮดรอกซีแอซิดออกซิเดส 1 (HAO1) ​​เพื่อสลาย การลดระดับเอนไซม์ HAO1 จะช่วยลดการออกซิเดชันของไกลโคเลตเป็นไกลออกซิเลต (ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของออกซาเลต) ลูมาซิแรนจะถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังโดยผู้เชี่ยวชาญด้านการดูแลสุขภาพ โดยการให้ยาจะขึ้นอยู่กับน้ำหนักตัว^{[ 127 ]}ข้อมูลจากการทดลองทางคลินิกแบบสุ่มควบคุมระบุว่าอาการไม่พึงประสงค์ที่พบบ่อยที่สุดคือปฏิกิริยาบริเวณที่ฉีด ปฏิกิริยาเหล่านี้ไม่รุนแรงและพบในผู้ป่วย 38 เปอร์เซ็นต์ที่ได้รับการรักษาด้วยลูมาซิแรน^{[ 128 ]}

ในปี 2022 องค์การอาหารและยา (FDA) และองค์การยาแห่งยุโรป (EMA) ได้อนุมัติให้ใช้ยา vutrisiranสำหรับการรักษาผู้ใหญ่ที่เป็นโรคอะไมลอยโดซิสที่เกิดจากทรานส์ไทเรตินทางพันธุกรรมร่วมกับโรคเส้นประสาทอักเสบระยะที่ 1 หรือ 2 ^{[ 129 ] [ 130 ]} Vutrisiran ได้รับการออกแบบมาเพื่อสลาย mRNA ที่เข้ารหัสทรานส์ไทเรติน

ยาที่อยู่ระหว่างการวิจัยอื่นๆ ที่ใช้ RNAi ซึ่งกำลังได้รับการพัฒนาโดยบริษัทเภสัชกรรม เช่นArrowhead Pharmaceuticals , Dicerna, Alnylam Pharmaceuticals , Amgenและ Sylentis ยาเหล่านี้ครอบคลุมเป้าหมายและโรคต่างๆ ที่หลากหลายผ่านทาง RNAi

การบำบัดด้วย RNAi ที่อยู่ระหว่างการพัฒนา:

ปัจจุบัน miRNA และ SiRNA ต่างก็ถูกสังเคราะห์ทางเคมี ดังนั้นจึงถูกจัดประเภทตามกฎหมายในสหภาพยุโรปและสหรัฐอเมริกาว่าเป็นผลิตภัณฑ์ยา "ธรรมดา" แต่เนื่องจาก siRNA ที่ได้รับการดัดแปลงทางชีวภาพ (BERAs) กำลังอยู่ในระหว่างการพัฒนา จึงจะถูกจัดประเภทเป็นผลิตภัณฑ์ยาชีวภาพ อย่างน้อยก็ในสหภาพยุโรป การพัฒนาเทคโนโลยี BERAs ทำให้เกิดคำถามเกี่ยวกับการจัดประเภทของยาที่มีกลไกการออกฤทธิ์เดียวกัน แต่ผลิตขึ้นทางเคมีหรือทางชีวภาพ ความไม่สอดคล้องกันนี้ควรได้รับการแก้ไข^{[ 131 ]}

เพื่อให้ได้ศักยภาพทางคลินิกของ RNAi นั้น siRNA จะต้องถูกขนส่งไปยังเซลล์ของเนื้อเยื่อเป้าหมายอย่างมีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตาม มีอุปสรรคหลายประการที่ต้องแก้ไขก่อนที่จะสามารถนำไปใช้ทางคลินิกได้ ตัวอย่างเช่นsiRNA ที่ "เปลือยเปล่า" นั้นมีความเสี่ยงต่ออุปสรรคหลายประการที่ลดประสิทธิภาพในการรักษา^{[ 132 ]}นอกจากนี้ เมื่อ siRNA เข้าสู่กระแสเลือดแล้ว RNA ที่เปลือยเปล่าสามารถถูกย่อยสลายโดยนิวคลีเอสในซีรั่มและสามารถกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดได้^{[ 132 ]} เนื่องจากขนาดและลักษณะที่เป็นโพลีแอนไอออนิกสูง (มีประจุลบในหลายตำแหน่ง) โมเลกุล siRNA ที่ไม่ได้รับการดัดแปลงจึงไม่สามารถเข้าสู่เซลล์ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ได้ง่าย ดังนั้นจึง ต้องใช้siRNA ที่ห่อหุ้มด้วยอนุภาคเทียมหรือ อนุภาคนาโน หาก siRNA ถูกส่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ อาจเกิดความเป็นพิษที่ไม่พึงประสงค์ได้หากปริมาณยาที่ใช้ในการรักษาไม่ได้รับการปรับให้เหมาะสม และ siRNA อาจแสดงผลกระทบที่ไม่ตรงเป้าหมาย (เช่น การลดระดับยีนที่ไม่ตั้งใจที่มีลำดับเสริมกันบางส่วน ) ^{[ 133 ]}แม้หลังจากเข้าสู่เซลล์แล้ว ก็ยังจำเป็นต้องให้ยาซ้ำหลายครั้ง เนื่องจากผลของมันจะเจือจางลงทุกครั้งที่เซลล์แบ่งตัว เพื่อตอบสนองต่อปัญหาและอุปสรรคที่อาจเกิดขึ้นเหล่านี้ มีสองแนวทางที่ช่วยอำนวยความสะดวกในการส่ง siRNA ไปยังเซลล์เป้าหมาย ได้แก่ อนุภาคไขมันนาโนและสารประกอบเชิงซ้อน^{[ 134 ]}

อนุภาคนาโนลิปิด (LNPs) มีพื้นฐานมาจากโครงสร้างคล้ายไลโปโซม ซึ่งโดยทั่วไปประกอบด้วยศูนย์กลางที่เป็นน้ำล้อมรอบด้วยเปลือกลิปิด^{[ 135 ]}ไลโปโซมบางกลุ่มที่ใช้สำหรับการส่งยาไปยังเนื้อเยื่อประกอบด้วยเวสิเคิลชั้นเดียวขนาดใหญ่ (LUVs) ซึ่งอาจมีขนาด 100 นาโนเมตร กลไกการส่งยาด้วย LNP ได้กลายเป็นแหล่งที่มาของการห่อหุ้มกรดนิวคลีอิกเพิ่มมากขึ้น และอาจรวมถึง^พลาสมิดCRISPRและmRNA [ ^{136 ]}

การใช้ลิพิดนาโนอนุภาคเป็นกลไกการส่งยาที่ได้รับการอนุมัติครั้งแรกเริ่มขึ้นในปี 2018 โดยใช้ยา siRNA ชื่อ patisiran ซึ่งพัฒนาโดย Alnylam Pharmaceuticals นอกจากนี้ Dicerna Pharmaceuticals, Persomics , SanofiและSirna Therapeuticsก็ได้ร่วมกันนำการบำบัดด้วย RNAi ออกสู่ตลาดเช่นกัน^{[ 137 ] [ 138 ]}

แอปพลิเคชันล่าสุดอื่นๆ ได้แก่ วัคซีน COVID-19 ที่ได้รับการอนุมัติจาก FDA สองชนิด ได้แก่ mRNA-1273 ซึ่งพัฒนาโดยModerna และ BNT162b ซึ่งพัฒนาโดยความร่วมมือระหว่างPfizerและBioNtech ^{[ 139 ]}วัคซีนทั้งสองชนิดนี้ใช้ลิพิดนาโนอนุภาคเพื่อส่งแอนติเจน mRNA การห่อหุ้มโมเลกุล mRNA ในลิพิดนาโนอนุภาคถือเป็นความก้าวหน้าที่สำคัญในการผลิตวัคซีน mRNA ที่ใช้งานได้จริง ซึ่งช่วยแก้ปัญหาอุปสรรคทางเทคนิคที่สำคัญหลายประการในการส่งโมเลกุล mRNA เข้าสู่เซลล์โฮสต์โดยกระจายผ่านอะโพลิโปโปรตีน E (apoE) ในตัวรับไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำ (LDLR) ในเดือนธันวาคม 2020 Novartis ประกาศว่าผลลัพธ์เชิงบวกจากการศึกษาประสิทธิภาพระยะที่ 3 ระบุว่าinclisiranเป็นการรักษาสำหรับภาวะไขมันในเลือดสูงในครอบครัวแบบ เฮเทอโรไซกัส (HeFH) และโรคหลอดเลือดหัวใจตีบ (ASCVD) ^{[ 140 ]}

นอกเหนือจาก LNP แล้ว การบำบัดด้วย RNAi ยังมุ่งเป้าไปที่การส่งยาผ่านสารประกอบ siRNA (เช่น GalNAc, คาร์โบไฮเดรต, เปปไทด์, แอพทาเมอร์, แอนติบอดี) ^{[ 141 ]}การบำบัดโดยใช้สารประกอบ siRNA ได้รับการพัฒนาขึ้นสำหรับโรคหายากหรือโรคทางพันธุกรรม เช่น โรคตับอักเสบเฉียบพลัน (AHP), โรคฮีโมฟีเลีย , โรคไฮเปอร์ออกซา โลเรียปฐมภูมิ (PH) และ โรค อะไมลอย โดซิส ATTR ทางพันธุกรรม รวมถึงโรคหัวใจและหลอดเลือดอื่นๆ เช่นโรคความดันโลหิตสูงและโรคไขมันพอกตับ ที่ไม่ได้เกิดจากแอลกอฮอล์ (NASH) ^{[ 142 ]}

การรักษาด้วยยาต้านไวรัสเป็นหนึ่งในการประยุกต์ใช้ทางการแพทย์ที่เสนอขึ้นในยุคแรกๆ โดยใช้ RNAi และมีการพัฒนาสองประเภทที่แตกต่างกัน ประเภทแรกคือการกำหนดเป้าหมายไปที่ RNA ของไวรัส การศึกษาหลายชิ้นแสดงให้เห็นว่าการกำหนดเป้าหมายไปที่ RNA ของไวรัสสามารถยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสจำนวนมาก รวมถึง^{HIV [ 143 ] HPV [} 144 ^{] ไวรัสตับอักเสบเอ [ 145 ] ไวรัสตับอักเสบ บี [} 146 ] ^{ไวรัสไข้หวัดใหญ่} [ ^{147 ] [} 148 ] ^{[ 149} ] [ 150 ^{] ไวรัส} RSV ^{[ 150 ]ไวรัสโคโรนาSARS ( SARS - CoV )} [ ^{150 ] อะ}เด^{โนไวรัส[} 150 ^{]และไวรัส}โรคหัด[ ^{151 ] กลยุทธ์}อีกอย่างหนึ่งคือการปิดกั้นการเข้าสู่เซลล์ของไวรัสในระยะเริ่มต้นโดยการกำหนดเป้าหมายไปที่ยีนของเซลล์โฮสต์^{[ 152 ]}ตัวอย่างเช่น การยับยั้งตัวรับเคโมไคน์ ( CXCR4และCCR5 ) บนเซลล์โฮสต์สามารถป้องกันการเข้าสู่เซลล์ของไวรัส HIV ได้^{[ 153 ]}

แม้ว่าเคมีบำบัด แบบดั้งเดิม จะสามารถฆ่าเซลล์มะเร็งได้อย่างมีประสิทธิภาพ แต่การขาดความจำเพาะในการแยกแยะเซลล์ปกติและเซลล์มะเร็งในการรักษาเหล่านี้มักทำให้เกิดผลข้างเคียงที่รุนแรง การศึกษาจำนวนมากแสดงให้เห็นว่า RNAi สามารถให้แนวทางที่เฉพาะเจาะจงมากขึ้นในการยับยั้งการเติบโตของเนื้องอกโดยการกำหนดเป้าหมายยีนที่เกี่ยวข้องกับมะเร็ง (เช่นออนโคยีน ) ^{[ 154 ]}นอกจากนี้ยังมีการเสนอว่า RNAi สามารถเพิ่มความไวของเซลล์มะเร็งต่อสารเคมีบำบัดซึ่งเป็นแนวทางการรักษาแบบผสมผสานกับเคมีบำบัด^{[ 155 ]}การรักษาที่มีศักยภาพอีกอย่างหนึ่งที่ใช้ RNAi คือการยับยั้งการบุกรุกและการเคลื่อนย้ายของ เซลล์ ^{[ 156 ]}

เมื่อเปรียบเทียบกับเคมีบำบัดหรือยาต้านมะเร็งชนิดอื่น ยา siRNA มีข้อดีมากมาย^{[ 157 ]} siRNA ออกฤทธิ์ในขั้นตอนหลังการถอดรหัสของการแสดงออกของยีน ดังนั้นจึงไม่แก้ไขหรือเปลี่ยนแปลง DNA ในลักษณะที่เป็นอันตราย^{[ 157 ]} siRNA ยังสามารถใช้เพื่อสร้างการตอบสนองที่เฉพาะเจาะจงในรูปแบบใดรูปแบบหนึ่ง เช่น โดยการลดการยับยั้งการแสดงออกของยีน^{[ 157 ]}ในเซลล์มะเร็งเพียงเซลล์เดียว siRNA สามารถทำให้เกิดการยับยั้งการแสดงออกของยีนอย่างมากด้วยสำเนาเพียงไม่กี่ชุด^{[ 157 ]}สิ่งนี้เกิดขึ้นโดยการปิดการทำงานของยีนที่ส่งเสริมมะเร็งด้วย RNAi รวมถึงการกำหนดเป้าหมายลำดับ mRNA ^{[ 157 ]}

ยา RNAi รักษาโรคมะเร็งโดยการปิดการทำงานของยีนที่ส่งเสริมการเกิดมะเร็งบางชนิด^{[ 157 ]}โดยทำได้โดยการเสริมยีนมะเร็งด้วย RNAi เช่น การรักษาลำดับ mRNA ให้สอดคล้องกับยา RNAi ^{[ 157 ]}โดยหลักการแล้ว ควรฉีด RNAi และ/หรือดัดแปลงทางเคมีเพื่อให้ RNAi สามารถเข้าถึงเซลล์มะเร็งได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น^{[ 157 ]}การดูดซึมและการควบคุม RNAi นั้นถูกควบคุมโดยไต^{[ 157 ]}

กลยุทธ์ RNAi ยังแสดงศักยภาพในการรักษาโรคทางระบบประสาทเสื่อมการศึกษาในเซลล์และในหนูแสดงให้เห็นว่าการกำหนดเป้าหมาย ยีนที่สร้าง อะไมลอยด์เบต้า โดยเฉพาะ (เช่น BACE1 และ APP) ด้วย RNAi สามารถลดปริมาณเปปไทด์ Aβ ได้อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งมีความสัมพันธ์กับสาเหตุของโรคอัลไซเมอร์ [ ^{158 ] [ 159 ] [ 160 ] นอกจาก}นี้ แนวทางที่ใช้การปิดกั้นนี้ยังให้ผลลัพธ์ที่น่าสนใจในการรักษาโรคพาร์กินสันและโรคโพลีกลูตามีน^{[ 161 ] [ 162 ] [ 163 ]}

ระบบภูมิคุ้มกันของมนุษย์แบ่งออกเป็นสองสาขาแยกกัน ได้แก่ ระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว^{[ 164 ]}ระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดเป็นด่านแรกในการป้องกันการติดเชื้อและตอบสนองต่อเชื้อโรคในลักษณะทั่วไป^{[ 164 ]}ในทางกลับกัน ระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว ซึ่งเป็นระบบที่วิวัฒนาการมาภายหลังระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด ประกอบด้วยเซลล์ B และ T ที่มีความเชี่ยวชาญสูงเป็นหลัก ซึ่งได้รับการฝึกฝนให้ตอบสนองต่อส่วนเฉพาะของโมเลกุลของเชื้อโรค^{[ 164 ]}

ความท้าทายระหว่างเชื้อโรคเก่าและเชื้อโรคใหม่ได้ช่วยสร้างระบบของเซลล์และอนุภาคที่ได้รับการปกป้องซึ่งเรียกว่ากรอบความปลอดภัย^{[ 164 ]}กรอบนี้ได้มอบระบบมากมายให้แก่มนุษย์เพื่อค้นหาและทำลายอนุภาคผู้บุกรุก เช่น เชื้อโรค จุลินทรีย์ ปรสิต และการติดเชื้อ^{[ 164 ]}กรอบความปลอดภัยของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้พัฒนาขึ้นเพื่อรวม siRNA เป็นเครื่องมือในการบ่งชี้การติดเชื้อไวรัส ซึ่งทำให้ siRNA สามารถสร้างการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดที่รุนแรงได้^{[ 164 ]}

siRNA ถูกควบคุมโดยระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด ซึ่งสามารถแบ่งออกเป็นการตอบสนองการอักเสบเฉียบพลันและการตอบสนองต่อต้านไวรัส^{[ 164 ]}การตอบสนองการอักเสบเกิดขึ้นจากสัญญาณจากโมเลกุลส่งสัญญาณขนาดเล็ก หรือไซโตไคน์^{[ 164 ]}ซึ่งรวมถึงอินเตอร์ลิวคิน-1 (IL-1), อินเตอร์ลิวคิน-6 (IL-6), อินเตอร์ลิวคิน-12 (IL-12) และปัจจัยเนื้องอกเนโครซิสอัลฟา (TNF-α) ^{[ 164 ]}ระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดสร้างการอักเสบและการตอบสนองต่อต้านไวรัส ซึ่งทำให้เกิดการปล่อยตัวรับการจดจำรูปแบบ (PRRs) ^{[ 164 ]}ตัวรับเหล่านี้ช่วยในการระบุว่าเชื้อโรคใดเป็นไวรัส เชื้อรา หรือแบคทีเรีย [ ^{164 ] นอกจาก}นี้ ความสำคัญของ siRNA และระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดคือการรวม PRRs เพิ่มเติมเพื่อช่วยในการจดจำโครงสร้าง RNA ที่แตกต่างกัน^{[ 164 ]}ซึ่งทำให้ siRNA มีแนวโน้มที่จะก่อให้เกิดการตอบสนองกระตุ้นภูมิคุ้มกันในกรณีที่มีเชื้อโรค^{[ 164 ]}

RNAi ถูกนำมาใช้ในการประยุกต์ใช้ทางการเกษตรหลากหลายประเภท รวมถึงพืชดัดแปลงพันธุกรรมและยาฆ่าแมลง การใช้เส้นทาง RNAi ได้พัฒนาผลิตภัณฑ์มากมาย เช่น อาหารอย่างแอปเปิ้ลอาร์กติกยาสูบไร้นิโคติน กาแฟไร้คาเฟอีน ผักเสริมคุณค่าทางโภชนาการ และพืชที่ไม่ก่อให้เกิดอาการแพ้^{[ 165 ] [ 166 ] [ 167 ]}การใช้ RNAi ที่กำลังเกิดขึ้นใหม่นี้มีศักยภาพที่จะพัฒนาผลิตภัณฑ์อื่นๆ อีกมากมายสำหรับการใช้งานในอนาคต

RNAi ถูกนำมาใช้ในการดัดแปลงพันธุกรรมของพืชเพื่อให้ผลิตสารพิษจากพืชตามธรรมชาติในระดับที่ต่ำลง เทคนิคดังกล่าวใช้ประโยชน์จากฟีโนไทป์ RNAi ที่เสถียรและถ่ายทอดได้ในสายพันธุ์พืช เมล็ด ฝ้ายอุดมไปด้วยโปรตีนในอาหารแต่ตามธรรมชาติมีสารเทอร์พีนอยด์ที่ เป็นพิษอย่าง กอสซิพอลทำให้ไม่เหมาะสำหรับการบริโภคของมนุษย์ RNAi ถูกนำมาใช้ในการผลิตสายพันธุ์ฝ้ายที่มีเมล็ดซึ่งมีระดับของเดลต้า-คาดีนีนซินเทส ลดลง ซึ่งเป็นเอนไซม์สำคัญในการผลิตกอสซิพอล โดยไม่ส่งผลกระทบต่อการผลิตเอนไซม์ในส่วนอื่นๆ ของพืช ซึ่งกอสซิพอลเองก็มีความสำคัญในการป้องกันความเสียหายจากศัตรูพืช^{[ 168 ]}

ความพยายามในการพัฒนาประสบความสำเร็จในการลดระดับสารก่อภูมิแพ้ในต้นมะเขือเทศ^{[ 169 ]}และการเสริมคุณค่าทางโภชนาการให้กับพืช เช่น มะเขือเทศด้วยสารต้านอนุมูลอิสระ^{[ 170 ]}การปิดกั้นอัลฟา-อะไมเลส ด้วย RNAi ยังถูกนำมาใช้เพื่อลด การเจริญเติบโตของเชื้อรา Aspergillus flavusในข้าวโพด ซึ่งหากไม่ทำเช่นนั้นจะทำให้เมล็ดข้าวโพดปนเปื้อนด้วยอะฟลาทอกซินที่ เป็นอันตราย ^{[ 171 ]}การปิดกั้นเอนไซม์สังเคราะห์ปัจจัยที่ ทำให้เกิดน้ำตา ในหัว หอม ทำให้ได้หัวหอมที่ไม่ทำให้เกิดน้ำตา และ RNAi ถูกนำมาใช้ในยีน BP1 ในเรพซีดเพื่อปรับปรุงการสังเคราะห์แสง^{[ 172 ]}ยีน SBEIIa และ SBEIIb ในข้าวสาลีถูกกำหนดเป้าหมายในข้าวสาลีเพื่อผลิตอะไมโลส ในระดับที่สูงขึ้น เพื่อปรับปรุงการทำงานของลำไส้^{[ 173 ]}และ Travella et al. ในปี 2006 มีการใช้ RNAi สำหรับจีโนมิกส์เชิงฟังก์ชันในการตรวจสอบสายพันธุ์ขนมปัง เฮกซาพลอยด์ ในขณะที่การปิดกั้นยีนที่เกิดจากไวรัส (VIGS ซึ่งเป็นชนิดย่อยของ RNAi) ถูกใช้โดย Scofield et al. ในปี 2005 เพื่อตรวจสอบกลไกการต้านทานที่Lr21 ให้ไว้ ต่อโรคสนิมใบข้าว สาลี ในข้าวสาลีเฮกซาพลอยด์^{[ 174 ]}

RNAi กำลังอยู่ระหว่างการพัฒนาเพื่อใช้เป็นยาฆ่าแมลงโดยใช้วิธีการหลายวิธี รวมถึงการดัดแปลงพันธุกรรมและการใช้เฉพาะที่^{[ 4 ]}เซลล์ในลำไส้กลางของแมลงบางชนิดจะดูดซับโมเลกุล dsRNA ในกระบวนการที่เรียกว่า RNAi ในสิ่งแวดล้อม^{[ 175 ]}ในแมลงบางชนิด ผลกระทบจะเป็นแบบทั่วร่างกาย เนื่องจากสัญญาณจะแพร่กระจายไปทั่วร่างกายของแมลง (เรียกว่า RNAi แบบทั่วร่างกาย) ^{[ 176 ]}

สัตว์ที่ได้รับ RNAi ในปริมาณที่สูงกว่าระดับที่คาดการณ์ไว้สำหรับมนุษย์หลายล้านเท่าไม่แสดงอาการผิดปกติใดๆ^{[ 177 ]} RNAi มีผลกระทบที่แตกต่างกันใน ผีเสื้อและผีเสื้อกลางคืนชนิดต่างๆ^{[ 178 ]}

แมลงหวี่ spp., Bombyx mori , Locusta spp., Spodoptera spp., Tribolium castaneum , Nilaparvata lugens , Helicoverpa armigeraและ Apis melliferaเป็นแบบจำลองที่ใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อเรียนรู้ว่า RNAi ทำงานอย่างไรภายในแท็กซ่า เฉพาะ ของแมลง Musca domesticaมี ยีน Ago2 สอง ยีนและ Glossina morsitansสามยีน ตามที่ Lewis และคณะค้นพบ 2016 และ Hain และคณะ 2010 ^{[ 179 ] [ 180 ]}ในกรณีของทางเดิน miRNA Diuraphis noxiaมีสอง Ago1 s, M. domesticaสองตัวDcr1 s , Acyrthosiphon pisumอย่างละ 2 ตัวของ Ago1และ Loqsและ Dcr1และสี่ของ Pashaในขณะที่ใน piRNAนั้น G. morsitansและ A. pisum มี Ago3สองหรือสามตัว ^{[ 180 ]}ซึ่งนำไปสู่การระบุ เป้าหมาย การพัฒนายาฆ่าแมลง ในอนาคต รวมถึงกลไกการออกฤทธิ์และสาเหตุของการดื้อยาฆ่าแมลงของยาฆ่าแมลงชนิดอื่น ^{[ 180 ]}

พืชดัดแปลงพันธุกรรมถูกสร้างขึ้นเพื่อแสดงออก dsRNA ซึ่งได้รับการคัดเลือกอย่างระมัดระวังเพื่อปิดการทำงานของยีนที่สำคัญในศัตรูพืชเป้าหมาย dsRNA เหล่านี้ได้รับการออกแบบมาให้ส่งผลกระทบต่อแมลงที่แสดงออกลำดับยีนที่เฉพาะเจาะจงเท่านั้น เพื่อเป็นการพิสูจน์หลักการในปี 2552 การศึกษาหนึ่งแสดงให้เห็นว่า RNA สามารถฆ่าแมลงวันผลไม้ได้ 1 ใน 4 ชนิด โดยไม่ทำอันตรายต่ออีก 3 ชนิด^{[ 4 ]}

อีกทางเลือกหนึ่งคือสามารถจัดหา dsRNA ได้โดยไม่ต้องใช้เทคโนโลยีทางพันธุกรรม วิธีหนึ่งคือการเติมลงใน น้ำ ชลประทานโมเลกุลจะถูกดูดซึมเข้าสู่ ระบบ หลอดเลือด ของพืช และเป็นพิษต่อแมลงที่กินพืช อีกวิธีหนึ่งคือการฉีดพ่น dsRNA เหมือนยาฆ่าแมลงทั่วไป ซึ่งจะช่วยให้พืชปรับตัวต้านทานได้เร็วขึ้น วิธีการดังกล่าวจะต้องใช้แหล่ง dsRNA ที่มีต้นทุนต่ำ ซึ่งปัจจุบันยังไม่มีอยู่^{[ 4 ]}

แนวทางการออกแบบไลบรารี RNAi ทั่วทั้งจีโนมอาจต้องใช้ความซับซ้อนมากกว่าการออกแบบsiRNA ตัวเดียว สำหรับชุดเงื่อนไขการทดลองที่กำหนดไว้เครือข่ายประสาทเทียมมักถูกใช้ในการออกแบบไลบรารี siRNA ^{[ 181 ]}และเพื่อทำนายประสิทธิภาพที่น่าจะเป็นไปได้ในการยับยั้งยีน^{[ 182 ]}การคัดกรองจีโนมจำนวนมากถือเป็นวิธีการที่มีแนวโน้มที่ดีสำหรับการระบุคำอธิบายประกอบจีโนมและได้กระตุ้นการพัฒนาวิธีการคัดกรองแบบความเร็วสูงโดยใช้ไมโครอาร์เรย์^{[ 183 ] [ 184 ]}

การวิจัย RNAi ระดับจีโนมอาศัย เทคโนโลยี การคัดกรองแบบความเร็วสูง (HTS) เทคโนโลยี RNAi HTS ช่วยให้สามารถคัดกรองการสูญเสียฟังก์ชันทั่วทั้งจีโนมและถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการระบุยีนที่เกี่ยวข้องกับฟีโนไทป์เฉพาะ เทคโนโลยีนี้ได้รับการยกย่องว่าเป็นคลื่นลูกที่สองของจีโนมิกส์ที่มีศักยภาพ ต่อจากคลื่นลูกแรกของจีโนมิกส์ ได้แก่ไมโครอาร์เรย์การแสดงออกของยีน และแพลตฟอร์มการค้นพบโพลีมอร์ฟิซึมของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว^{[ 185 ]} ข้อได้เปรียบที่สำคัญอย่างหนึ่งของการคัดกรอง RNAi ระดับจีโนมคือความสามารถในการตรวจสอบยีนหลายพันยีนพร้อมกัน ด้วยความสามารถในการสร้างข้อมูลจำนวนมากต่อการทดลอง การคัดกรอง RNAi ระดับจีโนมจึงนำไปสู่การเพิ่มขึ้นอย่างมากของอัตราการสร้างข้อมูล การใช้ประโยชน์จากชุดข้อมูลขนาดใหญ่ดังกล่าวเป็นความท้าทายพื้นฐานที่ต้องใช้วิธีการทางสถิติ/ชีวสารสนเทศที่เหมาะสม กระบวนการพื้นฐานของการคัดกรอง RNAi ที่ใช้เซลล์ประกอบด้วยการเลือกไลบรารี RNAi, ประเภทเซลล์ที่แข็งแรงและเสถียร, การถ่ายทอดสาร RNAi, การรักษา/การบ่ม, การตรวจจับสัญญาณ, การวิเคราะห์ และการระบุยีนที่สำคัญหรือเป้าหมายการรักษา^{[ 186 ]}

กระบวนการ RNAi ถูกเรียกว่า "การยับยั้งร่วม" และ "การระงับ" เมื่อสังเกตก่อนที่จะมีความรู้เกี่ยวกับกลไกที่เกี่ยวข้องกับ RNA การค้นพบ RNAi เกิดขึ้นจากการสังเกตการยับยั้งการถอดรหัสโดย RNA แอนติเซนส์ที่แสดงออกในพืชดัดแปลงพันธุกรรม^{[ 188 ]}และโดยตรงมากขึ้นจากรายงานผลลัพธ์ที่ไม่คาดคิดในการทดลองที่ดำเนินการโดยนักวิทยาศาสตร์พืชในสหรัฐอเมริกาและเนเธอร์แลนด์ในช่วงต้นทศวรรษ 1990 ^{[ 189 ]}ในความพยายามที่จะเปลี่ยนแปลง สี ดอกไม้ในเพทูเนียนักวิจัยได้แนะนำสำเนาเพิ่มเติมของยีนที่เข้ารหัสชาลโคนซินเทสซึ่งเป็นเอนไซม์สำคัญสำหรับ การสร้าง เม็ดสี ของดอกไม้ เข้าไปในต้นเพทูเนียที่มีสีดอกไม้ปกติเป็นสีชมพูหรือสีม่วง คาดว่ายีนที่แสดงออกมากเกินไปจะทำให้ดอกไม้มีสีเข้มขึ้น แต่กลับทำให้ดอกไม้บางดอกมีเม็ดสีม่วงที่มองเห็นได้น้อยลง บางครั้งในรูปแบบที่หลากหลาย แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมของชาลโคนซินเทสลดลงอย่างมากหรือถูกยับยั้งในลักษณะเฉพาะบริบท การสังเกต RNAi ในช่วงแรกๆ อีกครั้งหนึ่งมาจากการศึกษาเชื้อราNeurospora crassa [ ^{190 ] แม้ว่าจะยังไม่ ได้}รับการยอมรับว่ามีความเกี่ยวข้องในทันที การตรวจสอบปรากฏการณ์นี้ในพืชเพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่าการลดระดับลงนั้นเกิดจากการยับยั้งการแสดงออกของยีนหลังการถอดรหัสผ่านอัตราการย่อยสลาย mRNA ที่เพิ่มขึ้น^{[ 191 ]}ปรากฏการณ์นี้เรียกว่าการยับยั้งการแสดงออกของยีนร่วมกันแต่กลไกทางโมเลกุลยังคงไม่เป็นที่รู้จัก^{[ 192 ]}

ไม่นานหลังจากนั้นนักไวรัสวิทยา พืช ที่ทำงานเกี่ยวกับการปรับปรุงความต้านทานของพืชต่อโรคไวรัสได้สังเกตเห็นปรากฏการณ์ที่ไม่คาดคิดที่คล้ายกัน ในขณะที่เป็นที่ทราบกันดีว่าพืชที่แสดงโปรตีนเฉพาะของไวรัสแสดงความทนทานหรือความต้านทานต่อการติดเชื้อไวรัสที่เพิ่มขึ้น แต่ก็ไม่มีใครคาดคิดว่าพืชที่มีเพียงบริเวณสั้นๆ ที่ไม่เข้ารหัสของลำดับ RNA ของไวรัสจะแสดงระดับการป้องกันที่คล้ายกัน นักวิจัยเชื่อว่า RNA ของไวรัสที่ผลิตโดยทรานส์ยีนอาจยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสได้เช่นกัน^{[ 193 ]}การทดลองย้อนกลับซึ่งมีการนำลำดับยีนของพืชสั้นๆ เข้าไปในไวรัส แสดงให้เห็นว่ายีนเป้าหมายถูกยับยั้งในพืชที่ติดเชื้อ^{[ 194 ]}ปรากฏการณ์นี้ถูกเรียกว่า "การปิดกั้นยีนที่เกิดจากไวรัส" (VIGS) ^{[ 174 ]}และชุดของปรากฏการณ์ดังกล่าวถูกเรียกรวมกันว่าการปิดกั้นยีนหลังการถอดรหัส^{[ 195 ]}

หลังจากการสังเกตเบื้องต้นในพืช ห้องปฏิบัติการต่างๆ ได้ค้นหาปรากฏการณ์นี้ในสิ่งมีชีวิตอื่นๆ^{[ 196 ] [ 197 ]}กรณีแรกของ การปิดกั้น RNAในสัตว์ได้รับการบันทึกไว้ในปี 1996 เมื่อ Guo และ Kemphues สังเกตว่า การนำRNA สายเดี่ยวและ สายตรงข้าม เข้าไปใน mRNA ของ par-1 ในCaenorhabditis elegansทำให้เกิดการย่อยสลายของข้อความ par-1 ^{[ 198 ]}เดิมทีคิดว่าการย่อยสลายนี้ถูกกระตุ้นโดย RNA สายเดี่ยว (ssRNA) แต่สองปีต่อมา ในปี 1998 Fire และ Mello ค้นพบว่าความสามารถในการปิดกั้นการแสดงออกของยีน par-1 นี้ถูกกระตุ้นโดย RNA สายคู่ (dsRNA) จริงๆ^{[ 198 ]} บทความ Natureปี 1998 ของCraig C. MelloและAndrew Fireรายงานผลการปิดกั้นยีนที่มีประสิทธิภาพหลังจากฉีด RNA สายคู่เข้าไปในC. elegans ^{[ 199 ]}ในการตรวจสอบการควบคุมการผลิตโปรตีนกล้ามเนื้อ พวกเขาพบว่าการฉีด mRNA หรือantisense RNAไม่มีผลต่อการผลิตโปรตีน แต่ RNA สองสายสามารถปิดการทำงานของยีนเป้าหมายได้สำเร็จ จากผลงานนี้ พวกเขาจึงบัญญัติศัพท์ว่าRNAiการค้นพบนี้ถือเป็นการระบุตัวการที่ก่อให้เกิดปรากฏการณ์นี้เป็นครั้งแรก ไฟร์และเมลโลได้รับรางวัลโนเบลสาขาสรีรวิทยาหรือการแพทย์ประจำ ปี 2006 ^{[ 6 ] [ 200 ]}

หลังจากการค้นพบครั้งสำคัญของ Fire และ Mello ไม่นาน Elbashir และคณะได้ค้นพบว่า การใช้siRNA ที่สร้างขึ้นสังเคราะห์ ทำให้สามารถกำหนดเป้าหมายการปิดการทำงานของลำดับเฉพาะในยีนได้ แทนที่จะปิดการทำงานของยีนทั้งหมด^{[ 201 ]}เพียงหนึ่งปีต่อมา McCaffrey และเพื่อนร่วมงานได้แสดงให้เห็นว่าการปิดการทำงานแบบเฉพาะลำดับนี้มีประโยชน์ในการรักษา โดยการกำหนดเป้าหมายลำดับจาก ไวรัสโรค ตับอักเสบซีในหนูทดลอง^{[ 202 ]}ตั้งแต่นั้นมา นักวิจัยหลายคนได้พยายามขยายการประยุกต์ใช้ RNAi ในการรักษา โดยเฉพาะอย่างยิ่งการกำหนดเป้าหมายยีนที่ก่อให้เกิดมะเร็ง ชนิดต่างๆ ^{[ 203 ] [ 204 ]}ในปี 2006 การประยุกต์ใช้ครั้งแรกที่เข้าสู่การทดลองทางคลินิกคือการรักษาโรคจอประสาทตาเสื่อมและไวรัสทางเดินหายใจซิงไซเชียล [ 205 ^{]สี่ปี}ต่อมา การทดลองทางคลินิกเฟส 1 ในมนุษย์ครั้งแรกได้เริ่มต้นขึ้น โดยใช้ระบบนำส่งอนุภาคนาโนเพื่อกำหนดเป้าหมายเนื้องอกแข็ง^{[ 206 ]}

องค์การอาหารและยา (FDA) อนุมัติยาตัวแรกที่ใช้ siRNA ( patisiran ) ในปี 2018 ต่อมาGivosiranและLumasiran ได้รับการอนุมัติจาก FDA สำหรับการรักษา AHP และ PH1 ในปี 2019 และ 2020 ตามลำดับ ^{[ 112 ]} Inclisiranได้รับการอนุมัติจาก EMA ในปี 2020 สำหรับการรักษาคอเลสเตอรอลสูง และขณะนี้อยู่ระหว่างการพิจารณาของ FDA ^{[ 207 ]}

• การแทรกแซงอาร์เอ็นเอที่ควบคุมโดยดีเอ็นเอ

วิกิมีเดียคอมมอน ส์มีสื่อที่เกี่ยวข้องกับการแทรกแซงอาร์เอ็นเอ

เว็บไซต์ Wikiversity มีแหล่งข้อมูลการเรียนรู้เกี่ยวกับการแทรกแซงของอาร์เอ็นเอ (RNA interference)

• ภาพรวมของกระบวนการ RNAiจาก เว็บไซต์ The Naked Scientists ของมหาวิทยาลัยเคมบริดจ์
• ภาพเคลื่อนไหวแสดงกระบวนการ RNAiจากวารสาร Nature
• NOVA scienceNOW อธิบายเกี่ยวกับ RNAi  – วิดีโอความยาว 15 นาทีจาก รายการ Novaที่ออกอากาศทางPBSเมื่อวันที่ 26 กรกฎาคม 2548
• Silencing Genomes เก็บถาวรเมื่อวันที่ 10 สิงหาคม 2019 ที่Wayback Machineการทดลองการแทรกแซง RNA (RNAi) และชีวสารสนเทศใน C. elegans เพื่อการศึกษา จากศูนย์การเรียนรู้ DNA โดลัน แห่งห้องปฏิบัติการโคลด์สปริงฮาร์เบอร์
• การคัดกรอง RNAi ใน C. elegans ในรูปแบบของเหลว 96 หลุม และการประยุกต์ใช้ในการระบุปฏิสัมพันธ์ทางพันธุกรรมอย่างเป็นระบบ (โปรโตคอล)
• นักวิทยาศาสตร์ชาวอเมริกัน 2 คน ผู้เชี่ยวชาญด้าน "หนอน" คว้ารางวัลโนเบลจากงานวิจัยเกี่ยวกับ RNA (จากหนังสือพิมพ์นิวยอร์กไทมส์)
• เว็บไซต์ Molecular Therapyนำเสนอหัวข้อ "การพัฒนา RNAi ในฐานะกลยุทธ์การรักษา"ซึ่งรวบรวมบทความฟรีเกี่ยวกับ RNAi ในฐานะกลยุทธ์การรักษา
• GenomeRNAi : ฐานข้อมูลฟีโนไทป์จากการทดลองคัดกรองการแทรกแซง RNA ในแมลงหวี่ Drosophila melanogaster และมนุษย์ Homo sapiens
• เครื่องมือ RNAi เก็บถาวรเมื่อวันที่ 19 มิถุนายน 2018 ที่Wayback Machineเครื่องมือการแทรกแซง RNA ที่ออกแบบไว้ล่วงหน้าและแบบกำหนดเอง